NAMA: FELIX LEONARD A. M.

SITORUS

NPM: 260110170077

KELAS B (2017)

KUIS PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI

1. Jelaskan tahapan transformasi heat shock

Jawab:
Transformasi menggunakan heat shock memiliki 2 tahapan utama yaitu :
a. Pembuatan sel kompeten metode heatshock dengan media TSS
Sel E. coli TOP10 dikultur ke dalam 5 mL media LB cair dan diinkubasi pada 37 °C, 150
rpm selama 18 jam. Sebanyak 2,5 mL kultur dimasukkan ke dalam 50 mL LB cair dan
diinkubasi pada 37 °C, 150 rpm selama 3 jam atau hingga OD600 mencapai 0,3-0,4. Kultur
dipindahkan ke dalam tabung Eppendorf 1,5 mL yang sebelumnya telah didinginkan di
dalam es. Pelet sel dipanen dengan sentrifugasi pada kecepatan 3270 g, 4 °C selama 5
menit. Selanjutnya sebanyak 5 mL pelet sel diresuspensikan dengan 200 μL media TSS.
Sel E. coli TOP10 kompeten disimpan pada 4 °C.
b. Proses Transformasi
Sel E. coli TOP10 kompeten sebanyak 200 μL ditambahkan hasil ligasi sebanyak 15 μL.
Kontrol viabilitas digunakan air bebas nuklease steril serta kontrol positif berupa
pETDUET1 tanpa DNA sisipan. Campuran tersebut diinkubasi pada 4 °C selama 30 menit.
Proses heat shock dilakukan pada 42 °C selama 90 detik dan tabung sampel segera
diinkubasikan ke dalam es selama 2 menit. Media LB cair sebanyak 750 μL ditambahkan
ke dalam tabung, lalu tabung tersebut diinkubasi kembali pada 37 °C, 150 rpm, selama 90
menit. Selanjutnya campuran hasil heat shock dipekatkan menjadi 100 μL dengan cara
sentrifugasi 3270 g selama 5 menit. Pelet sel diresuspensi kembali dengan media 100 μL
yang tersisa dan disebar pada media LB padat yang mengandung ampisilin 100 μg/mL.
Sebanyak 100 μL kontrol negatif dan kontrol positif diperlakukan sama seperti sampel.
Setelah itu, media LB padat tersebut diinkubasi pada 37 °C selama 18 jam.
 Atau dapat juga dilakukan dengan menggunakan proses transformasi seperti berikut :
75 μL sel kompeten bakteri dimasukkan kedalam mikrotube yang baru dan ditambahkan 5
μL hasil ligase, campurkan secara perlahan dengan menggunakan mikropipet pada
mikrotube yang berisikan sampel dan juga vektornya. Inkubasi kedalam ice box selama 30
menit, lalu sampel dimasukkan kedalam therblock dengan suhu berkisar 450C – 600C
(dengan dilakukannya teknik heat shock ini mendinginkan memanaskan dan juga
mendinginkan kembali bakteri, maka DNA dapat masuk kedalam sel) selanjutnya sampel
kembali ditaruh kedalam ice box selama 5 menit, kemudian ditambahkan 100 μL 2 YT,
diinkubasi selama 1 jam pada suhu 370C. setelah inkubasi selesai ditambahkan sebanyak
10 μL IPTG dan 50 μL X-Gal lalu homogenkan dengan menggunakan mikropipet. Setelah
itu sampel disebar pada media LB + ampicillin 100 μL/ml secara aseptis. Diinkubasi
selama 1 malam, dimana pertumbuhan bakteri yang kompeten akan ditandai dengan
tumbuhnya koloni biru dan koloni putih, koloni biru merupakan sel yang membawa
plasmid kosong dan koloni yang berwarna putih adalah koloni yang membawa vector
dengan sisipan (vector rekombinan).
(Sambrook and Russell, 2001).

2. Jelaskan prinsip transformasi Heat Shock

Jawab:
Prinsip dari proses Heat Shock adalah terjadi lonjakan suhu dari 0 oC ke 42 oC terhadap sel
yang telah diberi perlakuan CaCl2. Perlakuan CaCl2 ini dilakukan dalam pembuatan sel
kompeten. Garam CaCl2 akan mempengaruhi porositas membran sel sehingga pada saat terjadi
lonjakan suhu membran menjadi tidak selektif terhadap molekul asing dan produk ligasi dapat
masuk ke dalam sel. (Howe, 2007)

3. Apa itu sel kompeten

Jawab:
Transformasi yang terjadi pada DNA rekombinan dalam plasmid ini tidak terjadi secara alami,
melainkan harus diinduksi oleh zat-zat tertentu. Sel bakteri yang telah mengalami suatu
perlakuan fisik sehingga dapat memperoleh kemampuan untuk mengambil DNA asing adalah
 sel kompeten (Brown, 2010). Selain itu, sel kompeten ini juga dapat mengambil DNA plasmid
sirkuler. Sel biasa hanya dapat melakukan transformasi DNA linier (Sword, 2003).
Salah satu metode sederhana untuk membuat sel menjadi kompeten (siap untuk ditransformasi)
dengan cara merendam sel bakteri ke dalam larutan garam dalam kondisi dingin, contohnya
kalsium klorida (CaCl2). Larutan garam ini dapat mengikat DNA dan komponen
lipopolisakarida dari dinding sel bakteri yang bermuatan negatif, sehinga DNA terikat dengan
dinding sel bakteri (Sword, 2003).

4. Ada berapa metode transformasi

a. Metode Bakteri Spesies Agrobacterium, Virus atau Teknik Langsung
Teknik transformasi ini digunakan pada tanaman. Dimana teknik ini memanfaatkan
konstruksi gen yang terdiri dari promoter bakteri atau virus. Pemilihan tanaman yang akan
ditransformasi tergantung pada spesies yang akan digunakan dan kemampuan tanaman
tersebut secara in vitro (Web, dan Moris, 1992)
b. Metode heat shock (Kejutan Panas)
Metode ini dilakukan dengan menggunakan inkubasi pada temperature tinggi dan rendah.
Metode heat shock dilakukan dengan mendinginkan, memanaskan dan mendinginkan
kembali bakteri, sehingga DNA dapat masuk kedalam sel (Wong, 2006).
c. Biolistrik/Particle Bombardment
Metode ini merupakan salah satu metode transformasi DNA secara in situ. Dimana DNA
target akan diletakan pada permukaan emas sekitar 0,5-1,5 mikrometer. Lalu DNA tersebut
akan ditembakan dengan alat gene gun (Wong, 2006).
d. Metode elektroforasi
Metode elektroforasi adalah metode dengan mengejutkan sel bakteri menggunakan medal
listrik berkekuatan tinggi (10-20 kV/cm), metode ini dilakukan dengan cara mengalirkan
aliran listrik. Aliran listrik tersebut akan membuat membrane sel mengalami kerusakan
sementara, yang menyebabkan merman menjadi permeable untuk proses integrasi DNA
(Wong, 2006).
5. Aplikasi metode transformasi
Blue/ White Screening
Pada aplikasi blue/ white screening, plasmid yang mengandung enzim β-galaktosidase akan
membantu dalam penyaringan. Dimana mekanismenya dengan cara menambahkan substrat
untuk enzim β -galaktosidase pada media agar yang berisikan bakteri, hasilnya menunjukkan
dua warna yaitu putih dan biru. Koloni yang berwarna putih tidak memiliki beta galaktosa,
sehingga memungkinkan untuk mengandung fragmen target yang dimasukkan. Sedangkan
untuk koloni yang berwarna biru tidak mengandung beta galaktosa. (Turner, et al., 2005)
Electroporation
Elektroporasi merupakan metode yang menggunakan kejutan listrik untuk memperbesar pori-
pori membran sel sehingga dapat meningkatkan permeabilitas membran. Untuk melakukan
metode ini, sel harus terlebih dahulu ditumbuhkan pada media hingga mencapai masa di sekitar
pertengahan fase log. Lalu sinyal elektrik akan menginduksi perbesaran pori-pori membran
sehingga molekul yang berukuran kecil seperti DNA dapat masuk. Efisiensi dari metode ini
berbanding terbalik dengan peningkatan ukuran plasmid. (Wells et al., 2008)
Metode elektroporasi sudah diaplikasikan dalam berbagai bidang. Dalam bidang pertanian,
elektroporasi dapat digunakan untuk memodifikasi mikroorganisme agar dapat menambat
nitrogen bebas yaitu dengan menyisipkan gen yang dapat menambat nitrogen bebas. Selain itu
juga dapat dihasilkan tanaman transgenik yang memiliki genotipe yang lebih istimewa (seperti
peningkatan mutu, rasa dan ketahanan misalnya). (Seidman et al., 2001) Dalam bidang
kedokteran, elektroporasi juga dapat digunakan untuk menyisipkan gen ke dalam suatu bakteri
untuk penghasilan produk komersil seperti hormon insulin yang berguna untuk penderita
diabetes. Selain itu, di bidang bioremediasi, elektroporasi dapat digunakan untuk memodifikasi
mikroorganisme sehingga mikroorganisme dapat digunakan untuk mengatasi permasalahan
seperti tumpahan minyak di laut dengan memindahkan gen yang menyandikan enzim yang
dapat menguraikan minyak pada bakteri target. (Madigan et al., 2009)
 DAFTAR PUSTAKA

Brown, T. A. 2010. Gene cloning and DNA analysis. Oxford: Blackwell Publishing; 95-99.
Howe C. 2007. Gene Cloning and Manipulation. Edisi ke-2. Cambridge: Cambridge.
Madigan MT, Martinko JM, Dunlap PV, Clark DP. 2009. Brock Biology of Microorganisms.
San Fransisco: Pearson Education, Inc. Hal. 67-68.
Sambrook, J., and Russell DW. 2001. Molecular Cloning A Laboratory Manual. Ed ke-3. New
York: Cold Spring Harbor Laboratory.
Seidman CE, Struhl K, Sheen J, Jessen T. 2001. Introduction of plasmid DNA into cells. Curr
Protoc Mol Biol. 1: 1.8
Sword, W. E. 2003. Chemical transformation of E. coli. Dalam : Casali, N. dan Preston, A. E.
coli plasmid vectors : methods and applications. New Jersey: Humana Press.
Webb, K.J. dan P. Morris. 1992. Methodologies of Plant Transformation. Plant Genetic
Manipulation for Crop Protection.
Wells KE, McMahon J, Foster H, Ferrer A, Wells DJ. 2008. Gene delivery to dystrophic
muscle. Methods Mol Biol 423:421-31.
Wong, D.W. 2006. The ABC od gene cloning. New York: International Thomson Publishing.