Cara Kerja Hitung Jumlah Kuman

HJK (Hitung Jumlah Kuman) adalah pengujian sampel secara

bakteriologik secara umum ditujukan untuk mengetahui jumlah bakteri.
Hitung jumlah kuman ada 2 cara :

Untuk menghitung jumlah bakteri secara keseluruhan (total

cell count) yaitu dihitung semua bakteri baik yang hidup maupun yang
mati menggunakan cara :
a) Menghitung langsung secara mikroskopik.
Pada cara ini dihitung jumlah bakteri dalam satuan isi yang sangat
kecil, untuk itu digunakan kaca objek khusus yang bergaris (Petroff-
Hauser) berbentuk bujur sangkar. Cara ini hanya dapat digunakan untuk
cairan yang mengandung bakteri dalam jumlah tinggi (Lay, 1994).
b) Menghitung berdasarkan kekeruhan
Dasar teknik ini adalah banyaknya cahaya yang diabsorbsi
sebanding dengan banyaknya sel bakteri pada batas-batas tertentu. Pada
umumnya untuk menghitung dengan cara ini digunakan turbidimetri (Lay,
1994 ).

Sedangkan untuk perhitungan hanya Bakteri yang hidup ada

3 cara, yaitu:
a) Standart Plate Count
Pengenceran dilakukan dengan menggunakan sejumlah botol
pengencer yang diisi sampel dan aqua destilata steril. Agar cair
didinginkan sampai suhu sekitar 44C dan baru kemudian dituangkan ke
cawan petri setelah agak membeku cawan dieramkan selama 24-48 jam
(37C).
b) Plate Count
Sampel dipipet lalu dimasukkan dalam cawan petri kosong steril,
lalu dituang dalam media agar yang mencair, dengan suhu sekitar 45C
lalu digoyangkan dengan hati-hati sehingga sampel dan media tercampur
rata. Dibiarkan memadat.
c) Agar sebar
Sebanyak 0,1 ml sampel dimasukkan pada permukaan agar yang
sudah memadat dalam cawan petri. Kemudian sampel diratakan di atas
permukaan media tersebut dengan bantuan alat perata atau spreader
(Lay, 1994).

Angka Lempeng Total

ALT (Angka Lempeng Total) adalah metode untuk menetukan
jumlah kuman , tidak membedakan spesiesnya dan bersifat semi
kuntiatif. Gabungan dari Metode Pengenceran dan Hitung Cawan.
Tujuan Pemeriksaan ALT
Untuk mengetahui jumlah koloni kuman dalam sampel
Untuk memeriksa kualitas air
Untuk mengetahui apakah sampel tercemar oleh feses
Prinsip Kerja ALT
Menentukan jumlah kuman yang hidup tidak berdasarkan spesiesnya
kemudian jumlah koloni dikalikan faktor pengenceran pada kolerasi 30-
300 koloni.
Media yang digunakan :

a. Pengenceran berseri

- Saline
b. Hitung cawan
-PCA/NA
Syarat pengambilan sampel
1. Botol yg digunakan steril
2. Pengambilan sampel harus secara aseptik
3. Sampel yang diambil untuk diperiksa harus mewakili
keseluruhannya

Batas penundaan pemeriksaan 1-12 jam

Prosedur kerja ALT

Ose Kalibrasi

a. Pengertian
 Ose kalibrasi adalah ose yang bulatannya telah diketahui
volumenya. Ose kalibrasi digunakan untuk menyetrik sampel ke dalam
agar cawan. Banyaknya koloni yang tumbuh dikali fakor perkalian ose
kalibrasi.

a. Prinsip Ose Kalibrasi

Menghitung jumlah kuman yang hidup berdasarkan

dengan mengalihkan jumlah kuman yang hidup dengan factor
pengenceran yang didapat dengan cara ose kalibrasi dalam 1 ml air
c. Prosedur Kerja Ose Kalibrasi
Spread Method(Metode sebar)
Prinsip : Teknik penanaman didasarkan pada penyebaran sel pada
permukaan agar.
Volume sampel yang ditanamkan umumnya 0,1 ml pada cawan
dengan diameter +/-9 cm. volume yang tepat untuk disebarkan diatas
permukaan agar dan cukup mudah mengering sehingga tidak
menggenangi permukaan agar. Secara peluang, sel bakteri dapat terambil
dengan acak dan seragam dari tabung.
Cara kerja

1. Disiapkan PCA dalam cawan petri steril, biarkan membeku

2. kemudian dipipet 0,1 ml sampel yang telah diencerkan, kemudian
dimasukkan ke atas permukaan agar PCA.
3. Batang hockey stick dicelupkan ke dalam Alkohol 70 % dan
dipijarkan hingga alkohol habis terbakar
4. Setelah dingin, hockey stick tersebut digunakan untuk meratakan
sampel diatas media agar dengan cara memutarkan cawan diatas
meja.
5. Di inkubasi dengan posisi tutup cawan berada di bagian bawah.
6. Di inkubasi selama 24 jam pada suhu 35 37 C.

Kelemahan Spreading Method (Metode Sebar)

 Jika digunakan volume <0,1, maka kemungkinan kesalahannya
adalah sel tidak tersebar merata (tidak tersapu oleh batang L) karena
volume pelarut kurang walaupun dengan pengenceran yang tepat.
Semakin kecil volume berarti semakin sedikit yang terambil oleh pipet,
yang menunjukkan bahwa kesalahan teknis pemipetan semakin tinggi
dan kesempatan sel yang tersebar secara acak dalam pelarut untuk
terambil oleh pipet semakin tidak seragam. Selain itu juga adanya sedikit
volume yang masih menempel dan tersisa (tidak ikut tertekan keluar)
sangat besar pengaruhnya pada hasil yang diperoleh
Jika volume sampel >0,1 ml, maka volume yang lebih besar
otomatis air di permukaan agar lebih banyak sehingga sulit mengering
dan dapat menyebabkan pertumbuhannya memenuhi seluruh permukaan
agar karena sel dapat disebarkan oleh air.
Penggunaan teknik penanaman ini sebaiknya dari jenis sampel yang
memiliki densitas sel yang tinggi dan dengan pengenceran tertentu yang
sesuai. Lebih baik tidak menganalisa jenis sampel seperti air mineral
dalam kemasan dengan teknik ini karena dikhawatirkan jika terdapat
pertumbuhan maka pertumbuhan tersebut kemungkinan besar adalah
kontaminan. Hal ini disebabkan oleh sedikitnya jumlah sel per satuan
volum dalam air mineral tersebut, dan jika dari sekian ratus ml sampel
hanya diambil 0,1 ml-nya maka secara nalar peluang untuk terambil
sangat kecil.

Pour Plate (Teknik Tuang)

Prinsip : Teknik penanaman dengan cara mencampurkan sampel
yang mengandung sel mikroba dengan media pertumbuhan (agar)
sehingga sel-sel tersebut tersebar merata dan diam baik di permukaan
agar atau di dalam agar.
Konsekuensinya adalah tidak semua jenis mikroorganisme dapat
tumbuh di dalam agar (bersifat mikroaerofilik). Volume yang dipakai pada
umumnya adalah 1-2 ml pada cawan dengan diameter 9 cm dan dengan
penambahan media 5-10 ml. Sebaiknya sampel yang dipakai untuk teknik
ini memiliki densitas sel > 30 sel/ml sehingga didapatkan kisaran 30-300
koloni/cawan.
Prosedur

1. 1 ml sampel yang telah diencerkan, dipipet ke dalam cawan petri

2. Kemudian ke dalam cawan tersebut dimasukkan agar cair yang
telah disiapkan pada suhu kurang lebih 45 C sebanyak 20 25 mL
3. Selama penuangan, tutup media tidak boleh dibuka terlalu lebar
untuk menghindari kontaminasi dari luar
4. Setelah dituang lalu diinkubasi 37 C selama 24 jam dan keesokan
harinya dihitung banyaknya koloni.

Kelemahan
Jika digunakan volume <1ml, maka semakin kecil volume berarti
semakin sedikit yang terambil oleh pipet, yang menunjukkan bahwa
 kesalahan teknis pemipetan semakin tinggi dan kesempatan sel yang
tersebar secara acak dalam pelarut untuk terambil oleh pipet semakin
tidak seragam. Selain itu juga adanya sedikit volume yang masih
menempel dan tersisa (tidak ikut tertekan keluar) dapat berpengaruh
terhadap hasil yang diperoleh.
Jika > 2 ml maka semakin besar ukuran sampel maka kekuatan
agar semakin berkurang dan lama memadat sehingga dapat
mempertinggi resiko kesalahan teknis seperti agar jatuh ke tutup cawan.
Semakin besar ukuran sampel berarti semakin kecil konsentrasi
komposisi media semakin encer) dengan penambahan media yang
semakin berkurang jika digunakan ukuran cawan yang sama.
Selain itu, semakin besar ukuran sampel dan jika ditambah dengan
volume media yang sama maka pada saat pencampuran (swirl) dapat
beresiko tumpah dan membasahi celah antara tutup dan dasar cawan
petri yang akhirnya mempertinggi kontaminasi karena bakteri kontaminan
yang menempel pada tempat itu dapat tumbuh. Ketiga alasan inilah yang
menjadi keterbatasan metode pour plate.

V. Perhitungan Cara Langsung Dengan Mikroskop

Penghitungan secara langsung dapat dilakukan secara mikroskopis yaitu
dengan menghitung jumlah bakteri dalam satuan isi yang sangat kecil.
Alat yang digunakan adalah Petroff-Hauser
Chamber atauHaemocytometer. Jumlah cairan yang terdapat
antara coverglass dan alat ini mempunyai volume tertentu sehingga
satuan isi yang terdapat dalam satu bujur sangkar juga tertentu.
Ruang hitung terdiri dari 9 kotak besar dengan luas 1 mm. Satu kotak
besar di tengah, dibagi menjadi 25 kotak sedang dengan panjang 0,2
mm. Satu kotak sedang dibagi lagi menjadi 16 kotak kecil. Dengan
demikian satu kotak besar tersebut berisi 400 kotak kecil. Tebal dari
ruang hitung ini adalah 0,1 mm. Sel bakteri yang tersuspensi akan
memenuhi volume ruang hitung tersebut sehingga jumlah bakteri per
satuan volume dapat diketahui.
Cara kerja :
1. Digunakan kotak sedang
2. Bersihkan Petroff-Hauser Counting Chamber atau Haemocytometer
dengan alkohol 70 % lalu
3. keringkan dengan tissue.
4. Letakkan cover glass di atas alat hitung.
5. Sampel diberi pewarnaan akan memeperjelas pengamatan. Misal :
Methylen Blue.
6. Tambahkan 50 l suspensi sel yeast (kira-kira 1 tetes) dengan cara
meneteskan pada parit kaca pada alat hitung. Suspensi sel akan
menyebar karena daya kapilaritas.
7. Biarkan sejenak sehingga sel diam di tempat (tidak terkena aliran air
dari efek kapilaritas).
8. Letakkan alat hitung pada meja benda kemudian cari fokusnya pada
perbesaran 40x10.
9. Lakukan perhitungan secara kasar apakah diperlukan pengenceran
atau tidak. Jika dalam satu kotak sedang terdapat sel-sel yang banyak
dan bertumpuk maka perhitungan akan tidak akurat dan diperlukan
pengenceran dengan perbandingan 1:5 atau 1:10.
10. Hitung sampel, paling tidak sebanyak 5 kotak sedang (lebih banyak
lebih baik). Hasil perhitungan dirata-rata kemudian hasil rataan
dimasukkan rumus untuk kotak sedang. Jika dilakukan pengenceran
maka jumlah sel/ml dikalikan faktor pengenceran.