LAPORAN PRAKTIKUM GENETIKA

“ISOLASI DNA BAKTERI DAN ELEKTROFORESIS”

Disusun untuk memenuhi tugas mata kuliah Praktikum Genetika yang diampu
oleh Bapak Sutrisno, M.sc

Disusun Oleh :
Nama : Ayunita
NIM : 2008086035
Kelas : PB-5B
Fakultas : Sains dan Teknologi
Dosen Pengampu : Sutrisno, M.sc
Asisten : 1. Ahmad Febri Yansah
2. Ratna Avitasari

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI
PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI WALISONGO
SEMARANG
2022
 ACARA 11
“ISOLASI DNA BAKTERI DAN ELEKTROFORENSIS”
Semarang, 28 November 2022

A. Tujuan
1. Mengidentifikasi tahapan isolasi DNA pada Bakteri
2. Menganalisis Fungsi dari Reagen pada setiap tahapan isolasi DNA pada Bakteri
3. Melatih keterampilan dalam penggunaan alat dalam penelitian molekuler
4. Menganalisis prinsip kerja teknik elektroforensis dalam pemisahan DNA
5. Menganalisis hasil isolasi DNA dari sampel tumbuhan dan hewan pada praktikum
sebelumnya.
B. Dasar Teori
Sel merupakan unit struktural dan fungsional dari organisme
yangditemukan pertama kali oleh peneliti Inggris bernama Robert Hooke. Sel
eukariotjauh lebih kompleks daripada sel prokariot, karena sel eukariot memiliki
membrandan organel tertentu yang tidak dimiliki sel prokariot. Di dalam sebuah sel
jugaterdapat materi genetik, tepatnya terletak pada inti sel dan mitokondria
padahewan atau kloroplas pada tumbuhan. Materi genetik dapat berupa
DeoxyriboNucleic Acid (DNA) atau Ribonucleic Acid (RNA) (Campbell, 2016)
Untuk mengisolasi DNA dari suatu sel maka dilakukan pemisahan antara
protein dan asam nukleat dengan mengekstrasi nukleoprotein yang terdapat dalam sel.
Isolasi DNA merupakan langkah untuk mempelajari DNA. Salah satu prinsisp isolasi
DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan
campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat
molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada
pada bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi
yangterpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah
(Campbell et al ., 2000).
Dua tipe utama asam nukleat adalah asam dioksiribonukleat (DNA) dan
asamribonukleat (RNA). DNA terutama ditemui dalam inti sel, asam ini merupakan
pengemban kode genetik dan dapat memproduksi atau mereplikasi dirinya
dengantujuan membentuk sel-sel baru untuk memproduksi organisme itu dalam
sebagian besar organisme, DNA suatu sel mengerahkan sintesis molekul RNA, satu tipe
RNA,yaitu messenger RNA (mRNA), meninggalkan inti sel dan mengarahkan
tiosintesisdari berbagai tipe protein dalam organisme itu sesuai dengan kode DNA-
nya(Fessenden, 1990).DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) adalah master molecul (molekul
utama)yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme
dalamsetiap organisme. DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula
deoksiribosa, basa nitrogen dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida .Molekul
DNA initerikat membentuk kromosom, dan ditemukan di nukleus, mitokondria dan
kloroplas.DNA yang menyusun kromosom ini merupakan nukleotida rangkap yang
tersusun heliks ganda (double helix), dimana basa nitrogen dan kedua ”benang”
polinukleotida saling berpasangan dalam pasangan yang tetap melalui ikatanhidrogen
dan antara nukleotida yang satu dengan nukleotida yang lain dihubungkandengan
ikatan fosfat. DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup dan disebut
sebagai ”cetak biru kehidupan” karena molekul ini berperan penting sebagai pembawa
informasi hereditas yang menentukan struktur protein dan prosesmetabolisme lain
(Istanti, 1999).
Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada
suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung
pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan
untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Posisi molekul yang
terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, ataupun
dilakukan kuantifikasi dengan densitometer. Elektroforesis untuk makromolekul
memerlukan matriks penyangga untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya
panas dari arus listrik yang digunakan. Elektroforesis biasanya memerlukan media
penyangga sebagai tempat: bemigrasinya molekul-mulekul biologi Media penyangganya
bermacam-macam tergantung pada tujuan dan bahan yang akan dianalisa. Media
penyangga yang sering dipakai dalam elektroforesis antara lain yaitu kertas, selulose,
asetat dan gel Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang
banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat (Soedarmadji, 1996)
Beberapa faktor mempengaruhi kecepatan migrasi dari molekul protein yakni
Ukuran molekul protein, konsentrasi gel, Buffer, medium penyangga, kekuatan voltase,
temperatur medium disaat elektroforensis berlangsung protein akan bergerak dari
elektroda negatif menuju elektroda positif sampai pada jarak tertentu pada gel
 poliakrilamid tergantung pada berat molekulnya. Semakin rendah berat molekulnya
maka semakin jauh pula protein bergerak atau mobilitasnya tinggi. Sebaliknya protein
dengan berat molekul lebih besar akan bergerak pada jarak yang lebih pendek atau
mobilitasnya rendah (Sumitro et al., 1996).
Hasil elektroforesis akan didapatkan pita-pita protein yang terpisahkan
berdasarkan berat molekulnya Tebal tipisnya pita yang terbentuk dari pita protein
menunjukkan kandungan atau banyaknya protein yang mempunyai berat molekul yang
sama yang berada pada posisi pita yang sama Hal ini sejalan dengan prinsip pergerakan
molekul bermuatan, yakni molekul bermuatan dapat bergerak bebas dibawah pengaruh
medan listrik, molekul dengan muatan dan ukuran yang sama akan terakumulasi pada
zona atau pita yang sama atau berdekatan (Soedarmadji, 1996).
C. Metode
1. Alat dan Bahan
Adapun alat yang digunakan pada praktikum ini meliputi GD column, 2 ml cllection
tubes, mikro pipet, tip mikro putih, kuning dan baru, tabung mikro pipet 1,5 ml, neraca
analitik, vorteks, mikrocentrifuge sedangkan bahan yang digunakan yaitu isolat bakteri
gram positif dan gram negatif, gram positif buffer, etanol absulat, gb buffer, W1 Buffer,
wash buffer, lysozyme, proteinase k, dan elution buffer.
2. Cara Kerja

1. Persiapan sampel

Dimasukan 200 uji kultur bakteri

kedalam 1,5 ml microtube

Disentrifugasi pada 15000 rcf Ditambahkan 20 (proteinase k)

selama 1 menit ) lalu diinkubasikan pada suhu 60 C
Selama 10 menit bolak balik tiap 3
menit

Buang supernatan

Ditambahkan 180 GT Buffer dan

Vortex
 2. Pemecahan Sel 4. DNA WASHING

Ditambahkan 200 GB Buffer dan Ditambahkan 400 W1 Buffer ke

Vortex 10 detik GD coulmn

Disentrifugasi 15000 selama 30

Diinkubasikan pada suhu 70
detik kemudian buang cairanya
celcius selama 10 menit dibolak
balik setiap 3 menit

3. DNA binding Ditambahkan 600 ml wash buffer

Ditambahkan 200 etanol absolut

kemudian dikocok dengan kuat
sampai tidak ada endapan Disentrifugasi pada 15000 rcf
selama 30 detik

Diletakan GD Column pada

Dibuang cairanya kemudian
Collection tube selama 2 menit
disentrifugasi 15000 rcf selama 3
menit

5.Elution

Diletakan Gd coulmn pada collection tube Dipindahkan GD column kedalam

kemudian dippindahkan GD coulmn kemudian microtube 1,5 ml yang baru
disentrifugasi pada 15000 rcf selama 2 menit

Ditambahkan elution buffer yang

Dibuang collection tube kemudian sudah dipanaskan ke tengah GD
diganti dengan yang baru

Diamkan selama 3 menit

Disentrifugasi pada 1500 rcf

selama 30 detik
D. Hasil Pengamatan

Pengamatan Gambar Keterangan

Isolasi DNA bakteri dan Terlihat ada DNA bakteri
elektroforensis akan tetapi samar-samar

Pembahasan
Molekul DNA dalam suatu sel dapat diekstraksi atau diisolasi untuk berbagai
macam keperluan seperti amplifikasi dan analisis DNA melalui elektroforesis. Isolasi
DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein,
lemak, dan karbohidrat. Prisnsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran
(lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein,
serta pemurnian DNA (Corkill dan Rapley, 2008; Dolphin, 2008). Menurut Surzycki
(2000), ada beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam proses isolasi DNA antara lain
harus menghasilkan DNA tanpa adanya kontaminan seperti protein dan RNA;
metodenya harus efektif dan bisa dilakukan untuk semua spesies metode yang
dilakukan tidak boleh mengubah struktur dan fungsi molekul DNA; dan metodenya
harus sederhana dan cepat.
Prisnsip isolasi DNA pada berbagai jenis sel atau jaringan pada berbagai
organisme pada dasarnya sama namun memiliki modifikasi dalam hal teknik dan bahan
yang digunakan. Bahkan beberapa teknik menjadi lebih mudah dengan menggunakan
kit yang diproduksi oleh suatu perusahaan sebagai contoh kit yang digunakan untuk
isolasi DNA pada tumbuhan seperti Kit Nucleon Phytopure sedangkan untuk isolasi
DNA pada hewan digunakan GeneJETTM Genomic DNA Purification Kit. Namun
tahapan-tahapan isolasi DNA dalam setiap langkahnya memiliki protokol sendiri yang
disesuaikan dengan keperluan. Penggunaan teknik isolasi DNA dengan kit dan manual
memiliki kelebihan dan kekurangan. Metode konvensional memiliki kelebihan harga
lebih murah dan digunakan secara luas sementara kekurangannya membutuhkan
waktu yang relatif lama dan hasil yang diperoleh tergantung jenis sampel.
Tahap pertama dalam isolasi DNA adalah proses perusakan atau penghancuran
membran dan dinding sel. Pemecahan sel (lisis) merupakan tahapan dari awal isolasi
DNA yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel (Holme dan Hazel, 1998). Tahap
penghancuran sel atau jaringan memiliki beberapa cara yakni dengan cara fisik seperti
menggerus sampel dengan menggunakan mortar dan pestle dalam nitrogen cair atau
dengan menggunakan metode freezing-thawing dan iradiasi (Giacomazzi et al., 2005).
Cara lain yakni dengan menggunakan kimiawi maupun enzimatik. Penghancuran
dengan menggunakan kimiawi seperti penggunaan detergen yang dapat melarutkan
lipid pada membran sel sehingga terjadi destabilisasi membran sel (Surzycki, 2000).
Sementara cara enzimatik seperti menggunakan proteinase K seperti untuk melisiskan
membran pada sel darah (Khosravinia et al., 2007) serta mendegradasi protein globular
maupun rantai polipeptida dalam komponen sel (Brown, 2010; Surzycki (2000).
Elektroforesis merupakan metode yang digunakan dalam praktikum ini untuk
memaparkan uji kualitas DNA yang diisolasikan dengan memvisualisasikannya
menggunakan elektroforesis kit beserta aplikasi Gel Documenter. Teknik elektroforesis
adalah teknik pemisahan senyawa berdasarkan kecepatan migrasi dari senyawa yang
bermuatan listrik di bawah pengaruh medan listrik. Elektroforesis gel merupakan salah
satu teknik utama dalam biologi molekular dan merupakan metode standar untuk
pemisahan, identifikasi dan pemurnian fragmen DNA
Prinsip dasar teknik ini adalah Deoxyribonucleotid Acid (DNA), Ribonucleotid
Acid (RNA), atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik Dalam hal ini, molekul-
molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di
dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul
bersangkutan, konsentrasi gel agarosa, tegangan listrik yang diberikan, dan konformasi
DNA. DNA bermuatan negatif. sehingga bila diletakkan di medan listrik. DNA akan
bermigrasi dari kutub negatif ke kutub positif. Pemisahan protein atau asam nukleat
berukuran kecil (DNA, RNA, atau Oligonukleotida)
 Untuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa
ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput lant) yang sudah
dimurnikan. Konsentrasi gel agarosa yang digunakan dalam elektroforesis bervariasi
antara 0,79% 1.5%. Etidium bromida dapat ditambahkan ke suspensi DNA untuk tujuan
visualisasi hasil elektroforesis (pita-pita DNA dapat dideteksi di bawah sinar UV)
Hasil elektroforesis menunjukkan adanya DNA bakteri akan tetapi tidak terlalu
jelas hal ini dikarenakan ada beberapa faktor yang membuat DNA tidak terlihat dengan
jelas, pada hasil elektroforensis garis pita yang panjang dan garis pita yang pendek.
Semakin panjang jarak garis pita yang terbentuk pada gel agarosa maka panjang DNA
pada genom tersebut semakin pendek. Sedangkan, semakin pendek jarak garis pita yang
terbentuk pada gel agarosa maka panjang DNA pada genom semakin panjang. Hal ini
dikarenakan fungsi agarosa sebagai benteng pengambat gerakan DNA ketika dialiri oleh
tegangan listrik.
E. Kesimpulan
Dari praktikum yang telah dilakukan didapatkan simpulan bahwa Elektroforesis
merupakan metode yang digunakan dalam praktikum ini untuk memaparkan uji
kualitas DNA yang diisolasikan dengan memvisualisasikannya menggunakan
elektroforesis kit beserta aplikasi Gel Documenter dalam isolasi DNA bakteri
didapatkan hasil yang Terlihat DNA akan tetapi samar dikarenakan ada beberapa hal
yang menyebabkan DNA terlihat samar salah satunya yaitu kesalahan dalam
penggunaaan bahan.
Daftar Pustaka

Campbell, N.A. Reece, JB, dan Mitchell, 2000. Biologi Edisi Kelima-Jilid I
Erlangga Jakarta.
Giri, Rahman EA. 2004. Regulasi Ekspresi Gen Pada Organisme Bakteri.
Bandung: KPP Bioteknologi Bandung.
Fessenden. 1990, Molecular and cellular biology. Wadsworth Publishing
Company. Belmont xvii 1145 hlm Istanti, Annie 1999 Biologi Sel
Malang jurusan Biologi EMIPA UM
Jusuf, M. 2001. Genetika 1. Sagung Seto, Jakarta,
Raven and Johnson. 2001 Biology 5th edition Me-Graw Hill Company, New
York.
Pratiwi, R. 2001. Mengenal Metode Elektroforesis. Oseana. Volume XXVI.
Nomor 1. Balitbang Biologi Laut, Puslitbang Osenologi LIPI, Jakarta
Sudarmadji, S., 1996. Teknik Analisa Biokimiawi. Edisi Pertama.Liberty.
Yogyakarta.
Sumitro, S.B, Fatchiyah, Rahayu, Widyarti, dan Arumningtyas. 1996. Kursus
Teknik-Teknik Dasar Analisis Protein dan DNA. Jurusan Biologi
FMIPA Universitas Brawijaya. Malang
Zubay, GL 1989. Biokimia Edisi ke-2. Perusahaan Penerbitan Mcmillan. New
York
 Lampiran

Gambar 1.1 Tahap Persiapan Sampel Gambar 1.2 Tahap Lysis

(Sumber: Dokumentasi Kelompok)

Gambar 2.1 Tahap DNA Blending Gambar 2.2 Tahap DNA Washing
(Sumber: Dokumentasi Kelompok)

Gambar 2.3 Tahap Elution

(Sumber: Dokumentasi Kelompok)
Gambar 3.1 Tahap Elektroforesis
(Sumber: Dokumentasi Kelompok)