LAPORAN PRAKTIKUM MK BIOTEKNOLOGI KESEHATAN 2021

ACARA VII. TRANSFORMASI DNA

Nama : Meita Ayu Puspitasari

NIM : 181810401009
Acara Praktikum : Transformasi DNA
Tanggal Praktikum : 13 April 2021
Asisten praktikum : Riska Hendriyani
:

1. TUJUAN PRAKTIKUM
Tujuan dari praktikum Transformasi DNA adalah sebagai berikut:
- Mengetahui dan memahami prinsip dari transformasi
- Mengetahui dan memahami cara melakukan transformasi plasmid
dengan menggunakan CaCl2

2. METODE PRAKTIKUM
2.1 Alat
Alat yang digunakan dalam acara praktikum Transformasi DNA adalah
sebagai berikut:
- Eppendorf
- Waterbath
- Micropipet
- Microtip (10-100 dan 100-1000 )
- Loop inokulasi

2.2 Bahan
Bahan yang digunakan dalam acara praktikum Transformasi DNA
adalah sebagai berikut:
- Escherichia coli strain DH5-α
- 50 mM CaCl2 steril
 - Plasmid pGLO
- Plasmid pGMET Easy
- Media LB (LB agar plate, LB agar plate+ampicilin, dan LB agar
plate+ampicilin+arabinosa)

2.3 Cara kerja

Langkah kerja dari acara praktikum Transformasi DNA adalah sebagai
berikut:
Diberi label eppendorf dengan label +DNA dan –DNA
I
Ditambahkan 500 CaCl2 dingin kedalam eppendorf –DNA
I
Ditransfer 8-10 koloni E.coli kedalam eppendorf –DNA
I
Diputar dengan kuat tusuk gigi untuk melepaskan koloni E.coli dalam
larutan CaCl2
I
Diresuspensi kembali koloni bakteri agar selnya tidak menggumpal dalam
larutan CaCl2
I
Ditransfer 250 suspensi sel pada eppendorf –DNA ke eppendorf +DNA,
dan diletakkan tube diatas es batu
I
Ditambahkan 10 DNA plasmid ke eppendorf +DNA
I
Diinkubasi on ice selama 20 menit
I
Diinkubasi eppendorf pada suhu 42oC, 90 detik dalam waterbath untuk
proses heat shock
I
Diinkubasi on ice selama 2 menit
 I
Ditransfer 250 media LB cair ke dalam eppendorf
I
Diinkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit dalam waterbath
I
Diberi label pada permukaan bawah media agar plate
I
Diambil eppendorf dari proses inkubasi
I
Ditransfer 250 suspensi sel yang telah direcovery baik eppendorf –DNA
maupun +DNA ke dalam media agar plate
I
Diratakan suspensi sel menggunakan metode spread plate dengan loop
inokulasi steril
I
Disusun plate, lalu direkatkan dan diberi label
I
o
Diinkubasi plate pada suhu 37 C, overnight dalam posisi terbalik
I
Divisualisasikan proses transformasi menggunakan sinar UV
I

Hasil
3. HASIL DAN PEMBAHASAN
Transformasi merupakan proses introduksi DNA rekombinan atau
DNA asing ke dalam sel inang, dalam hal ini adalah sel bakteri. Metode
transformasi berfungsi untuk mentransfer plasmid yang mengandung
bahan genetik (Rotinsulu et al., 2019). Transformasi umumnya
dilkaukan pada bakteri dan pertama kali diperkenalkan oleh Frederick
Griffith (1982). Transformasi diperkenalkan berdasarkan fakta bahwa
suatu bakteri dapat melepaskan fragmen DNA-nya ke dalam suatu
media dan kemudian akan masuk ke dalam sel bakteri lain dalam kultur
tersebut. Proses transformasi dapat terjadi secara alami maupun
secara buatan yang disengaja. Prinsip transformasi DNA plasmid
iadalah menggunakan metode heat shock. Metode heat shock ini
dilakukan dengan memberikan kejut panas secara tiba-tiba. Suhu DNA
plasmid yang semula 0oC dinaikkan suhunya secara tiba-tiba pada
suhu 42oC (Nafisah et al., 2016).
Transformasi dilakukan pada sel inang yang telah dibuat sebagai
sel kompeten. Sel kompeten merupakan sel yang telah dimodifikasi
sedemikian rupa dan telah mengalami perubahan tingkat permeabilitas.
Perubahan permeabilitas tersebut mengakibatkan membran sel dari sel
bakteri yang digunakan sebagai sel inang mampu untuk dilewati oleh
plasmid DNA yang bertindak sebagai vektor rekombinan. Hal tersebut
mengakibatkan DNA yang telah diinsersikan ke dalam sel bakteri akan
terus melakukan pembelahan, sehingga jumlahnya akan terus
bertambah. Sel kompeten berfungsi sebagai organisme yang dapat
memperbanyak DNA insert (Agus dan Irfandi, 2017).
Pembuatan sel kompeten dilakukan dengan menambahkan
larutan CaCl2 terhadap sel inang, yaitu bakteri. Larutan CaCl2 dapat
menetralkan reaksi tolak-menolak antara muatan negatif fosfolipid
dengan muatan negatif gugus forsfat DNA insert. Larutan CaCl 2
memiliki nilai efisiensi transformasi optimal sebesar 10 6 DNA
yang dapat mempengaruhi kemurnian reagen, pertumbuhan sel dan
keberhasilan alat (Noor et al., 2014).
Sel inang yang digunakan dalam praktikum ini adalah bakteri
Escherichia coli strain DH5α. Escherichia coli banyak digunakan
sebagai sel inang karena sel bakteri E.coli mudah untuk dikulturkan dan
pembelahan selnya cepat, sehingga kultur yang diperoleh didapatkan
dengan jumlah yang banyak. E.coli strain DH5α yang digunakan dalam
praktikum ini bersifat sensitif terhadap antibiotik ampisilin dan
sebelumnya telah dibuat kompeten melalui penambahan larutan CaCl 2
(Aini et al., 2011). Plasmid yang digunakan dalam praktikum ini adalah
plasmid pGLO dan plasmid pGMET Easy. Plasmid pGLO merupakan
plasmid yang telah disisipi oleh gen GFP yang diisolasi dari ubur-ubur.
Gen GFP merupaka gen yang membawa informasi titik ORI, regulator
araC dan gen resisten ampisilin. Plasmid pGLO dapat memendarkan
warna hijau ketika divisualisasikan menggunakan UV transiluminator
(Walewangko et al., 2015). Plasmid pGMET juga merupakan gen
spesifik yang dapat membedakan antara sel inang yang telah
ditransformasi dan yang belum ditransformasikan (Chang dan Yan,
2013).
Proses transformasi plasmid terdiri dari beberapa tahapan. Tahap
pertama yaitu pemberian label pada mikrotube untuk membedakan
antara sampel yang akan disisipi oleh plasmid dan sampel yang tidak
disisipi oleh plasmid. Tahap kedua yaitu penambahan CaCl2 ke dalam
eppendorf –DNA sebagai larutan yang akan membuat sel inang yaitu
bakteri Escherichia coli strain DH5α menjadi sel kompeten (Masfuroh et
al., 2017). Tahap selanjutnya memasukkan koloni bakteri ke dalam
mikrotube yang sebelumnya telah diambil menggunakan tusuk gigi dan
tusuk gigi diputar dengan kuat agar koloni terlepas dari tusuk gigi.
Tahap selanjutnya dilakukan resuspensi agar sel bakteri tidak
menggumpal dan homogen dengan larutan CaCl2. Sampel di dalam
eppendorf –DNA merupakan sampel kontrol, sedangkan eppendorf
+DNA merupakan sampel perlakuan. Sampel kemudian ditransfer ke
eppendorf +DNA, lalu diletakkan eppendorf diatas es batu. Hal tersebut
bertujuan untuk mempertahankan konsetrasi sel dan mencegah sel
mengalami lisis (Mawardi dan Ramandey, 2017).
Tahap selanjutnya dimasukkan plasmid ke dalam eppendorf
+DNA dan diharapkan plasmid akan memasuki sel E.coli yang telah
dibuat kompeten sebelumnya. Sampel kemudian diinkubasi on ice
untuk mempertahankan konsentrasi sel agar tidak lisis. Kedua
eppendorf selanjutnya diinkubasi pada suhu 47oC sebagai perlakuan
heat shock selama 90 menit (Agus dan Irfandi, 2017). Kedua sampel
kemudian diinkubasi on ice kembali, lalu ditambahkan media LB cair
(luria bertani) ke dalam eppendorf sebagai nutrisi untuk pertumbuhan
bakteri dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit. Tahap
selanjutnya adalah pemberian label pada media LB agar plate untuk
memudahkan proses penelitian. Eppendorf berlabel –DNA dituangkan
dalam media LB agar plate+ampisilin, sedangkan eppendorf berlabel
+DNA dituangkan dalam media LB agar plate+ampisilin+arabinosa dan
diratakan menggunakan loop inokulasi dengan teknik spread plate agar
inokulum tersebar merata diatas media. Tahap selanjutnya adalah
inkubasi plate pada suhu 37oC overnight dengan posisi plate terbalik.
Hal tersebut merupakan teknik untuk menumbuhkan koloni bakteri
dengan suhu pertumbuhan yang umum digunakan untuk
menumbuhkan koloni bakteri (Septiani et al., 2017).
Eppendorf –DNA merupakan kontrol negatif, yaitu berisi E.coli
yang tidak disisipi oleh plasmid, sehingga hanya berisi bakteri E.coli
saja. Bakteri tanpa plasmid tersebut mampu tumbuh pada media LB
agar tanpa penambahan antibiotik ampisilin maupun
ampisilin+arabinosa, namun tidak tumbuh pada media LB agar dengan
penambahan antibiotik ampisilin maupun ampisilin+arabinosa.
Penambahan antibiotik ampisilin pada media LB berfungsi agar media
LB menjadi media selektif pertama, sehingga hanya bakteri yang
resisten terhadap ampisilin yang mampu tumbuh (Rachmawati et al.,
2013).
Berdasarkan hasil yang diperoleh bakteri E.coli DH5α tanpa
plasmid yang diinokulasikan pada media LB agar plate menunjukkan
adanya pertumbuhan koloni bakteri, namun jika ditumbuhkan pada
media LB agar plate+ampisilin tidak tumbuh koloni karena bakteri tidak
resisten terhadap ampisilin. Bakteri E.coli yang disisipi plasmid
diinokulasikan pada media LB agar plate+ampisilin dapat tumbuh,
namun tidak berpendar saat disinari dengan sinar UV karena media
tidak mengandung arabinosa. Bakteri E.coli yang disisipi plasmid
diinokulasikan pada media LB agar plate+ampisilin+arabinosa
menunjukkan adanya pertumbuhan koloni dan berpendar ketika disinari
dengan sinar UV. Hal tersebut dikarenakan media mengandung
arabinosa yang dapat diekspresikan oleh bakteri yang telah disisipi oleh
plasmid pGLO maupun plasmid pGMET Esay. Hasil tersebut sesuai
dengan literatur yang menyatakan jika gen GFP pada plasmid pGLO
aktif jika terdapat arabinosa pada media pertumbuhan E.coli pembawa
plasmid. Ekspresi arabinosa diatur oleh operon araC, jika media tidak
mengandung arabinosa maka gen GFP tidak akan aktif dan plasmid
pGLO yang disisipkan pada bakteri tidak akan berpendar hijau
(Hadiwiyono, 2009).
Proses transformasi menggunakan kontrol positif dan kontrol
negatif bertujuan untuk mengetahui keberhasilan proses transformasi
tanpa adanya kontaminasi. Kedua kontrol tersebut digunakan untuk
memastikan kualitas sel kompeten yang digunakan dalam transformasi.
Keberhasilan proses transformasi dipengaruhi oleh berbagai faktor,
salah satunya terletak pada pembuatan sel kompeten. Sel kompeten
yang baru dibuat akan memiliki kemampuan penerimaan plasmid lebih
baik dibandingkan dengan sel kompeten yang telah disimpan lama.
Enzim restriksi dan pemanasan saat proses heat shock juga yang
 diberikan pada sel bakteri juga dapat mempengaruhi keberhasilan
transformasi (Wiharyati et al., 2014).

4. KESIMPULAN
Transformasi merupakan proses introduksi DNA rekombinan atau
DNA asing ke dalam sel inang yang sebelumnya telah dibuat menjadi sel
kompeten menggunakan metode CaCl2, dalam hal ini adalah bakteri
Escherichia coli. E.coli sering digunakan dalam proses transformasi
karena memiliki daya pembelahan sel yang cepat dan strain DH5α yang
digunakan merupakan strain bakteri yang sensitif terhadap ampisilin. Hasil
menunjukkan bahwa E.coli yang disisipi plasmid dapat tumbuh pada
media LB agar plate+ampisilin+arabinosa dan memendarkan warna hijau
saat disinari UV, sedangkan E.coli yang tidak disisipi plasmid mampu
tumbuh pada media LB agar plate saja dan tidak berpendar. Keberhasilan
transformasi dipengaruhi oleh kualitas sel kompeten dan tahapan-tahapan
proses transformasi.
 DAFTAR PUSTAKA

Agus, R., dan Irfandi. 2017. Ligasi Gen Rv 1980c Pengkode Protein MPT
64 KE pGEM-T Mycobacterium tuberculosis Sebagai Antigen untuk
Immunodiagnostik Tuberkulosis Laten. Jurnal Ilmu Alam dan
Lingkungan. 8(15): 42-48.
Aini, A.N., P. Ria S., A.L.N. Aminin. 2011. Pemurnian DNA Plasmid Puc19
Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea. Jurnal Sains
dan Matematika. 19(2): 47-53.
Chang, S.M., dan T.R. Yan. 2014. Genetic engineering techniques for
lactic acid bacteria: construction of a stable shuttle vector and
expression vector for b-glucuronidase. Biotechnol Lett. 36: 327-335.
Hadiwiyono. 2009. Quorum sensing: Suatu Sistem Komunikasi Bakteri
Fitopatogen, Peranannya Pada Proses Infeksi, dan Peluangnya
Sebagai Basis Pengembangan Strategi Baru Dalam Pengendalian
Penyakit Tumbuhan. Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia.
15(2): 45-54.
Masfuroh, A. Budiharjo, dan H. Pancasakti K. 2017. Konstruksi Plasmid
Prha Sebagai Pembawa Gen Ara Penyandi Enzim L-Arabinosa
Isomerase Dari Thermotoga thermarum. Jurnal Biologi. 6(3): 5765.
Mawardi, A., dan E.R.P.F. Ramandey. 2017. Ligasi dan Transformasi Gen
MSP1 Plasmodium falciparum Penyebab Malaria di Kota Jayapura.
MKB. 49(4): 213-223.
Nafisah, B., R. Agus, M.N. Massi, dan Fahruddin. 2016. Kloning Gen
Rv1980c Pengkode Protein MPT 64 ke Vektor Ekspresi pQE 30Xa
Mycobacterium tuberculosis Sebagai Antigen Untuk
Immunodiagnostik Tuberkulosis Laten. Integrated Lab Journal. 4(1):
63-70.
Noor, S., H. Pramono, dan S. Aziz. 2014. Deteksi Keragaman Spesies
Bakteri Metanogen Rumen Sapi Menggunakan Kloning Gen 16S
rRNA dan Sekuensing. Scripta Biologica. 1(4): 1-8.
Rachmawati, R., P.E. Susilowati, dan S. Raharjo. 2013. Analisis Gen
Merkuri Reduktase (merA) Pada Isolat Bakteri Dari Tambang Emas
Kabupaten Bombana Sulawesi Tenggara. J.Prog.Kim.Si. 3(2): 108-
123.
Rotinsulu, S.H.C., Fatimawali, dan T.E. Tallei. 2019. Transformasi Plasmid
Yang Mengandung Gen merB Pada Bakteri Escherichia coli TOP-
10. PHARMACON. 8(2): 290-297.
Septiani, E.N. Dewi, dan I. Wijayanti. 2017. Aktivitas Antibakteri Ekstrak
Lamun (Cymodocea rotundata) Terhadap Bakteri Staphylococcus
aureus Dan Escherichia coli. Saintek Perikanan. 13(1): 1-6.
Walewangko, G.V.Ch., W. Bodhi, dan B.J. Kepel. 2015. Uji Resistensi
Bakteri Escherichia coli Yang DP Isolasi Dari Plak Gigi
Menggunakan Merkuri Dan Ampisilin. Jurnal e-Biomedik (eBM).
3(1): 79-86.
Wiharyati, R., D. Hardianto, H.P. Kusumaningrum, dan A. Budiharjo. 2014.
Klonin Gen pcbC dari Penicillium chrysogenum Ke Dalam Plasmid
pPICZA Untuk Pengembangan Produksi Penisilin G. Jurnal Bioma.
16(1): 33-38.