Kromatografi adalah istilah

umum untuk berbagai cara

pemisahanberdasarkan partisi
cuplikan antara fase yang bergerak
dapat berupa gas atau zat cair dan
fase diam dapat berupa zat cair
atau zat padat.
 T. Swett tahun 1903 dianggap
sebagai penemu kromatografi, yang
menguraikan karyanya mengenai
pemakaian kolom kapur untuk
memisahkan pigmen dalam daun.

Pada tahun yang sama D. T. Day

memakai kromatografi untuk
memisahkan berbagai fraksi minyak
bumi, tetapi T. Swett lah yang
pertama kali mengenali dan
menafsirkan proses tersebut.
Kata kromatografi
mengandung
makna warna namun tak ada
hubungannya langsung,
kecuali senyawa pertama
yang dipisahkan dengan cara
ini adalah pigmen hijau daun
• Menurut IUPAC (The International Union of
Pure and Applied Chemistry)
• mendefenisikan kromatografi sebagai :
suatu metode yang terutama digunakan
untuk pemisahan komponen cuplikan yang
komponen-komponennya terdistribusi
diantara dua fase, salah satunya stasioner
(diam) yang lainnya fase bergerak. Fase
diam dapat padat atau cair disangga pada
zat padat atau gel. Fase diam dapat
dikemas dalam kolom, disebar sebagai
lapisan atau terdistribusi sebagai film
(lapis tipis) dan lain-lain.
• Fase gerak dapat dalam bentuk gas atau
cairan.
• (Sewell clark, 1991. Chromatographic
Separatious.)
 Kromatografi adalah :Prosedur pemisahan
zat terlarut oleh suatu proses migrasi
diferensial dinamis dalam sistem yang
terdiri atas dua fase atau lebih ,salah satu
diantaranya bergerak secara
berkesinambungan dengan arah tertentu
dan didalamnya zat-zat itu menunjukkan
perbedaan mobilitas disebabkan adanya
perbedaan adsorpsi ,partisi ,
kelarutan,tekanan uap ,ukuran molekul atau
kerapatan muatan ion ,dengan demikian
masing-masing zat dapat diidentifikasi atau
ditetapkan dengan metode analitik
 Kromatografi

Kromatografi Kromatografi
Gas Cair

Pertukaran Eksklusi Kromatografi Penjerapan

Gas Cair Gas Padat Ion Cair Padat
Partisi
 Kita melakukan kromatografi pada
hakekatnya untuk menjawab 3 pertanyaan
:
 Senyawa apa yang ada (kualitatif).
 Berapa banyaknya (kuantitatif )
 Bagaimana kita memperoleh komponen
yang murni
• Senyawa apa yang ada :
Pemakaian kromatografi secara
kualitatif mengungkapkan ada atau
tidak adanya senyawa tertentu dalam
cuplikan.
Pada KLT (Kromatografi Lapis Tipis)
dan KKt (Kromatografi Kertas) ini
biasanya dilakukan dengan
membandingkannya dengan senyawa
murni.
• Kromatografi kualitatif memberi
informasi mengenai kerumitan suatu
campuran.

Pada KLT dan KKt jumlah bercak

menunjukkan jumlah minimum
komponen.

Kromatografi kualitatif sering dipakai

untuk menetapkan pola sidik jari jenis
campuran yang rumit komponennya
misalnya ekstrak jaringan urin,darah.
 Kromatografi kuantitatif menunjukkan
banyaknya masing-masing komponen
campuran dengan memakai pembanding
baku.
 Pada KLT kalau dipakai ketepatannya
sangat kurang. Biasanya dibantu dengan
alat densitometri atau spektrofotometri
ultra violet
 Kromatografi preparatif dipakai untuk
memperoleh komponen campuran dalam
jumlah yang memadai dalam keadaan
murni.
• Kromatografi Lapis Tipis
• a. Defenisi dan prinsip KLT
• Kromatografi lapis tipis ialah metode pemisahan
terdiri atas bahan berbutir-butir (fase diam)
ditempatkan pada penyangga berupa plat gelas
logam atau lapisan yang cocok. Campuran yang
akan dipisah berupa larutan, ditotolkan berupa
bercak atau pita (titik awal). Setelah plat atau lapisan
ditaruh dalam bejana ditutup rapat yang berisi
larutan pengembang yang cocok (fase gerak),
pemisahan terjadi selama perambatan kapiler
(pengembangan). Selanjutnya, senyawa yang tidak
berwarna harus ditampakkan (dideteksi).
1.Penjerap
yang umum dipakai adalah :
• Silika gel
• Aluminium oksida
• Poliamida
• Kieselguhr
• Selulosa
• Turunan selulosa
• Bahan standard yang umum dipakai adalah
silika gel G Merck atau silika gel GF 254.
2.Plat kaca atau aluminium atau gelas
objek tempat membuat lapisan

biasanya ukurannya :
 200 mm x 200 mm
 200 mm x 100 mm
 Terlebih dahulu dicuci dengan deterjen,
kemudian diolesi dengan etanol. Tebal
lapisan yang dipakai 0,1 – 0,3 mm.
Cara 1. Cara 2
 1.Silika gel G atau GF 254  2.Silika gel
sebanyak 30 gram
dimasukkan ke dalam mortir dikocok
porselin kering yang tidak dengan air
berserat. Tambahkan 40 ml dalam labu
air suling diaduk perlahan-
lahan dengan stamfer sampai bermulut
didapat suspensi seragam lebar dimana
tanpa terjadi gelembung
udara ataupun gumpalan. waktu
Selanjutnya, ditambahkan 20 pengocokan
ml air suling sambil diaduk tidak boleh
perlahan-lahan dengan
jangka waktu untuk lebih dari 90
memperoleh suspensi tidak detik.
boleh lebih dari 90 detik.
 Cara 1 Cara 2 Cara 3

•Dengan cara •Dengan cara celup •Dengan cara tuang

menyaputkan
•Celupkan dua kaca •Cara ini biasanya
•Bubur silika gel objek yang dipakai pada plat
dituangkan dipegang yang besar.
kedalam alat berdempetan ke •Kaca yang sudah
penyaput diatas dalam lumpuran dibersihkan
kaca yang sudah (bubur siliks gel) disekelilingnya
disusun .kemudian •Tarik perlahan- dilekatkan selotip
disaputkan lahan dan biarkan setebal lapisan yang
seragam dengan lumpuran yang diinginkan.
satu gerakan yang berlebih mengalir •Lumpuran di tuang
lancar. pada sisi wadah. kan kebahagian te
•Pisahkan kaca objek ngah plat dibiarkan
dan bersihkan menyebar dan di
penjerap yang rata kan dengan
terdapat pada batang pengaduk
semua tepinya, atau digoyang sp
biarkan plat permukaan rata
mengering selama ,biarkan sampai
5-20 menit. kering
 Plat-plat yang sudah dilapisi diaktifkan
didalam oven pada temperatur 110°C
selama 30 menit.
 Jika dipakai air maka waktu pengaktifannya
selama 1 jam.
 Selain air dapat juga dipakai medium
untuk lumpuran ialah : untuk penjerap
silika gel G, dipakai metilena klorida
metanol (2 : 1) (v/v) dengan perbandingan
35 gram dalam 100 ml
• Fase gerak ialah medium angkut dan
terdiri atas satu atau beberapa pelarut.
Ia bergerak didalam satu fase diam, yaitu
suatu lapisan berpori karena gaya
kapiler.
• Yang digunakan hanya pelarut bertingkat
mutu analitik dan bila diperlukan diguna
kan sistem pelarut multi komponen, ini
harus berupa suatu angka banding
campuran yang dinyatakan dalam bagian
volume sedemikian rupa, sehingga
volume tetap 100.
• Misalnya : benzen – kloroform - asam
asetat 96% (50 : 40 : 10).

• Pd kromatografi penjerapan pelarut

pengembang dapat dikelompokkan
kedalam deret eluotropik berdasarkan
efek elusinya. Seperti ditunjukkan da
lam tabel di bawah ini, efek elusi naik
dengan kenaikkan kepolaran pelarut.
• Misalnya:heksana non polar mem
punyai efek elusi lemah. Kloroform
cukup kuat dan metanol yang polar
efek elusinya kuat
 Pelarut td°C/760 Tetapan dielektrik ε Viskositas Cp pada
Pengembnag torr pada 20°C 20°C
n-Heksan 68,7 1,890 0,326
Heptana 98,4 1,924 0,409
Sikloheksana 81,4 2,023 1,02
Karbontetraklo 76,8 2,238 0,969
rida
Benzena 80,1 2,284 0,652
Kloroform 61,3 4,806 0,580
Eter (dietileter) 34,6 4,34 0,233
Etil asetat 77,1 6,02+ 0,455
Piridina 115,1 12,3+ 0,974
Aseton 56,5 20,7+ 0,316+
Etanol 78,5 24,30+ 1,2
Metanol 64,6 33,62 0,597
Air 100,0 80,37 1,005
• KLT dapat dilakukan dalam
bejana atau wadah apa saja
yang dapat ditutup rapat.
Bejana standard adalah
yang dapat menampung plat
200 x 200 mm dan harus
tertutup rapat.
• Penjenuhan bejana
dapat dilakukan dengan
secarik kertas saring bersih
yang ditaruh dalam dinding
sebelah dalam bejana
berbentuk U dan dibasahi
dengan pelarut pengembang
diisi pada bagian bawah
bejana
• Cuplikan untuk kromatografi ditotolkan
dalam bentuk noda atau bercak, untuk
tujuan kualitatif sedangkan bentuk pita
untuk preparatif.
• Bercak ditotolkan pada jarak 15 mm dari
tepi bawah lapisan.
• Jarak suatu bercak awal berukuran 3-5 mm
ke bercak awal lainnya.
• Larutan tidak boleh rusak selama penotolan
cuplikan ditotolkan dengan memakai
mikropipet kemudian dibiarkan mengering
 Plat sesudah ditotolkan cuplikan dan sudah
kering dimasukkan kedalam bejana
pengembang yang sudah dijenuhkan,
dibiarkan larutan pengembang sampai ke
garis depan (garis batas
pengembanganyang sudah ditandai,
kemudian dikeluarkan dan dibiarkan hingga
kering).
• Pengembangan sederhana, yaitu
perambatan satu kali kearah atas
atau ke bawah sepanjang 10 cm
lebih atau kurang.
• Pengembangan ganda, yaitu
perambatan dua kali sampai
mencapai garis batas
pengembangan dengan memakai
pelarut pengembang yang sama.
Biasanya digunakan untuk
memperbaiki efek pemisahan.
 Pengembangan landaian, yaitu peram
batan dua kali sampai garis batas
pengembangan dengan memakai daya
elusi yang berlainan digunakan untuk
pengembangan dengan jarak yang
berbeda, misalnya untuk jarak 5 cm
pada pengembangan pertama digu
nakan pelarut pengembang polar yang
kuat dan untuk jarak 10 cm pada
pengembangan kedua digunakan
pelarut pengembang yang kepolaran
nya lebih lemah
• Pengembangan dua arah yaitu
perambatan dua kali dengan arah
yang berbeda, dimana dipakai
pengembang dengan dua daya
elusi yang berbeda karena
mempunyai kepolaran yang
berbeda.
• pengembang pertama harus lebih
non polar dari pengembang yang
kedua atau kebalikannya. Cara ini
biasanya dipakai untuk menguji
kemurnian isolat hasil isolasi.
• Pengembangan lingkar yaitu
perambatan dari titik pusat
ke arah tepi lingkaran yang
dilakukan terhadap plat lapis
tipis yang berbentuk bulat.
Misalnya, terdapat pada
kromatografi datar sentrifuga
(cromatotron).
 1.Dengan radiasi uv gelombang
pendek 254 nm atau gelombang
panjang 365 nm. Untuk panjang
gelombang 254 nm akan terlihat
senyawa yang berfluorosensi.
Untuk panjang gelombang 365
nm merupakan peredaman atau
pemedaman fluorosensi.
 2.Deteksi dengan pereaksi semprot.
Penting diingat bahwa pereaksi
warna harus mencapai pelat KLT
dalam bentuk tetesan yang sangat
halus sebagai aerosol dan bukan
sebagai semprotan kasar. Biasanya
hal ini dicapai bila digunakan
penyemprot pompa bola. Semprotan
yang baik bila digunakan dengan
udara tekan (saluran udara tekan),
compressor kecil atau tabung gas
nitrogen yang berkatup kecil.
Semprotan pertama harus diarahkan
kesamping plat KLT untuk mengecek
semburan aerosol yang halus.
 Pereaksi yang dipakai untuk larutan
pendeteksi (penyemprot) yaitu pere
aksi yang bersifat universal yaitu
asam sulfat pekat 50%, 10% dalam
metanol.
 Pereaksi penyemprot yang lain yaitu
penampak bercak untuk senyawa
yang khas, misalnya ;
 untuk alkaloida pereaksi Dragendorf.
untuk steroid/triterpen
pereaksi Liebermann-Burchard
 Lemari semprot

 Pemanasan
Pembentukan warna yang optimum
sering kali memerlukan peningkatan
suhu dan waktu yang tertentu untuk
pemanas dapat digunakan :
“Pemanas listrik yang terbaik yang
penyebaran suhunya seragam dan
dilengkapi thermostat. Dapat juga
digunakan oven laboratorium
• Jarak pengembangan senyawa pada kromatogram biasanya
dinyatakan dengan angka Rf.

• Rf = jarak titik pusat bercak dari titik awal

• Jarak garis depan dari titik awal
•
• Jarak garis depan dari titik awal disebut juga garis batas
pengembangan.
• Angka harga Rf berjarak antara 0,00 – 1,00 dan hanya
• ditentukan dua desimal. Harga Rf ialah angka Rf
• dikalikan faktor 100 (h) menghasilkan nilai berjarak
• 0 – 100. Angka Rf pada KLT mempunyai kelemahan karena
sering tidak terulangkan walaupun sejumlah besar
• harga Rf telah dilaporkan dalam pustaka, harga itu
• dapat dianggap sahih/benar jika dibandingkan dengan
• bahan lain dalam situasi yang sama atau jika
• dibandingkan dengan pembanding baku atau senyawa
• yang diketahui
gbp

8
Harga rf noda merah violet =
8 /10 = 0,8

10

tap
 Penjerap yang tidak sama karena
dihasilkan dari berbagai merek
dagang

 Suhu yang berbeda.

 Kejenuhan chamber yang tidak sama.

 Konsentrasi cuplikan yang ditotolkan

tidak sama
– Gunakan lapisan niaga baku dari merek yang
sama.

– Jika memakai buatan sendiri, lapisan dibuat dan

diaktifkan dengan cara yang sama.

– Harus ada jangka waktu baku minimum antara

pengambilan lapisan dari lingkungan kering dan
pengembangan.

– Cuplikan harus ditotolkan dalam jumlah yang

sama.

– Chamber harus jenuh sempurna.

– Kromatogram harus dikembangkan
sampai jarak baku (garis batas
pengembangan) dan harus
dikembanglewatkan yaitu pada tinggi
yang ditentukan min 10 cm. Setelah
sampai pada garis batas pengembangan
lapisan dibiarkan didalam bejana selama
10 menit sehingga pelarut tersebar
seragam sepanjang jalur kromatogram.
Yang dilaporkan adalah hasil rata-rata
tiga kali percobaan atau lebih.
gbp

ta
Bangan alir pemeakaian KLT untuk tujuan kwantitatif
(berapa banyak yang ada )
gbp Garis bgn
yang
disemprot

tap
 gbp

Noda
Noda baku bahan
dan noda baku/
isolat isolat
dengan murni
berbagai
konsentrasi

tap
 
GBP2
TA = titik awal penotolan
GBP1
GBP 1= garis batas
pengembangan 1

1 GBP 2 = garis batas

pengembangan 2

1 = arah pengembangan 1
TA 2 = arah pengembangan 2

Kromatogram KLT 2 Arah Keterangan

Soal 1:
Buatlah bagan alir cara mengisolasi
senyawa kimia dalam ekstrk tumbuhan
sampai diperoleh isolat murni dengan
kromatografi lapis tipis
• Kromatografi kolom adalah kromatografi yang
dilakukan dalam kolom, kolom dapat berupa
tabung kaca, tabung logam, bahkan tabung
plastik.
• Campuran yang akan dipisahkan diletakkan
berupa pita pada bagian atas kolom yang berisi
penjerap.
• Pelarut atau fase gerak dibiarkan mengalir
melalui kolom karena aliran yang disebabkan
oleh gaya berat atau didorong dengan tekanan,
pompa hisap dan gravitasi. Pita senyawa linarut
bergerak melalui kolom dengan laju yang
berbeda, memisah, dan dikumpulkan berupa
fraksi ketika keluar dari kolom.
• Silika gel
• Alumina
• Arang
• Selulosa
• Poliamida
• Polistiren

• Ukuran kolom
• Ukuran kolom sangat beragam tetapi biasanya
panjangnya sekurang-kurangnya 10 kali garis
tengah dalamnya dan mungkin juga sampai 100
kalinya
Kromatografi Kolom Cair Padat Klasik
(Kromatografi Kolom Gravitasi gaya tarik
bumi)

Penjerap yang dipakai,

ukuran partikel penjerap yang dipakai
biasanya lebih besar dari ukuran partikel
pada KLT
 Berdasarkan penelusuran pustaka.

 Menerapkan data dari pengembang yang

terbaik pada KLT.

 Pemakaian elusi landaian

• 1. Cara Basah
• Selapis pasir dimasukkan kedalam kolom,
bias juga dipakai kapas atau gelas wool.
• Tabung diisi 2/3 nya dengan pelarut. Pelarut
yang dipakai pada proses pengemasan
mungkin sama dengan yang dipakai untuk
kromatografi dan bisa juga pelarut dengan
kepolaran yang lebih rendah.
• Penjerap dibuat lumpuran pada wadah lain.
• Lumpuran dituangkan kedalam kolom sedikit
demi sedikit dan dibiarkan memadat.
• Selama proses pengendapan tabung
dapat diketuk-ketuk pada semua sisi
secara perlahan-lahan agar diperoleh
lapisan yang seragam.
• Jika pelarut yang dipakai berbeda
dengan pelarut untuk kromatografi
pelarut lumpuran harus didesak keluar
dengan pelarut pengelusi sebelum
cuplikan ditambahkan.
• Selanjutnya kolom dibiarkan atau
dikondisikan paling sedikit selama satu
jam dan paling lama 24 jam
• Cara Kering
• Selapis pasir diletakkan pada bagian
dasar kolom bias juga kapas atau glass
wool.
• Penjerap dituangkan kedalam kolom
sedikit demi sedikit.
• Setiap penambahan permukaan
diratakan dan dimampatkan sampai
2/3 bagian dari kolom.
• Setelah semua penjerap dimasukkan,
diatasnya diletakkan kertas saring dan
ditambahkan lagi selapis pasir sehingga
jika ditambahkan pelarut, permukaan
penjerap tidak terganggu.
• Kemudian pelarut pengelusi dibiarkan
mengalir kebawah melalui penjerap
dengan keran terbuka sampai
permukaan pelarut tepat sedikit diatas
bagian atas kolom.
• Selama proses pengendapan tabung
dapat diketuk-ketuk pada semua sisi
secara perlahan-lahan agar diperoleh
lapisan yang seragam.
• Selanjutnya kolom dibiarkan atau
dikondisikan paling sedikit selama 1
jam atau paling lama 24 jam, sesudah
itu kolom baru dapat dipakai
• Dalam keadaan biasa, linarut dilarutkan ke
dalam sedikit pelarut (terjadi larutan 5% atau
lebih), ditambahkan ke bagian atas kolom dan
dibiarkan mengalir ke bagian atas penjerap
ditambahkan lagi pelarut dan kromatogram
dikembangkan atau dilakukan pengelusian.

• Dalam kondisi ideal, linarut mudah larut

didalam pelarut yang akan dipakai sebagai
pengelusi. Jika tidak mudah larut didalam
pelarut pengelusi linarut dapat dilarutkan
dalam pelarut yang kurang polar.
• Jika linarut tidak begitu larut didalam
pelarut pengelusi atau pelarut yang
kurang polar, seperti yang dijumpai
pada campuran yang rumit, maka
linarut dapat dicampur dengan desikit
penjerap yang kemudian diletakkan
pada bagian atas kolom.
• Proses ini dapat dikerjakan dengan cara
sebagai berikut :
– Larutkan linarut didalam pelarut yang cocok,
sebaiknya pelarut yang agak mudah menguap.
– Tambahkan larutan linarut ke dalam cairan
penguap yang sudah berisi serbuk penjerap (5-10
kali linarut) aduk sampai homogen.
– Letakkan cawan diatas penangas air untuk
menguapkan pelarut.
– Jika pelarut telah hilang, serbuk penjerap yang
mengandung linarut dapat ditambahkan kebagian
atas kolom dan diratakan.
• Dalam hal ini tidak usah menambahkan kertas
• saring
• Mengelusi harus secepat-cepatnya untuk meminimumkan
difusi sepanjang terdapat kesetimbangan yang baik
antara pelarut, linarut, dan penjerap. Kesetimbangan
yang baik memerlukan penjerap yang ukuran partikelnya
kecil. Sebaiknya jika ukuran partikel sangat kecil berarti
pelarut tidak megalir melalui penjerap dengan cepat.

• Untuk kolom gaya tarik bumi (gravity), memakai

penjerap berukuran 60-230 mesh 63-250 nm. Umumnya
laju aliran sekitar 10-20 ml/cm2, penampang kolom/jam.

• Ukuran partikel yang lebih kecil dari 200 mesh

• diperuntukkan semacam pemompaan atau systim
• penekaan harus diperhatikan agar pelarut yang dipakai
sedapat mungkin murni, karena itu bila memakai pelarut
kualitas teknis harus disuling terlebih dahulu, sebaiknya
dipakai pelarut dengan kualitas pa.
• 1. Pengelusian landaian
• Sistem landaian bertahap tradisional dapat dilihat pada
pelarut berdasarkan deret eluotropi dimulai dari pelaru
yang nonpolar sampai ke pelarut polar.
• Sistem landaian yang lainnya yaitu dengan
mengkombinasi dua pelarut yang berbeda
kepolarannya.
• Contoh :
• n-heksana 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10
• etil asetat 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 90 80 70 …..…0
• metanol 0 10 20 30 …..100

• Pengelusian landaian dilakukan untuk mendapatkan

fraksi-fraksi yang terdiri dari senyawa berdasarkan
kepolarannya.
• Pada pengelusian isokratik, dipakai pelarut
atau campuran pelarut yang sama untuk
keseluruhan pengelusiannya.
• Cara ini dilakukan untuk memperoleh isolat
yang murni
• Salah satu masalah kromatografi kolom yang selalu muncul ialah
pemantauan pelarut ketika keluar dari kolom, untuk mengetahui
kapan linarut keluar.
• Secara umum dilakukan dengan 2 cara :

• 1.Berdasarkan warnanya, jadi ditampung kedalam vial dengan

volume yang sama kemudian dilihat warnanya. Untuk warna
yang sama digabung. Selanjutnya di KLT, untuk kromatogram
yang sama digabung lagi.

• 2.Ditampung kedalam vial dengan volume yang sama, selanjutnya

masing-masing di KLT dan dilihat kromatogramnya. Apabila hanya
terdapat satu noda isolat dianggap sudah murni.
• Isolat yang sudah murni diuji kemurniannya dengan memakai metode
KLT dua arah.
•
• Pertanyaan : buatlah bagan alir bagaimana cara mengisolasi
senyawa murni (isolat murni) dari ekstrak tumbuhan dengan
mempergunakan perlengkapan alat untuk KLT dan Kromatografi Kolom
• Salah satu masalah kromatografi kolom
yang selalu muncul ialah pemantauan
pelarut ketika keluar dari kolom, untuk
mengetahui kapan linarut keluar.
• Secara umum dilakukan dengan 2 cara :
1.Berdasarkan warnanya, • 2.Ditampung kedalam
jadi ditampung kedalam vial dengan volume yang
vial dengan volume yang sama, selanjutnya
masing-masing di KLT
sama kemudian dilihat
dan dilihat
warnanya. Untuk warna kromatogramnya.
Yang sama digabung. Apabila hanya terdapat
Selanjutnya di KLT, untuk satu noda isolat
kromatogram yang sama dianggap sudah murni.
digabung lagi. • Isolat yang sudah murni
diuji kemurniannya
dengan memakai
metode KLT dua arah.
Soal 2:
Buatlah bagan alir cara mengisolasi
senyawa kimia dari ekstrak tumbuhan
sampai diperoleh isolat murni dengan
Menggunakan KLT ( kromatografi Lapis
Tipis ) dan KK (kromatografi kolom )
• Kromatografi Kolom Khusus terbagi atas 2 macam,
yaitu :
• 1. Kromatografi Cair vakum
• Kromatografi cair vakum adalah kromatografi kolom
dikemas kering, dipakai pelarut landaian dan untuk
meningkatkan laju aliran fase gerak yang
menggunakan pompa vakum tekanan rendah.
• Dipublikasikan pada tahun 1977 yang menguraikan
isolasi diterpena sembronoid dari terumbu karang
yang lunak Australia.
• Kolom yang dipakai adalah corong Buchner kaca
maser atau corong pendek.
• Fase diam yang dipakai adalah silika gel 60 (63-
200nm)
•
• Kolom dikemas secara kering yaitu
• kolom diisi dengan silika gel 60,
• vakum dipasang sehingga diperoleh
kerapatan kemasan maksimum, lalu vakum
dihentikan.
• Pelarut yang kepolarannya rendah
dituangkan kepermukaan penjerap lalu
divakumkan lagi.
• Kolom dihisap sampai kering dan langsung
bisa digunakan
• Cara menambahkan cuplikan atau sampel
• Cuplikan dilarutkan dalam pelarut yang cocok,
dimasukkan langsung pada bagian atas kolom, diratakan,
dan kalau perlu dihisap perlahan-lahan untuk
meratakannya.
• Cara mengelusi
• Kolom dielusi dengan campuran pelarut yang cocok,
mulai dengan pelarut yang kepolarannya rendah (non
polar-polar) jadi dipakai pelarut sistem landaian.
• Kolom dihisap sampai kering pada setiap pengumpulan
fraksi. Oleh karena itu, kromatografi cair vakum
menggunakan tekanan rendah untuk meningkatkan laju
aliran fase gerak. Selanjutnya, fraksi-fraksi yang
diperoleh di KLT.
• Kelemahan :
• Setelah dipantau dengan KLT selalu terdapat pola
kromatogram yang sama, tapi hal ini bisa diatasi dengan
menggabungkannya.
• Kelebihan :
• Waktu yang diperoleh sangat singkat
• Tujuan pemakaian Kromatografi Cair Vakum
• Untuk mendapatkan fraksi-fraksi berdasarkan
kepolarannya.

• Sebagai catatan
• Ada beberapa penelitian yang ternyata dengan
KCV dapat memperoleh senyawa murni antara
lain :
• Misalnya alkaloid dari Aconium culumbianum
(Ranunculaceae) di KCV dengan memakai
aluminium oksida 60-65 gram (asam basa, mutu
KLT, Merck). Elusi dengan toluen-kloroform (1:1)
menghasilkan talati zamina 265 mg dan elusi
dengan kloroform-metanol (19:1) menghasilkan
kamakonina 247 mg.
Soal 3: buat bagan alir cara
mengisolasisenyawa kimia dari ekstrak
tumbuhan sampai diperoleh isolat murni
dengan menggunakan :
KLT ( kromatografi lapis tipis )
KK ( Kromatografi Kolom) dan
KCV ( kromatografi cair vakum )
• Cara ini memerlukan pengisian kolom
kromatografi dengan bahan kemasan
kering.
• Cuplikan ditambahkan sebagai pelarut
pekat atau setelah dikeringkan
bersama sedikit penjerap dan
kemudian pengelusi dibiarkan
bergerak melalui kolom kebawah
karena gaya kapiler sampai garis
depan pengelusi hampir mencapai
bagian atas kolom.
• Aliran pengelusi dihentikan dan pita
dalam kolom diambil dengan cara
mendorong keluar kolom, mengiris
atau mencongkel keluar, kemudian
diekstraksi dengan pelarut yang
cocok.
• Salah satu cara untuk mempermudah
pengambilan penjerap dari kolom kromatografi
setelah pengembangan ialah memakai kolom
plastik.
• Kolom atau tabung dapat dipotong-potong
dengan pisau tajam menjadi bagian-bagian
yang sesuai dengan pita, pita yang terpisah,
kemudian senyawanya diekstraksi dan disaring.
• Keuntungan lain dari kolom nilon adalah pita
yang tidak berwarna dapat diamati dengan
lampu UV untuk memandu kolom
• Kromatografi Lapis Tipis Sentrifufal
• contoh : chromatotron.
• Perbedaan besar antara chromatotron dan
radas KLT sentrifugal sebelumnya ialah
bahwa rotornya miring tidak mendatar.
Jantung radas ini ialah plat kaca bundar
bergaris tengah 24 cm yang dilapisi dengan
penjerap yang cocok sehingga terbentuk
lapisan tipis untuk pemisahan preparatif.
•
• Pembuatan lapisan tipis dilakukan
sebagai berikut : suspensi penjerap
dalam air, mengandung pengikat,
dituangkan ke plat dan dibiarkan
menyebar membentuk lapisan yang
nisbi seragam. Untuk mencegah
penjerap keluar dari plat dipasang
selotape yang dipasang disekeliling
plat.
•
• Jika penjerap yang tidak rata sudah
kering, permukaan diratakan dengan
pengerok yang ditancapkan dipusat plat,
sampai diperoleh lapisan dengan tebal
yang dikehendaki (1,2 atau 4 mm).
• Pada bagian tengah plat dibiarkan tidak
berlapis penjerap yang berguna untuk
memasukkan pengelusi. Untuk plat silika
gel GF 254 mutu KLT, kalsium
hemihidrat dan air (Hostettmann dkk.
1980). Jika penjerap harus melekat lebih
kuat pada plat, harus menambahkan
lagi pengikat.
•
• Kemudian plat yang sudah dibuat
itu dipasang pada poros motor
listrik dan diputar pada 800 rpm.
Pelarut pengelusi dimasukkan ke
bagian tengah plat yang tidak
dilapisi penjerap melalui pompa
torak yang mampu mengalirkan 1-
10 ml per menit dan merambat
melalui lapis tipis karena gaya
sentrifugal. Dengan demikian rotor
dicuci selama beberapa menit
untuk menghilangkan pencemar
yang terdapat dalam penjerap.
 Setelah tahap ini ada dua
pilihan yang dapat dilakukan :
memasukkan cuplikan secara
langsung atau mengeringkan
plat dahulu sebelum
memasukkan cuplikan.
Kemudian mengelusi
dilanjutkan dengan pelarut yang
susunannya tetap atau dengan
cara landaian bertahap dengan
laju sekitar 3-6 ml per menit
• Rotor terdapat dalam ruang yang tertutup
dengan plat kaca kuarsa. Penutup ini
memungkinkan kita mengamati bercak
tanwarna tetapi dapat menyerap sinar uv
dengan memakai lampu uv. Gas nitrogen
dialirkan ke dalam ruang plat untuk
mencegah pengembunan pelarut pengelusi
dan untuk mencegah oksidasi cuplikan.

• Pemasukan cuplikan, diikuti dengan

pengelusian menghasilkan pita-pita
komponen berupa lingkaran sepusat. Pada
tepi plat pita-pita terputar keluar dan
ditampung dengan tabung. Fraksi eluat yang
diperoleh dianalisis dengan KLT.
•
• Pada umumnya, campuran 50-500 mg
dapat dipisahkan pada lapisan 2 mm
sepanjang Rf pada plat KLT analitik
terletak antara 0,2 dan 0,5 (Hostettmann
dkk. 1980).

• Pada awal pemisahan harus dipakai

sistem pelarut yang kepolarannya lemah
yang kemudian kepolarannya ditingkatkan
perlahan-lahan selama pengelusian.

• Penelitian yang lebih rinci mengenai

parameter yang penting pada pemisahan
memakai KLTS dilakukan oleh Stahl dan
Muller (1982).
•
• Cara kerja sederhana.
• Cepat-pemisahan biasanya selesai dalam 30 menit
• Tidak perlu mengerok pita.
• Pemakaian pelarut tidak boros.
• Rotor yang sudah dilapisi dapat diregenerasi.
• Pencemar yang terekstraksi dari penjerap lebih
sedikit daripada yang terekstraksi pada KLT
preparatif.
• Penotolan cuplikan mudah.
• Dapat dilakukan pengembangan pelandaian
bertahap.
• Kemungkinan oksidasi senyawa yang peka lebih
kecil daripada pada cara KLT preparatif.
• Perolehan kembali senyawa yang dipisahkan lebih
besar daripada KLT preparatif
 Fase diam yang dapat dipilih terbatas.
 Rotor yang sudah dilapisi tidak ada dalam
perdagangan.
 Daya pisah terbatas.
 Cara pendeteksian terbatas.
 Sistem pengumpul mungkin tercemari
 Kromatografi cair tekanan didasarkan pada
kecepatan dan daya pisah .
 Faktor lain yaitu beban ,daya pisah turun
jika beban terlalu besar .Ini disebabkan
beban kolom yang berlebihan yang
disebabkan oleh volume cuplikan yang
berlebihan atau masa cuplikan yang
berlebihan
 Kapasitas beban bergantung pada
perubahan seperti diameter kolom ,panjang
kolom,diameter partikel dan kerapatan
kemasan penjerap.
 a.memperbesar tekanan pada kolom yang
diisi dengan bahan kemas yang berukuran
partikel tertentu memperbesar laju aliran
pengelusi dan mengakibatkan pemisahan
lebih cepat.
 b.kolom yang dielusi dengan pelarut
memakai tekanan dapat diisi dengan bahan
kemas yang lebih halus dengan demikian
menghasilkan daya pisah yang lebih baik .
 Karena ukuran kolom (dan cuplikan )
sangat beragam maka mengelompokan
berbagai cara preparatif
 Kromatografi kilat 2 bar
 KC tekanan rendah 5 bar
 KC tekanan menengah 5-20 bar
 KC tekanan tinggi > 20 bar.
 Konsep kromatografi kilat sangat sederhana
 dan pemisahan preparatif memakai
kromatografi kolom biasa yang dimodifikasi
ini sangat mudah dilakukan,menggunakan
alat gelas yang mudah didapat dan
menggunakan tekanan nitrogen dari tangki
silinder.
 murah,oleh karena itu banyak dipakai para
peneliti .
 Pelopor kromatografi kilat adalah cara
kromatografi yang serupa yang dikenal
dengan kromatografi kolom pendek ( Hunt
dan Rigby 1967 ),

 Rincian kromatografi kilat dipublikasikan

pertama kali tahun 1978 (Still dkk)
dipatenkan 1981 ,sebagai usaha
memperpendek waktu kerja kromatografi
terbuka.
 Waktu elusi yang panjang pada
kromatografi terbuka mempunyai dua
kerugian :

 1.resiko penguraian senyawa yang peka.

 2.pembentukan ekor pada pita.

 Kolom kaca yang panjangnya sesuai
 Mempunyai keran
 Penutup kolom dilengkapi dengan lubang
masukan udara bertekanan dan katup
jarum untuk mengendalikan pasokan udara
bertekanan.
 Dengan cara ini dapat dicapai tekanan
sekitar 1 bar diatas tekanan atmosfer untuk
mengelusi cuplikan.
 Jumlah cuplikan :
 Bergantung pada ukuran kolom ,cuplikan
sebanyak 0,01-10 g dapat dipisahkan hanya
dalam waktu 15 menit

 Jenis penjerap yang dipakai pada

kromatografi kilat.
 Lichroprep Si 60 25-40 µm
 Silika gel 60 63-200µm
 Pengemasan kolom secara kering akan

menghasilkan kemasan yang baik tetapi

memerlukan pelarut yang banyak untuk

membasahinya agar terbasahi sempurna .

 Pengumpulan fraksi dengan manual dalam

 labu 100ml sering dilakukan .

 Kemudian analisis fraksi dilakukan dengan

KLT.