LAPORAN PRAKTIKUM MK BIOTEKNOLOGI KESEHATAN 2021

ACARA X. ANALISIS PROFIL PROTEIN DENGAN METODE SDS-

PAGE

Nama : Meita Ayu Puspitasari

NIM : 181810401009
Acara Praktikum : Analisis Profil Protein Dengan Metode Sds-
Page
Tanggal Praktikum : 27 April 2021
Asisten Praktikum : Linda Dwi Santika
:

1. TUJUAN PRAKTIKUM
Tujuan dari praktikum Analisis Profil Protein Dengan Metode Sds-Page
adalah sebagai berikut:
- Memahami dan mengetahui langkah-langkah analisis profil protein
dengan metode SDS-PAGE.
- Mampu menghitung berat molekul protein.

2. METODE PRAKTIKUM
2.1 Alat
Alat yang digunakan dalam acara praktikum Analisis Profil Protein
Dengan Metode Sds-Page adalah sebagai berikut:
- Seperangkat alat SDS-PAGE
- Powersupply
- Mikropipet
- Mikrotip
- Falkon
- Mini sentrifugasi
2.2 Bahan
Bahan yang digunakan dalam acara praktikum Analisis Profil Protein
Dengan Metode Sds-Page adalah sebagai berikut:
- 30 % Acrilamide
- 10 % SDS
- Upper Stock (Tris HCl 0,5 M pH 6,8)
- Lower Stock (Tris HCl 1,5 M pH 8,8)
- ddH2O
- 10 % APS
- TEMED
- Buffer Sample
- Buffer Running
- Isopropanol

2.3 Cara kerja

Langkah kerja dari acara praktikum Analisis Profil Protein Dengan
Metode Sds-Page adalah sebagai berikut:
a. Separating gel
Dimasukkan pelat pendek dan pelat pengatur jarak 1mm untuk
pengecoran
I
Dipastikan kaki rangka dan pelat berada dibawah
I
Dikencangkan penjepit untuk mengamankan posisi pelat
I
Dipasang bingkai pengecoran dengan pelat dan dipastikan sudah
kencang
I
Diperiksa segel set-up dengan cara memipet air
I
Dikeluarkan ddh2o menggunakan tisu basah atau kertas saring
sampai kering
I
 Disiapkan resolving solution 12% dalam tabung elang 50ml
I
Dicampur 3,3ml ddh2o; 4ml larutan akrilamid 30%; 2,5ml kaldu
rendah dan 100μl dari 10% SDS
I
Ditambahkan 10μl 10% APS dan 4μl TEMED
I
Diaduk lalu segera dipipet diantara pelat hingga gel pengurai tepat
diatas garis hijau atau ±1cm diatas pelat pendek
I
Dilihat untuk memastikan tidak ada kebocoran di bagian bawah
pelat
I
Dipipet 200μl isopropanol pada gel pengurai dan diamati lapisan
tipis pada gel
I
Hasil

b. Stacking gel
Dicampurkan 1,35ml ddH2O; 0,335ml akrilamid; 0,25ml upper stock
dan 20μl 10% SDS
I
Dibutuhkan 30 menit untuk membentuk gel pengurai lalu ditiriskan
isopropanol
I
Dibilas bagian atas gel dengan perlahan dan dikeringkan
I
Ditambahkan 20μl 10% APS dan 2μl TEMED ke dalam larutan
stacking lalu diaduk
I
Dipipet 1ml larutan gel diatas gel pemecah diantara pelat
 I
Diisi hingga bagian atas lalu dimasukkan sisir ke dalam larutan dan
ditunggu gel berpolimerasi
I
Dilepaskan bingkai tuang dengan gel dari dudukan tuang
I
Dilepas secara perlahan pelat kaca dari bingkai pengecoran
I
Dibungkus cawan dan disimpan di ruang dingin hingga satu minggu
I
Hasil

c. Preparasi sampel
Diberi label tabung microfuge sesuai dengan sampel yang
digunakan
I
Dimasukkan 40μl ekstrak ikan ke dalam tabung microfuge dan 40μl
sampel buffer
I
Dipanaskan tabung pada suhu 100 selama 3 menit
I
Disentrifugasi selama 5 detik
I
Dikeluarkan gel dari bungkus dan handuk kertas
I
Dikencangkan gel dengan pelat pendek menghadap ke dalam
I
Diberi label pada pelat dengan spidol permanen
I
Dimasukkan running ke dalam tangki dan dimasukkan dengan
benar
 I
Dituangkan buffer running 10x yang telah diencerkan ke dalam
modul pengoperasian diantara kedua pelat sampai sumuran
terendam penuh
I
Diperiksa running agar tidak membocorkan solusi penyangga
I
Dilepaskan sisir agar dapat dilihat dengan jelas
I
Dimasukkan 10μl larutan sampel dengan perlahan ke dalam sumur
I
Dilepaskan larutan sampel secara perlahan
I
Dilakukan berulang hingga ke dalam muatan sampel yang lain
I
Ditandai berat molekul dengan cara dimasukkan 10μl ke dalam
sumur
I
Ditutup tangka ketika semua sampel dimuat
I
Dimasukkan elektroda ke dalam catu daya positif dan negatif
I
Diatur daya 20mA/pelat dan dijakankan selama 1jam
I
Diamati sampel yang akan terbentuk pita tipis
I
Dihentikan pemakaian, ketika pewarna biru sudah mendekati gel
I
Dicabut catu daya dari tangki dan dibersihkan buffer running
I
Dilepaskan pelat kaca dengan perlahan
 I
Dipotong gel dengan perlahan sebelum proses pewarnaan
I
Dipindahkan gel ke dalam cawan petri persegi
I
Dituangkan larutan comassie biru ke dalam cawan petri hingga
penuh
I
Diinkubasi pada suhu 50 selama 30 menit
I
Dikeluarkan gel dengan penjepit dan diamati pita bening pada gel
I
Dilakukan destaining, dan ditambahkan kertas saring untuk proses
penyerapan warna
I

Hasil
3. HASIL DAN PEMBAHASAN
3.1 Hasil
Tabel 1. Jarak migrasi dan log berat molekul marker

Berat Molekul Log Berat Molekul

Jarak Migrasi
Marker Marker

75 5 1,8751
63 7 1,7993
48 11 1,6812
35 15 1,5441
25 20 1,3979
20 22 1,3010
17 26 1,2304
11 29 1,0414

Kurva standard log berat molekul marker

Log Berat Molekul Marker

2,0000
log berat molekul marker

1,5000

y = -0,033x + 2,0407
1,0000 R² = 0,9922 Log Berat Molekul
Marker

0,5000 Linear (Log Berat

Molekul Marker)

0,0000
0 10 20 30 40
jarak migrasi
 Tabel 2. Berat molekul protein

Jarak Migrasi Protein Substitusi Berat Molekul Protein

A = 16 1,5127 32,5612
B = 21 1,3477 22, 2690
C= 30 1,0507 11,2383

3.2 Pembahasan
SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate - Polyacrylamide Gel
Elektorophoresis) merupakan suatu metode yang digunakan untuk
menentukan berat molekul dari protein yang belum diketahui, karena
tingkat migrasi dari protein dilapisi dengan SDS (Sodium Dodecyl
Sulphate) berbanding terbalik dengan logaritma dari berat molekul. SDS-
PAGE merupakan teknik untuk memisahkan rantai polipeptida dalam
protein berdasarkan ukuran dan berat molekul yang bermuatan di bawah
pengaruh medan listrik. Protein yang akan dianalisis menggunakan
metode SDS-PAGE, sebelumnya diubah terlebih dahulu dari struktur
globular menjadi struktur yang linear melalui proses denaturasi protein
(Masyitoh et al., 2016).
Metode SDS-PAGE merupakan metode yang menggunakan gel
poliakrilamid dalam pemurnian proteinnya. Gel poliakrilamid sendiri
tersusun atas stacking gel dan separating gel. Stacking gel merupakan gel
yang terdapat pada well yang digunakan untuk tempat meletakkan
sampel, sedangkan separating gel merupakan gel dimana protein akan
bermigrasi ke arah anoda. Protein yang dipisahkan melalui SDS-PAGE
dapat dikarakterisasi berdasarkan berat molekulnya dengan satuan kilo
Dalton (kDa) (Rachmania et al., 2017). Profil protein dapat diperoleh
dalam bentuk ekstrak protein menggunakan suatu pelarut. Kelarutan zat
yang teradapat di dalam pelarut dipengaruhi oleh ikatan polar dan non
polar. Protein merupakan satu senyawa polar yang mudah berikatan
dengan pelarut polar, karena zat yang bersifat polar hanya mampu larut
dalam pelarut polar, seperti aquades dan etanol (Masyitoh et al., 2016).
Akrilamid merupakan senyawa organik bagian dari seri acrylic dan
metaceylic amides yang memiliki kegunaan paling banyak. Akrilamid juga
disebut sebagai 2-propenamida yang memiliki rumus bangun
H2C=CHCONH2. Polarisasi akrilamid menggunakan radikal bebas yang
menghasilkan poliakrilamid. Poliakrilamid merupakan senyawa polimer
sintetis yang memiliki nilai kelarutan dalam air tinggi. Poliakrilamid banyak
digunakan karena memiliki banyak kegunaan, salah satunya untuk
menentukan kemurnian suatu protein (Wibowo et al., 2012).
Separating gel dan stacking gel dibuat dengan menambahkan
beberapa bahan yang memiliki komposisi hampir sama, yaitu terdiri dari
ddH2O, larutan akrilamid, SDS, TEMED, APS, isopropanol dan Tris HCl.
Penambahan ddH2O berfungsi sebagai pelarut yang bersifat polar
sehingga dapat melarutkan semua bahan serta dapat mengendapkan
protein dalam konsentrasi yang cukup tinggi (Mawardi, 2016). Larutan
akrilamid berfungsi sebagai senyawa utama penyusun gel yang bersifat
karsinogenik. SDS merupakan suatu senyawa deterjen yang berfungsi
untuk mendenaturasi protein dengan memutus ikatan rantai polipeptida
dalam protein membentuk protein yang dapat terelusi (Utami et al., 2013).
TEMED merupakan kependekan dari Tetra Methyl Diamine yang
bertindak sebagai katalisator reaksi polimerisasi akrilamid menjadi gel
poliakrilamid yang digunakan untuk memisahkan protein. APS merupakan
kependekan dari ammonium persulphate yang berfungsi sebagai inisiator
untuk mengaktifkan akrilamida agar dapat bereaksi dengan molekul
akrilamida yang lain, sehingga terbentuk rantai polimer yang panjang.
Penambahan TEMED dan APS menyebabkan terjadinya polimerisasi
yang membuat struktur larutan menjadi padat, sehingga dapat membentuk
gel. Penambahan isopropanol bertujuan untuk menghilangkan gelembung
dari meniskus dan melindungi larutan gel dari pemulung radikal, yaitu
oksigen. Penambahan Tris HCl dalam membuat separating gel dan
stacking gel berbeda. Pembuatan separating gel menggunakan Tris HCl
konsentrasi 1,5 M dengan pH 8,8 (lower stock), sedangkan stacking gel
menggunakan Tris HCl konsentrasi 0,5 dengan pH 6,8 (upper stock).
Penambahan Tris berfungsi sebagai larutan yang menjaga pH agar tetap
stabil (Oktaviani dan Ekaningtyas, 2019).
Proses elektroforesis untuk analisis SDS-PAGE memerlukan
pemasangan glassplate yang dirangkai dengan frame dari bio-Rad.
Pemasangan ini dimulai dengan memasangkan pelat pendek dan pelat
pengatur jarak sumuran gel. Penjepit dikencangkan agar pelat tidak
mudah terlepas dan dipastikan tidak ada kebocoran dengan memipetkan
air ke dalam rancangan. Pembuatan separating gel dimulai dengan
penambahan semua bahan hingga homogen. Bahan yang telah homogen
dimasukkan ke dalam glassplate melalui aliran dinding agar tidak
terbentuk gelembung. Langkah selanjutnya memasukkan aquades
dengan pipet untuk mengetahui bentukan gel yang dibuat dan menjaga
agar permukaan gel tidak bergelombang. Gel yang telah terbentuk akan
terlihat sebagai garis tipis diantara aquades dan separating gel. Akuades
dibuang setelah terbentuk gel yang memadat (Megayasa et al., 2014).
Pembuatan stacking gel 1,35ml ddH2O; 0,335ml akrilamid; 0,25ml
upper stock dan 20μl 10% SDS; 20μl 10% APS dan 2μl TEMED. Bahan
tersebut kemudian dihomogenkan dan dimasukkan diatas separating gel
yang telah mengeras. Tahap selanjurnya dimasukkan sisiran (comb) untuk
membuat sumuran dalam buffer. Penarikan sisiran ditunggu hingga gel
mengalami proliferasi, kemudian dilepaskan glassplate dan sisiran dengan
perlahan agar tidak merusak gel yang telah terbentuk. Gel yang telah jadi
disimpan untuk proses analisis kemurnian dan konsentrasi protein dalam
suhu rendah selama 1 minggu (Masyitoh et al., 2016).
Preparasi sampel terdiri dari beberapa tahapan. Pertama, sampel
protein ikan pada mikrofuge diberi label dan disentrifuge untuk
mendapatkan ekstrak protein ikan. Ekstrak tersebut kemudian dimasukkan
ke dalam mikrofuge dan ditambahkan buffer sampel untuk
mempertahankan pH yang dimiliki oleh sampel, sehingga sampel tidak
terpengaruh dengan penambahan berbagai reagen selanjutnya. Buffer
sampel protein biasanya terdiri dari Tris HCl, SDS, gliserol, bromophenol-
blue dan β-mercaptoethanol. Tris HCl berfungsi sebagai penyangga pH
yang bersifat asam, sedangkan SDS berfungsi untuk membuat protein
bermuatan negatif (Oktaviani dan Ekaningtyas, 2019). Gliserol berfungsi
sebagai pemberat agar sampel tidak melayang dan meleber keluar saat
dimasukkan ke dalam sumuran, sedangkan bromophenol-blue berfungsi
sebagai pewarna agar protein dapat terlihat (Nasihin et al., 2015). Β-
mercaptoethanol berfungsi untuk mereduksi dan memotong ikatan
disulfida protein (Murtiyaningsih, 2017). Sampel dipanaskan untuk
mendenaturasi protein pada suhu 100oC.
Gel poliakrilamid kemudian dipasang pada elektroforesis dan
dimasukkan buffer running hingga menutupi keseluruhan sumuran.
Sampel kemudian dimasukkan ke dalah sumuran sebanyak 10 yang
sebelumnya telah dicampurkan dengan pewarna untuk menandai sampel
dan juga dimasukkan marker untuk mengetahui ukuran dari pita yang
terbentuk (Masyitoh et al., 2016). Langkah selanjutnya adalah
memasangkan elektroda pada catu negatif dan positif, kemudian
dinyalakan elektroforesis dengan daya 20 mA/pelat selama 1jam. Proses
dihentikan ketika pita-pita protein telah terbentuk mendekati anoda. Gel
kemudian dikeluarkan dari elektroforesis dan diletakkan dalam cawan petri
untuk proses pewarnaan menggunakan coomassie briliant blue untuk
mewarnai protein pada gel (Kaimudin, 2020). Proses terakhir dilakukan
dengan metode destaining menggunakan metanol untuk mencuci warna
pada gel dan kertas saring untuk menarik warna agar pita protein terlihat
dengan jelas (Megayasa et al., 2014).
Migrasi protein pada elektroforesis didapatkan molekul protein yang
berbeda terpisah dengan baik yang ditandai dengan pewarna coomassie
briliant blue. Hasil SDS-PAGE menunjukkan pita-pita protein yang
dipisahkan berdasarkan berat molekulnya. Perhitungan berat molekul
protein dilakukan dengan tujuan untuk mengidentifikasi berat molekul dari
sampel protein ikan menggunakan metode elektroforesis. Berat molekul
protein ditentukan dengan membandingkan berat molekul marker dengan
Rf atau pita yang terbentuk. Kurva standar dibentuk dengan nilai Rf
sebagai sumbu Y dan nilai logaritma berat molekul sebagai sumbu X.
Berdasarkan perhitungan antara berat molekul dan Rf menggunakan
regresi linear, diperoleh persamaan Y=-0,033x + 2,0407 yang digunakan
untuk menghitung berat molekul sampel. Koefisien korelasi (R2) digunakan
untuk melihat hubungan antara dua variabel uji. Nilai R2 yang diperoleh
yaitu sebesar 0,9922 yang hampir mendekati nilai 1. Nilai R2 yang
mendekati 1 berarti terdapat hubungan yang kuat antara variabel X
dengan variabel Y (Megayasa et al., 2014).
Berdasarkan hasil yang diperoleh, diketahui bahwa protein A
memiliki jarak migrasi protein sebesar 16 dengan berat molekul sebesar
32,5612. Protein B memiliki jarak migrasi sebesar 21 dengan berat
molekul sebesar 22,2690. Protein C memiliki jarak migrasi protein sebesar
30 dengan berat molekul sebesar 11,2383. Hal tersebut menunjukkan
bahwa pita dengan berat molekul paling besar berada dibagian atas gel
akrilamid, sedangkan semakin kebawah maka berat molekulnya semakin
kecil. Hal tersebut disebabkan karena molekul yang lebih kecil dari pori-
pori gel akrilamid akan bergerak lebih cepat ke arah anoda (Masyitoh et
al., 2016).
4. KESIMPULAN
SDS-PAGE merupakan suatu metode yang digunakan untuk
memisahkan rantai polipeptida dalam protein berdasarkan ukuran dan
berat molekul yang bermuatan di bawah pengaruh medan listrik dan
menentukan berat molekul dari protein itu sendiri. analisis SDS-PAGE
menggunakan gel poliakrilamid dalam menentukan migrasi dari pita-pita
protein yang terbentuk, sehingga dapat divisualisasikan. Berat molekul
protein ditentukan dengan membandingkan berat molekul marker dengan
Rf. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa semakin kebawah, berat
molekul protein semakin kecil karena ukurannya lebih kecil dari pori-pori
gel akrilamid, sehingga pergerakannya lebih cepat ke arah anoda.
 DAFTAR PUSTAKA

Kaimudin, M. 2020. Review: Analisis Profil Protein Ikan Dengan Metode

SDS-PAGE. Majalah BIAM. 16(01): 13-20.
Masyitoh, M.D., I.D.A.R. Dewanti, dan D. Setyorini. 2016. Analisis Profil
Protein Ekstrak Aquades dan Etanol Daun Mimba (Azadirachta
indica A. Juss) dengan Metode SDS-PAGE. E-Jurnal Pustaka
Kesehatan. 4(3): 533-539.
Mawardi, A. 2016. Uji Efektivitas Metode Isolasi DNA Genom Kopi Arabika
(Coffea arabica L.) Asal Kabupaten Jayawijaya. Jurnal Biologi
Papua. 8(1): 7-12.
Megayasa, N.A., S. Winarsih, dan S. Santoso. 2014. Reaksi Silang Antara
Antibodi Adho36 Salmonella typhi dengan Outer Membrane Protein
Vibrio cholerae Menggunakan Metode Western Blotting. Majalah
Kesehatan FK Universitas Brawijaya. 1(1): 16-24.
Murtiyaningsih, H. 2017. Isolasi DNA Genom Dan Identifikasi Kekerabatan
Genetik Nanas Menggunakan RAPD (Random Amplified Polimorfic
DNA). Jurnal Agritrop. 15(1): 24-35.
Nasihin, S.R., W.H. Rizky, dan N. Carsono. 2015. Pengujian Kemurnian
Genetik Benih Padi Galur F3 (Pandanwangi X PTB33) Terseleksi
Menggunakan Marka Molekuler Simple Sequence Repeats (SSR).
Jurnal Agrikultura. 26(2): 61-67.
Oktaviani, E., dan M. Ekaningtyas. 2019. Analisis Protein Isolat Bakteri
Escherichia coli BL 21 Menggunakan Sodium Dodecyl Sulphate-
Polyacrylamide Gel Elektrophoresis (SDS-PAGE). Jurnal
Pendidikan Biologi dan Sains (PENBIOS). 4(1): 1-7.
Rachmania, R.A., P. Wahyudi, A.M. Wardania, dan D.R. Insani. 2017.
Profil Berat Molekul Enzim Protease Buah Nanas (Ananas comusus
L. Merr) dan Pepaya (Carica papaya L.) Menggunakan Metode
SDS-PAGE. Jurnal Penelitian Kimia. 13(1): 52-65.
Utami, S.T., D.F. Kusharyati, dan H. Pramono. 2013. Pemeriksaan Bakteri
Leptospira Pada Sampel Darah Manusia Suspect Leptospirosis
Menggunakan metode PCR (Polymerase Chain Reaction). Jurnal
Balaba. 9(2): 74-81.
Wibowo, A.D., M.T. Suhartono, dan P.L.P. Siagian. 2012. Fraksional Dan
Penentuan Profil Protein Bungkil Kelapa Dengan Metode SDS-
PAGE. J.Teknol. dan Industri Pangan. 23(1): 69-74.