BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 LATAR BELAKANG

Jumlah mikroorganisme yang berada dalam suatu sampel atau bahan

sangat bervariasi, tergantung dari jenis bahan itu sendiri dan kondisi
lingkungannya. Pada individu multiseluler, bila sel-selnya membelah, maka
individunya

bertambah

banyak,

pada

mikroorganisme

uniseluler

pembelahannya bakteri multiplikasi. Bakteri bermultiplikasi secara seksual

dengan cara pembelahan menjadi dua, dua menjadi empat, empat menjadi
delapan, dan seterusnya.

Jumlah mikroorganisme dalam suatu sampel dapat dihitung dengan

menggunakan beberapa metode yaitu analisa secara langsung yaitu dalam hal
ini digunakan ruang hitung (counting chamber). Alat ini biasa digunakan
adalah hoemoeitometer, keuntungannya menggunakan alat ini adalah
pemeriksaan secara cepat dan tidak menggunakan banyak peralatan, namun
kelemahannya tidak dapat dibedakan sel hidup dan sel mati. Sedangkan
analisa secara langsung terdiri atas beberapa cara yaitu metode cawan tuang
dan metode cawan permukaan.

1.2 RUMUSAN MASALAH

Berdasarkan uraian latar belakang masalah di atas, maka rumusan
masalah dalam paper ini adalah sebagai berikut :
1. Apa yang dimaksud dengan uji kuantitatif pada mikroba dan teknik
pengenceran ?
2. Bagaimana pengenceran dan uji kuantitatif dengan metode hitungan
cawan pada sampel ?
3. Bagaimana pengenceran dan uji kuantitatif dengan metode Most
Probable Number pada sampel ?

1.3 TUJUAN
Dari rumusan masalah di atas, maka tujuan penulisan paper ini adalah
sebagai berikut :
1. Mengetahui uji kuantitatif pada mikroba dan teknik pengenceran
2. Mengetahui pengenceran dan uji kuantitatif dengan metode hitungan
cawan pada sampel
3. Mengetahui pengenceran dan uji kuantitatif dengan metode Most
Probable Number pada sampel.

BAB 1I
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Analisa kuantitatif mikroorganisme dan teknik pengenceran

A. Analisa Jumlah Mikroba pada Bahan Pangan berfungsi untuk :

Menentukan jenis dan sumber kontaminan

Evaluasi proses sanitasi, penanganan bahan dasar dan proses

pengolahan

Menentukan kualitas mikrobiologis makanan

Menentukan umur simpan makanan

Menentukan apakah makanan memenuhi syarat

Analisa kuantitatif bertujuan untuk mengetahui berapa jumlah mikroba

yang ada pada bahan pangan.
Contoh : jumlah E coli pada air minum, jumlah bakteri pada susu segar

B. Teknik pengenceran
Bahan pangan yang diperkirakan mengandung lebih dari 300 sel
mikroorganisme per ml, per gram atau per cm (jika dilakukan
pengamatan pada permukaan luar bahan pangan), memerlukan
perlakuan pengenceran sebelum ditumbuhkan pada medium agar di
dalam cawan petri sehingga setelah inkubasi akan terbentuk koloni
pada cawan tersebut dalam jumlah yang dapat dihitung, dimana
jumlah yang terbaik adalah antara 30 sampai 300 koloni. Pengenceran
biasanya dilakukan secara desimal, yaitu 1:10, 1:100, 1:1000 dst.
Pengambilan contoh dilakukan secara aseptik dan pada tiap
pengenceran

dilakukan

pengocokan

kira-kira

25

kali

untuk

memisahkan sel-sel mikroorganisme yang bergabung menjadi satu.

Pengenceran secara desimal memudahkan dalam perhitungan jumlah
koloni sedangkan pengenceran yang bukan secara desimal, misalnya
1:5, 1:25 dst. Jarang dilakukan karena tidak praktis dalam
perhitungannya. Untuk mengetahui jumlah mikroorganisme pada

permukaan luar bahan pangan, misalnya daging sapi, ayam atau ikan,
pengambilan contoh dapat dilakukan menggunakan metode ulas
(swab).
Larutan yang digunakan untuk pengenceran dapat berupa larutan
buffer fosfat, larutan garam fisiologi 0,85% atau larutan ringer. Untuk
bahan pangan yang sukar larut, ke dalam larutan pengencer pertama
dapat ditambahkan pasir putih atau butir-butir gelas. Sebagai contoh
jika contoh yang akan dianalisa adalah tepung/ pati, digunakan satu
sendok pasir ke dalam 90 atau 99 ml larutan pengencer pertama
sehingga sewaktu dikocok pemecahan partikel dari tepung/ pati akan
lebih mudah. Butir-butir gelas dapat digunakan misalnya jika kita
akan menganalisa total mikroorganisme dari telur sehingga bagian
yang bersifat koloid dari telur dapat lebih mudah dipecah.

2.2 Metode hitungan cawan

A. Prinsip
Prinsip dari metode hitungan cawan adalah jika sel mikroorganisme
yang

masih

hidup

ditumbuhkan

pada

medium

Agar

maka

sel

mikroorganisme tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang

dapat dilihat langsung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop.

Metode HC merupakan cara yang paling sensitif untuk menentukan

jumlah mikroorganisme karena:
a. Hanya sel yang masih hidup yang dihitung
b. Beberapa jenis mikroorganisme dapat dihitung sekaligus
c. Dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroorganisme karena
koloni yang terbentuk mungkin berasal dari satu sel mikroorganisme
dengan penampakan pertumbuhan yang spesifik.
Metode HC mempunyai kelemahan-kelemahan, yaitu:
a. Hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel mikroorganisme yang
sebenarnya karena beberapa sel yang berdekatan mungkin membentuk
satu koloni.
b. Medium dan kondisi yang berbeda mungkin menghasilkan nilai yang
berbeda.
c. Mikroorganisme yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium
padat dan membentuk koloni yang kompak dan jelas, tidak menyebar.
d. Memerlukan persiapan dan waktu inkubasi yang lama sehingga
pertumbuhan koloni dapat dihitung.
Metode HC dapat dibedakan atas dua cara, yaitu metode tuang (pour plate)
dan metode permukaan (spread plate)

Metode Tuang (Pour Plate)

1. Dari pengenceran yang dikehendaki sebanyak 1 ml atau 0,1 ml larutan
tersebut dipipet ke dalam cawan petri menggunakan pipet 1 ml atau 1,1
ml.

Sebaiknya

waktu

antara

dimulainya

pengenceran

sampai

menuangkan ke dalam cawan petri tidak lebih dari 30 menit.

2. Kemudian ke dalam cawan tersebut dimasukkan Agar cair steril yang
telah didinginkan sampai 47-500C sebanyak

15-20 ml. Selama

penuangan medium, tutup cawan tidak boleh dibuka terlalu lebar untuk
menghindari kontaminasi dari luar.
3. Segera setelah penuangan cawan petri digerakkan di atas meja secara
hati-hati untuk menyebarkan sel-sel mikroorganisme secara merata yaitu
dengan gerakan melingkar atau gerakan seperti angka delapan.
4. Setelah agar memadat, cawan-cawan tersebut dapat diinkubasikan di
dalam inkubator dengan posisi terbalik. Inkubasi dilakukan pada suhu
dan waktu tertentu sesuai dengan jenis mikroorganisme yang akan
dihitung. Media agar yang digunakan juga disesuaikan dengan jenis
mikroorganisme yang akan ditumbuhkan. Selama inkubasi, sel-sel yang
masih hidup akan tumbuh dan membentuk koloni yang dapat terlihat
langsung oleh mata.
5. Setelah akhir masa inkubasi, koloni yang terbentuk dihitung. Setiap
koloni dapat dianggap berasal dari satu sel yang membelah menjadi
banyak sel, meskipun mungkin juga berasal dari lebih darii satu sel yang
letaknya berdekatan. Perhitungan jumlah koloni dapat dilakukan
menggunakan quebec colony counter. Ketelitian akan lebih tinggi jika
dilakukan pemupukan secara duplo, yaitu menggunakan dua cawan petri
untuk setiap pengenceran. Cara ini harus dilakukan dalam suatu
pekerjaan penelitian. Selanjutnya untuk praktikum dimana biaya dan
jumlah sangat terbatas dapat digunakan satu cawan petri setiap
pengenceran.

Metode permukaan (Spread Plate)

1. Pada metode ini, agar steril terlebih dahulu dituangkan ke dalam cawan
petri dan dibiarkan membeku.
2. Setelah membeku dengan sempurna, kemudian sebanyak 0,1 ml contoh
yang telah diencerkan dipipet pada permukaan agar tersebut.
3. Sebuah batang gelas melengkung (hockey stick) dicelupkan ke dalam
alkohol 95% dan dipijarkan sehingga alkohol hasil terbakar.
4. Setelah dingin batang gelas tsb digunakan untuk meratakan contoh di
atas medium agar dengan cara memutarkan cawan petri di atas meja.
5. Selanjutnya inkubasi dan perhitungan koloni dilakukan seperti pada
metode penuangan. Tetapi harus diingat bahwa jumlah contoh yang
ditumbuhkan adalah 0,1 ml sehingga harus dimasukkan dalam
perhitungan Total Count.

B. Cara Menghitung Koloni

Perhitungan jumlah koloni akan lebih mudah dan cepat jika
pengenceran dilakukan secara desimal. Sebagai contoh misalnya
penetapan jumlah koloni pada susu. Pengenceran awal 1:10 dibuat dengan
mengencerkan 1 ml susu ke dalam 9 ml larutan pengencer dan dilanjutkan
dengan pengenceran yang lebih tinggi misalnya sampai 10-5 atau 10-6
tergantung pada mutu susunya. Semakin tinggi jumlah mikroorganisme
yang terdapat di dalam susu semakin tinggi pengenceran yang harus
7

dilakukan. Jika setelah inkubasi misalnya diperoleh 62 koloni cawan yang

mengandung pengenceran 10-4 maka jumlah koloni dapat dihitung sebagai
berikut ( 1 ml larutan pengencer dianggap 1 g):

Faktor pengenceran = pengenceran awal x pengenceran selanjutnya x jumlah yg ditumbuhkan

= 0,1

x 0,1 x 0,1 x 0,1

x1

= 10-4
Koloni per ml = jumlah koloni X

1
Faktor Pengenceran

= 62 x 1/ 10-4 = 6,2 x 10-5

C. Standar Perhitungan
Untuk melaporkan suatu hasil analisa mikrobiologi digunakan
suatu standar yang disebut Standar Palte Count (SPC) yang menjelaskan
mengenai cara menghitung koloni pada cawan serta cara memilih data
yang ada untuk menghitung jumlah koloni di dalam suatu contoh.
Cara menghitung koloni adalah sebagai berikut.
1. Cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang mengandung jumlah
koloni antara 30-300.
2. Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan suatu
kumpulan koloni yang besar dimana jumlah koloninya diragukan,
dapat dihitung sebagai satu koloni.
3. Suatu deretan (rantai) koloni yang terlihat sebagai suatu garis tebal
dihitung sebagai satu koloni.
4. Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari dua angka yaitu angka
pertama (satuan) dan angka kedua (desimal). Jika angka yang
ketiga sama dengan atau lebih besar dari lima, harus dibulatkan
satu angka lebih tinggi pada angka kedua.
5. Jika pada semua pengenceran dihasilkan kurang dari 30 koloni
mikroba pada cawan petri, berarti pengenceran yang dilakukan
terlalu tinggi. Oleh karena itu jumlah koloni pada pengenceran

yang terendah yang diukur/dihitung. Selanjutnya hasil yang kurang

dari 30 dikalikan dengan besarnya pengenceran, tetapi jumlah yang
sebenarnya harus dicantumkan di dalam tanda kurung.
6. Jika pada semua pengenceran dihasilkan lebih dari 300 koloni pada
medium, berarti pengeceran yang dilakukan terlalu rendah. Oleh
karena itu jumlah koloni pada pengenceran yang tertinggi yang
dihitung. Hasilnya dilaporkan kemudian dikalikan dengan faktor
pengencernya, tetapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan
di dalam tanda kurung.
7. Jika digunakan dua cawan petri per pengenceran, data yang
diambil harus dari kedua cawan tersebut, tidak boleh diambil salah
satu.
8. Jika cawan dari dua tingkat pengenceran dihasilkan koloni dengan
jumlah 30 - 300, dan perbandingan antara hasil tertinggi dan
terendah > 2, maka yang dilaporkan hasil yang terkecil. Jika
perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah 2, yang
dilaporkan rata-rata dari kedua nilai tersebut.

2.3 Metode Most Probable Number (MPN)

A. Definisi
Berbeda dengan metode cawan dimana digunakan medium padat
(Agar), dalam metode MPN digunakan medium cair di dalam tabung
reaksi, dimana perhitungan dilakukan berdasarkan jumlah tabung yang
positif, yaitu yang ditumbuhi oleh mikroorganisme setelah inkubasi pada
suhu dan waktu tertentu. Pengamatan tabung yang positif dapat dilihat
dengan mengamati timbulnya kekeruhan, atau terbentuknya gas di dalam
tabung Durham untuk mikroorganisme pembentuk gas. Pada umumnya
untuk setiap pengenceran digunakan 3 atau 5 seri tabung. Lebih banyak
tabung yang digunakan menunjukkan ketelitian yang lebih tinggi tetapi
alat gelas yang digunakan juga lebih banyak.
Dalam metode MPN, pengenceran harus dilakuakn sedemikian
rupa sehingga beberapa tabung yang berisi medium cair yang diokulasikan

dengan

larutan

hasil

pengenceran

tersebut

mengandung

sel

mikroorganismr, beberapa tabung mungkin mengandung lebih dari satu sel

sedangkan tabung lainnya tidak mengandung sel. Dengan demikian setelah
inkubasi diharapkan terjadi pertumbuhan pada beberapa tabung yang
dinyatakan sebagai tabung positif sedangkan tabung lainnya negatif.
Untuk mendapatkan beberapa tabung positif, pengenceran dilakukan
dalam metode MPN harus lebih tinggi dibandingkan dengan metode
cawan.
Metode

MPN

biasnya

dilakukan

untuk

menghitung

jumlah

mikroorganisme di dalam contoh yang berbentuk cair, meskipun dapat

digunakan untuk contoh berbentuk pasat dengan terlebih dahulu dibuat
suspensi 1:10 dari contoh tsb. Kelompok mikroorganisme dapat dihitung
dengan metode MPN juga bervariasi tergantung medium yang digunakan
untuk pertumbuhan.
Perhitungan MPN
Sebagai contoh misalnya terdapat suatu bahan pangan dilakukan
pengenceran secara desimal, kemudian masing-masing pengenceran
dimasukkan 1 ml ke dalam tabung yang berisi Nutrient Broth. Untuk tahap
pengenceran digunakan 3 seri tabung. Setelah inkubasi suhu dan waktu
tertentu, dilihat tabung yang positif yaitu yang ditumbuhi mikroorganisme
yang dapat ditandai dengan timbulnya kekeruhan. Misalnya pada
pengenceran 10-2 ketiga tabung menghasilkan pertumbuhan positif, pada
pengenceran 10-3 dua tabung positif, pada pengenceran 10-4 satu tabung
positif dan pada pengenceran 10-5 tidak ada tabung positif. Kombinasinya
menjadi 3,2,1,0 dan jika diambil tiga pengenceran yang pertama
kombinasinya adalah 3,2,1. Setelah dicocokkan dengan tabel yang
menunjukkan nilai MPN, hasilnya sebagai berikut:
Kombinasi 3,2,1
Nilai MPN dari tabel MPN (3 tabung) = 1,5
MPN Count = Nilai MPN X 1/ Pengenceran tabung yg ditengah
= 1,5 x 1/10-3 = 1,5 x 10-3

10

Metode MPN dapat digunakan untuk menghitung jumlah mikroorganisme

jenis tertentu yang terdapat di antara mikroorganisme-mikroorganisme
lainnya. Sebagai contoh jika digunakan Lactose Broth maka adanya
bakteri

yang

dapat

memfermentasi

laktosa

ditunjukkan

dengan

terbentuknya gas di dalam tabung Durham. Cara ini biasanya digunakan

untuk menentukan MPN coliform terhadap air atau minuman karena
bakteri coliform termasuk bakteri yang dapat memfermentasi laktosa.

Pengenceran

Contoh kombinasi tabel yang positif (yg berwarna kuning

menandakan positif) sehingga nilai tabel 3;2:1

11

Tabel MPN

12

BAB III
METODELOGI

3.1 ALAT DAN BAHAN

A. Hitungan Cawan
1) Alat
a) Tabung reaksi

b) Cawan petri

c) Pipet tetes

d)

Pipet ukur

e) Inkubator

f)

Kertas pembungkus

2) Bahan
a) Ikan segar

b) Ikan pindang

c) Daging sapi

50 gr

d) Sosis sapi

e) Dendeng sapi

50 gr

f)

36 ml

Buffer Phospat

g) Medium PCA

45 ml

B. Hitungan MPN
1) Alat
a) Tabung reaksi

b) Pipet tetes

c) Rak kayu

d) Tabung Durham

4 series

e) Pipet ukur

f)

Inkubator

g)

Kapas

secukupnya

13

2) Bahan
a) air es batu

1 ml

b) Air matang

1ml

c) Air Sumur

1 ml

d) Air Kolam

1 ml

e) Air Kran

1 ml

f)

100 ml

Media Lactose Broth

3.2 CARA KERJA

A. Prosedur Hitungan Cawan

Sterilisasai semua alat dan media

5 tabung reaksi steril, satu tabung diisi air steril 5 ml, 4 tabung diisi
larutan buffer phosphat 9 ml (10-1, 10-2, 10-3, 10-4)

Swab permukaan bahan (2x2 cm) dengan alat swab yang telah dibasahi
dengan buffer pospat.

masukkan alat tersebut ke dalam air steril dan diaduk.

Setelah itu ambil 1 ml masukkan ke dalam tabung pengenceran 10-1,
ambil larutan tersebut 1 ml dengan pipet steril dan pindahkan ke tabung
10-2, dst sampai tabung 10-4
Dari masing-masing tabung pengenceran (10-2, 10-3, 10-4) ambil 1 ml
lalu masukkan ke cawan petri yang telah diberi label pengenceran

Isi masing-masing cawan petri dengan medium PCA yang masih hangat
(suhu 380C) sebanyak 15 ml.

kemudian homogenkan dengan menggoyangkan cawan

14

Biarkan agar memadat

lalu bungkus dengan kertas pembungkus dengan posisi terbalik dan

inkubasi di dalam inkubator dengan suhu 350C selama 3 hari

B. Prosedur MPN

Sterilisasi semua alat dan media

Sediakan 4 tabung reaksi steril, isi masing-masing dengan larutan

buffer pospat 9 ml, 1 tabung diisi 9 ml (10-1, 10-2, 10-3, 10-4)

Ambil 1 ml sampel air, lalu masukkan ke dalam tabung pengenceran

10-1, lalu aduk dan homogenkan
Dari tabung pengenceran 10-1, ambil 1 ml larutan dengan pipet steril
dan masukkan ke dalam tabung pengenceran 10-2, lalu aduk dan
homogenkan. Lakukan hingga pengenceran 10-4
Dari masing-masing tabung pengenceran (10-1, 10-2, 10-3, 10-4), ambil 1
ml dan masukkan pada 4 series (@ 5 tabung) yang sebelumnya telah
berisi tabung Durham sesuai dengan pengenceran yang diberi label
(sudah diisi media LB 1/3 tabung)

Inkubasi tabung series selama 24 jam di dalam inkubator dengan suhu

350C.

Amati perubahan yang ada.

15

BAB IV
PENUTUP

4. I Kesimpulan
1. Hitungan Cawan (PLATE COUNT)

Prinsip:
Jika sel mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada medium agar,
maka sel tsb akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat
dilihat langsung dan dihitung dengan mata telanjang.

Pengambilan sampel
Bahan pangan yang akan dihitung diambil sampel satu gram / satu ml

Pengenceran sampel dengan kelipatan 10, yaitu 1:10, 1:100, 1:1000

dst. Dengan menggunakan aquades steril.

Jumlah koloni per cawan

1
faktor pengenceran

2. Metode Most Probable Number

Metode ini digunakan untuk menghitung mikroba pada medium cair.

Dimana perhitungan dilakukan berdasarkan tabung yg positif, yaitu
ditumbuhi mikroba setelah diinkubasi.

Penentuan Tabung Positif

Dapat dilihat dengan mengamati timbulnya kekeruhan/ terbentuknya
gas dalam tabung kecil.

Cara kerja
Setiap pengenceran dimasukkan 1 ml ke dalam tabung seri (3-5
tabung) yg berisi medium.
Diinkubasi pada suhu ruang selama 3 hari. Kemudian dihitung jumlah
tabung yg positif.

Nilai MPN
= Nilai MPN Tabel x

1
Pengenceran Tabung Tengah

16

4.2 Saran
Untuk menentukan jumlah mikroorganisme dapat digunakan dengan cara
Hitungan cawan (plate count) atau metode most probable number. Metode
dipilih berdasarkan media dan sampel yang digunakan. Masing-masing
cara memiliki keuntungan dan kerugian, namun ketelitian dalam perlakuan
dapat meminimalisir kesalahan.

17