METODE PERHITUNGAN BAKTERI

HELEN ANJELINA SIMANJUNTAK.,S.Si.,M.Si

 PENDAHULUAN
1. Perhitungan secara langsung
2. Perhitungan secara tidak langsung
 Perhitungan Secara Langsung
• perhitungan yang menghitung jumlah total sel
(sel mati dan sel hidup) yang ada pada
sampel.
• Keuntungan metode ini ialah pelaksanaanya
cepat dan tidak memerlukan banyak peralatan
• kelemahannya adalah sel-sel mikroba yang
mati tidak dapat dibedakan dari sel hidup.
Macam-macam Metode Secara
Langsung
• Metode hitungan cawan (Total Plate Count)
• Metode Petroff-Hauser
 TOTAL PLATE COUNT (TPC)
Prinsip
• Menumbuhkan sel M.O yang masih hidup
pada media agar, sehingga M.O akan
berkembangbiak dan membentuk koloni yang
dapat dilihat langsung.
• Dengan metode ini, kita dapat menghitung sel
yang masih hidup.
• Metode ini menggunakan prinsip pengenceran
• Pengenceran sampel denga menggunakan
larutan fisiologis.
• Tujuan pengenceran: menguranngi jumlah
kandungan mikroba dalam sampel sehingga
nantinya dapat diamati dan diketahui jumlah
mikroorganisme secara spesifik sehingga di
dapatkan perhitungan yang tepat.
 Pengenceran
• Larutan sampel sebanyak 10 ml (campuran 1 ml/
1gr sampel dengan 9 ml larutan fisiologis)
• Diambil 1 ml dan di masukkan ke dalam 9 ml
larutan fisiologis sehingga di dapatkan
pengenceran 10-2.
• Diambil 1 ml dari pengenceran 10-2 lalu
dimasukkan kedalam tabung reaksi berisi 9 ml
larutan fisiologis sehingga di dapatkan
pengenceran 10-3, begitu seterusnya sampai di
dapatkan pengenceran yang kita harapkan
• Setelah dilakukan pengenceran, kemudian
dilakukan penanaman pada media lempeng
agar. Setelah diinkubasi, jumlah koloni masing-
masing cawan diamati dan dihitung.
• Koloni merupakan sekumpulam MO yang
memiliki kesamaan sifat, bentuk, susunan,
permukaan dan sebagainya. Sifat-sifat yang
perlu diperhatikan:
• 1. Besar kecilnya koloni
• 2. Bentuk
• 3. Kenaikan permukaan
• 4. Halus kasarnya permukaan
• 5. Wajah permukaan (mengkilap atau suram)
• 6. Warna
• 7. Kepekatan (lendir, keras, kering)
Selanjutnya dilakukan perhitungan jumlah koloni
30-300 koloni.
• Keuntungan metode ini:
• - dapat mengetahui jumlah mikroba yang
dominan
• - dapat mengetahui adanya mikroba jenis lain
yang terdapat di dalam
• Kelemahan:
• - memungkinkan terjadinya koloni yang berasal
lebih dari satu sel mikroba, seperti pada mikroba
berpasangan, rantai atau kelompk sel
• - memungkinkan ada jenis mikroba tertentu yang
tumbuh menyebar diseluruh permukaan media,
sehingga menghalangi mikroba lain
• - kemungkinan adanya jenis mikroba yang tidak
dapat tumbuh karena penggunaan jenis media
agar, suhu, pH, atau kandungan oksigen selama
inkubasi
• - perhitungan dilakukan pada media agar yang
jumlah populasi mikrobanya 30-300 koloni.
• - perhitungan populasi mikroba dapat
dilakukan setelah masa inkubasi yang
umumnya membutuhkan 24 jam atau lebih
Metode Cawan Tuang (Pour Plate)
• Pada metode ini, sejumlah sampel dari hasil
pengenceran sebanyak 1 ml dimasukkan
kedalam cawan petri, kemudian ditambahkan
media yang telah disterilkan sebanyak 15-20
ml.
• Kemudian cawan petri digoyang agar media
dan sampel tercampur rata dan biarkan
memadat
• Hal ini akan menyebarkan sel-sel bakteri tidak
hanya pada permukaan media yang kaya
oksigen, tetapi ada pula yang tumbuh didalam
media yang tidak begitu banyak mengandung
oksigen
• Kelebihan : volume sampel dapat
mencapai 1 ml
• Kekurangan : organisme yang dihitung
jumlahnya harus kuat menghadapi suhu dari
agar. Selain itu, pengamatan perhitungan juga
harus diamati dengan baik-baik, sebab
koloninya dapat tumbuh di dalam medium
juga (aerob dan anaerob)
 Metode Goresan (Spread Plate)
• penanaman bakteri hanya dilakukan di
permukaan bakteri saja
• Teknik ini menguntungkan jika ditinjau dari
sudut ekonomi dan waktu, tetapi memerlukan
keterampilan-keterampilan yang diperoleh
dengan latihan
• Penggoresan yang sempurna akan
menghasilkan koloni yang terpisah
• kelemahan metode ini adalah bakteri-bakteri
anaerob tidak dapat tumbuh, karena goresan
hanya dilakukan di permukaan media saja.
 Hal-hal yang diperlukan dalam
Teknik Goresan
• Gunakan jarum ose yang telah dingin untuk
menggores permukaan lempengan media. Jarum
ose yang masih panas akan mematikan
mikroorganisme sehingga tidak terlihat adanya
pertumbuhan mikroorganisme di bekas goresan.
• Sewaktu menggores, jarum ose dibiarkan
meluncur diatas permukaan lempengan. Media
agar yang luka akan mengganggu pertumbuhan
mikroorganisme, sehingga sulit diperoleh koloni
yang terpisah.
• Jarum ose harus dipijarkan kembali setelah
menggores suatu daerah, hal ini dengan
tujuan mematikan mikroorganisme yang
melekat pada mata jarum ose dan mencegah
kontaminasi pada penggoresan berikutnya.
• Menggunakan tutup cawan petri untuk
melindungi permukaan supaya terhindar dari
kontaminasi.
• Membalikkan lempengan media agar untuk
mencegah air kondensasi jatuh diatas
pemukaan media.
• Kelebihan : perhitungan mudah dilakukan
karena koloni yang dihitung pasti tumbuh di
permukaan (aerob)
• Kelemahan : volume yang digunakan tidak
boleh lebih dari 0,1 ml karena dapat
menyebabkan spreader, sehingga perhitungan
sulit dilakukan.
Jenis-jenis Teknik Penggoresan
 1. Goresan T
• Lempengan dibagi menjadi 3 bagian dengan
huruf T pada bagian luar cawan petri.
• Inokulasikan daerah I sebanyak mungkin
dengan gerakan sinambung.
• Panaskan mata jarum ose dan biarkan dingin
kembali.
• Gores ulang daerah I sebanyak 3-4 kali dan
teruskan penggoresan pada daerah II
• Ulangi prosedur diatas untuk melakukan
penggoresan untuk daerah III
 2. Goresan Kuadran
• teknik ini sama dengan goresan T, hanya
lempengan agar dibagi menjadi 4
 3. Goresan Radian
• Goresan dimulai dari bagian pinggir
lempengan.
• Pijarkan mata jarum ose dan dinginkan
kembali
• Putar lempengan agar 90 derajat dan buat
goresan terputus diatas goresan sebelumnya
 4. Goresan Sinambung
• Ambil satu mata ose
suspense dan goreskan
setengah permukaan
lempengan agar
• Jangan pijarkan ose, putar
lempengan 180 derajat,
gunakan sisi mata ose yang
sama dan gores pada sisa
permukaan lempengan agar.
 Metode Petroff-Hauser
• Perhitungan secara langsung dapat dilakukan
secara mikroskopis yaitu dengan menghitung
jumlah bakteri dalam satuan ini yang sangat
kecil. Alat yang digunakan adalah Petroff-
Hauser Chamber atau Haemocytometer.
Perhitungan Bakteri Secara Tidak
Langsung
 Most Probable Number (MPN)
• Media ini banyak digunakan untuk
menghitung bakteri patogenik dalam jumlah
sedikit yang terdapat di dalam bahan pangan.
• Metoda ini berdasarkan pengenceran
• Metode MPN digunakan medium cair di dalam
tabung reaksi, dimana perhitungan dilakukan
berdasarkan pada jumlah tabung reaksi yang
positif yaitu yang ditumbuhi oleh jasad renik
setelah inkubasi pada suhu dan waktu
tertentu.
 Asumsi dalam Metode MPN
• Bakteri terdistribusi sempurna dalam sampel
• sel bakteri terpisah-pisah secara individual,
tidak dalam bentuk rantai atau kumpulan
(bakteri coliform termasuk E.coli terpisah
sempurna tiap selnya dan tidak membentuk
rantai)
• Media yang dipilih telah sesuai untuk
pertumbuhan bakteri target dalam suhu dan
waktu inkubasi tertentu sehingga minimal
satu sel hidup mampu menghasilkan tabung
positif selama masa inkubasi tersebut.
• Jumlah yang didapatkan menggambarkan
bakteri yang hidup (viable) saja Sel yang
terluka dan tidak mampu menghasilkan
tabung positif tidak akan terdeteksi
 Turbidimetri
• Metode yang cepat untuk menghitung jumlah
bakteri dalam suatu larutan menggunakan
spektrofotometer
• Bakteri menyerap cahaya sebanding dengan
volume total sel (ditentukan oleh ukuran dan
jumlah)
• Sel bakteri dihitung dengan panjang
gelombang 600 nm dan nilai absorbansi yang
muncul kemudian dikonversi untuk
mendapatkan nilai densitas sel bakteri dalam
kultur.
• Selain itu dengan mengamati timbulnya
kekeruhan, atau timbulnya gas di dalam
tabung kecil (durham) yang diletakkan pada
posisi terbalik, yaitu jasad renik pembentukan
gas.