IMUNOPRESIPITASI

1.
IMUNOPRESIPITASI
 Teknik pencetus antigen protein dari larutan menggunakan antibodi yang secara
spesifik mengikat protein tertentu,
 Imunopresipitasi mengharuskan antibodi digabungkan ke subtrat padat pada beberapa
titik dalam prosedur
JENIS
 Imunopresipitasi Protein Individu
Menggunakan antibodi yang spesifik untuk protein yang dikenal
untuk mengisolasi protein tertentu. Solusi ini akan sering dalam
bentuk liat kasar dari tanaman atau jaringan hewan/Cairan tubuh
atau sampel yang berasal dari biologis
 imunopresipitasi kompleks protein (Co-IP)
Imunopresipitasi kompleks protein utuh (yaitu antigen
bersama dengan protein atau ligan apa pun yang terikat
dengannya) dikenal sebagai ko-imunopresipitasi (Co-
IP). Co-IP bekerja dengan memilih antibodi yang
menargetkan protein yang dikenal yang diyakini sebagai
anggota protein kompleks yang lebih besar. Dengan
menargetkan anggota yang diketahui ini dengan antibodi,
dimungkinkan untuk menarik seluruh kompleks protein
keluar dari larutan dan dengan demikian mengidentifikasi
anggota kompleks yang tidak diketahui
 Ini bekerja ketika protein yang terlibat dalam kompleks saling mengikat
erat, sehingga memungkinkan untuk menarik beberapa anggota
kompleks keluar dari solusi dengan menempel satu anggota dengan
antibodi.Konsep mengeluarkan protein kompleks dari larutan kadang-
kadang disebut sebagai "pull-down". Co-IP adalah teknik yang ampuh
yang digunakan secara teratur oleh ahli biologi molekuler untuk
menganalisis interaksi protein-protein.
 Antibodi tertentu sering memilih untuk subpopulasi protein targetnya
yang memiliki epitop terbuka, sehingga gagal mengidentifikasi protein
dalam kompleks yang menyembunyikan epitop. Hal ini dapat dilihat
bahwa jarang mungkin untuk mengendapkan bahkan setengah dari
protein yang diberikan dari sampel dengan antibodi tunggal, bahkan
ketika banyak antibodi digunakan.
 Ketika putaran penargetan dan imunopresipasi berturut-turut terjadi,
jumlah protein yang teridentifikasi dapat terus bertambah. Protein yang
teridentifikasi mungkin tidak pernah ada dalam satu kompleks tunggal
pada waktu tertentu, tetapi sebaliknya dapat mewakili jaringan protein
yang berinteraksi satu sama lain pada waktu yang berbeda untuk tujuan
yang berbeda
 Chromatin imunopresipitasi(ChIP)
adalah metode yang digunakan untuk menentukan lokasi situs
pengikatan DNA pada genomuntuk protein tertentu yang
menarik. Teknik ini memberikan gambaran interaksi protein-DNA
yang terjadi di dalam inti sel atau jaringan hidup. Sifat in vivo dari
 metode ini berbeda dengan pendekatan lain yang digunakan secara
tradisional untuk menjawab pertanyaan yang sama.
 Prinsip yang mendasari pengujian ini adalah bahwa protein pengikat
DNA (termasuk faktor transkripsi dan histones ) dalam sel hidup dapat
dihubungkan secara silang dengan DNA yang mereka ikat. Dengan
menggunakan antibodi yang spesifik untuk protein pengikat DNA
putatif, seseorang dapat melakukan imunopresipitasi kompleks protein-
DNA dari lisat seluler. Ikatan silang sering dilakukan dengan
menerapkan formaldehida pada sel (atau jaringan),
 meskipun terkadang menguntungkan untuk menggunakan pengikat
silang yang lebih jelas dan konsisten seperti DTBP . Setelah
pengikatan silang, sel-sel dilisiskan dan DNA dipecah menjadi
potongan-potongan 0,2–1,0 kb dengan sonikasi . Pada titik ini
dilakukan imunopresipitasi yang menghasilkan pemurnian kompleks
protein-DNA. Kompleks protein-DNA yang dimurnikan kemudian
dipanaskan untuk membalikkan ikatan silang formaldehida dari
protein dan kompleks DNA, yang memungkinkan DNA dipisahkan
dari protein. Identitas dan kuantitas fragmen DNA
 Difusi ganda menurut Ouchterlony
 Tehnik ini memungkinkan untu evaluasi kualitatif apakah ada antibodi
atau antigen tertentu
 Ini juga menyediakan informasi tentang apakah perbedaan antigenik
terminal dilokalisasi pada antigen yang sama, atau berbeda, atau apakah
antibodi yang berbeda dapat berikatan dengan antigen yang sama
 GAMBAR 2.21
 GAMBAR 2.21
 Teknik ini memudahkan penugasan antigen (violet) ke antibodi uji
tertentu (kuning), atau sebaliknya.
 Antigen dan antibodi dipipet ke dalam bak di dalam gel dan menyebar
melalui media ini (angka-angka tersebut menunjukkan epitop yang ada)
Di mana mereka bertemu garis-garis presipitasi (dikenal
sebagai band precipitin) berkembang, menunjukkan
pembentukan kompleks imun.
 a Antibodi mengendapkan epitop identik (epitop 1) dari kedua
antigen, menghasilkan pembentukan pita presipitin yang
mengalir bersama membentuk lengkungan, yang saling
menghambat migrasi mereka.
 Pada b, tiga pita precipitin independen terbentuk,
menunjukkan bahwa antibodi membedakan tiga epitop
berbeda pada tiga antigen berbeda. c Epitope 1 dari kedua
sampel antigen membentuk pita precipitin yang mengalir
bersama. Anti-2 bermigrasi di luar garis pertemuan ke area di
mana ia mengendap dengan antigen bebas 1, 2 dan
membentuk taji
 Imunopresipitasi Dikombinasikan dengan Elektroforesis. Antigen dipisahkan dalam
gel agarosa dengan menerapkan arus listrik. Antibodi bereaksi dengan bermigrasi
dalam gel, baik tanpa medan listrik, atau secara bersamaan dalam medan listrik; dan
baik dalam dimensi yang sama dengan antigen atau dalam langkah vertikal kedua
(elektroforesis "roket").
 Imunodifusi radial menurut Mancini. Ini adalah uji antigen
kuantitatif berdasarkan kurva standar yang telah ditentukan
 Gambar 2.22
 Gambar 2.22
 anti-serum monospesifik yang dicampur dengan agar-agar
dan dituangkan ke dalam piring. Antigen kemudian
diencerkan ke konsentrasi yang berbeda, dan dipipet ke
dalam sumur yang sebelumnya telah ditinju ke piring.
Kompleks antigen-antibodi mengendap dalam bentuk
cincin di sekitar sumur, yang diameternya sebanding
dengan konsentrasi antigen. Hasilnya adalah kurva
standar dari mana antigen uji yang tidak diketahui dapat
dikuantifikasi. Secara analog, antibodi juga dapat diukur
dengan mencampurkan antigen ke dalam gel.
 Elektroforesis plus reaksi antibodi: Western blotting.
Metode ini melibatkan elektroforesis protein dalam gel,
ditambah dengan deteksi oleh antibodi spesifik. Protein
yang dipisahkan dipindahkan ke nitroselulosa, di mana
mereka diidentifikasi dengan bantuan antibodi spesifik.
Serum poliklonal biasanya digunakan untuk tujuan ini
karena antibodi monoklonal jarang mengikat protein yang
didenaturasi dan dipisahkan.