LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

ISOLASI DNA TOTAL DAN KUANTIFIKASI DNA

KELOMPOK 5
NAMA ANGGOTA KELOMPOK:
1. JIHAN FAHIRA / 175070501111027
2. FATIMAH S HI LA HASAN / 1550705111009
3. DEWI MUTHIAH / 155070501111033

HARI & TANGGAL PRAKTIKUM: JUMAT, 31 AGUSTUS 2018

PROGRAM STUDI SARJANA FARMASI

JURUSAN FARMASI FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
TA 2018/2019
 LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER
ISOLASI DNA TOTAL DAN KUANTIFIKASI DNA

I. Tujuan Praktikum
1. Memahami konsep isolasi DNA total dari sel manusia
2. Mampu melakukan isolasi DNA total dari sel manusia

II. Dasar Teori

DNA atau asam deoksiribosa merupakan materi genetik yang bersifat
herediter pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah sel lengkap materi
genetik (DNA total) yang dimiliki seluruh organisme dan terorganisasi menjadi
kromosom (Nugroho,dkk,2016).
Prinsip dasar isolasi DNA adalah lisis sel (melisiskan DNA dari nukleus),
penghilangan protein dan RNA, pengendapan DNA/ presipitasi DNA, pencucian
DNA dari protein dan RNA dan pemanenan DNA. Tujuan dilakukan isolasi DNA
agar dapat diperoleh DNA total (genome) dengan konsentrasi tinggi dan bersih
dari kontaminasi (Rahayu,dkk, 2017).
Molekul DNA dalam suatu sel dapat diekstraksi atau diisolasi untuk berbagai
macam keperluan. Tujuan isolasi DNA yaitu untuk memisahkan DNA dari bahan
lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Prinsip utama dalam isolasi DNA ada
3 yakni penghancuran (lisis), ekstraksi, Pemurnian DNA (Dolphin,2008).

III. Alat dan Bahan

ALAT
1. Sentrifuga
2. Waterbath
3. Mikropipet
4. Wadah penampung
BAHAN
1. Rambut manusia (5 helai yang dicabut beserta akarnya)
2. Apusan bukal manusia
3. Larutan saline (20 g garam dalam 200 ml air)
4. Proteinase K
5. Tip
6. Mikrotube
7. TE buffer (harus dibuat segar, maks 1 jam sebelum penggunaan)
 1 ml 1 M tris HCl
 0,2 ml 0,5 M Na2 EDTA
 Tambahkan aquades sehingga volume akhir 100 ml
 Adjust dengan larutan buffer hingga mencapai ph 8,0
IV. Cara Kerja
a. Prosedur isolasi DNA dari sel bukal manusia
 Peserta berkumur dengan cairan saline 10 ml ± 60 detik

 Cairan saline dikeluarkan dan ditampung diwadah

 Wadah diputar perlahan untuk meresuspensi sel
 Diambil 1,5 ml dan dimasukkan dalam mikrotube
 Cairan disentrifugasi ± 2 menit dengan kecepatan max
 Supernatan dibuang dan cara 4 dan 5 diulang sebanyak 2 kali
 Resuspensi sel bukal dengan 140 µL buffer lisis
 Dihomogenasi dengan vorteks, ditambahkan 10 µL proteinase K 20
mg/mL
 Sampel diinkubasi pada waterbath selama 15 menit pada 55 ˚C
 Homogenasi sampel dengan vorteks selama 20 detik
 Inkubasi sample pada waterbath selama 15 menit pada 99˚C
 Sentrifugasi sel lisat selama 2 menit pada kecepatan 6000 rpm
 Supernatan dipindah pada tabung mikrosentrifuga

b. Isolasi DNA dari Rambut Manusia

Diambil 5 helai rambut, termasuk akarnya µL

 Rambut dipotong 1 cm dari bagian akar rambut

 Gunting menjadi bagian yang lebih kecil
 Sentrifuga dengan kecepatan max selama 10 detik
 Resuspensi potongan rambut dengan 140 µL buffer lisis
 Ditambah 10 µL proteinase K 20 mg/mL
 Sampel dihomogenasi dengan vorteks selama 20 detik
 Sentrifuga sampel dengan kecepatan max selama 10 detik
 Inkubasi sampel pada waterbath 55 ˚C selama 15 min
 Inkubasi sampel pada waterbath 99 ˚C selama 10 min
 Homogenasi sampel dengan vorteks selama 20 detik
 Sentrifugasi sel lisat selama 2 menit pada 6000 rpm
 Pindahkan supernatan pada tabung mikrosentrifuga
 DNA siap digunakan untuk proses selanjutnya (simpan pada suhu -20 ˚C

c. Kuantifikasi DNA

Pipet 1 µL sampel DNA yang akan ditentukan konsentrasinya

 Masukkan kedalam mikrotube baru yang berisi 99 µL aquades,

homogenkan, dengan demikian diperoleh sampel dengan faktor
pengenceran 100
 Ukur absorbansi sampel pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm
 Hitung konsentrasi dan kemurniaan sampel DNA
V. Hasil Praktikum

Kelompok Rambut Bukal

260 nm 280 nm 260 nm 280 nm
1 0,081 -0,021 0,058 -0,309
2 0,067 -0,250 0,136 -0,241
3 0,027 -0,197 0,051 -0,226
4 0,056 -0,273 -0,176 -0,446
5 0,065 -0,132 0,069 -0,166
6 0,018 -0,424 0,130 -0,231
7 0,100 -0,255 0,123 -0,274
8 0,074 -0,338 0,140 -0,382

Nilai kemurnian DNA/RNA

0,065 0,069
R= = 0,49 B= = 0,225
0,132 0,166

VI. Pembahasan
Pada praktikum kali ini dilakukan isolasi DNA genom Manusia dari sampel
rambut dan sel bukal manusia. Untuk mengisolasi DNA dari sel bukal manusia,
terlebih dahulu sampel yang akan digunakan berkumur dengan cairan saline 10
mL selama 60 detik, sehingga didapatkan suspensi keruh yang merupakan
campuran sel epitel yang meluruh, sel bakteri dan mikroorganisme, serta protein
dan ion-ion yang disekresikan oleh kelenjar saliva yang terdapat dalam rongga
mulut (Cole & Eastol, 1978). Banyaknya sel epitel yang dapat terambil dengan
cara berkumur pada jumlah air kumur dan waktu kumur. Makin lama waktu
kumur maka akan semakin banyak sel yang terambil. Makin banyak t air yang
digunakan untuk berkumur akan makin encer suspensi yang dihasilkan.
Setelah itu cairan yang didapat ditampung dalam wadah lalu diputar untuk
meresuspensi sel. Resuspensi bertujuan untuk mengoptimalkan kerja enzim.
Kemudian sampel diambil sebanyak 1,5 mL dan dimasukkan kedalam mikrotube,
lalu cairan sampel disentrifugasi selama 2 min dengan tujuan agar sel mengalami
lisis. Hasil yang diperoleh dari sentrifugasi adalah adanya supernatan yang jernih
dan dibagian bawahnya terdapat pelet berwarna putih dengan massa jenis lebih
besar dari supernatannya. Lalu setelah dilakukan sentrifugasi tiga kali dengan
sentrifugasi pertama dan kedua supernatannya dibuang, ditambahkan 140 µL
buffer lisis dengan tujuan untuk menjaga harga pH larutan. Kemudian divorteks
dengan tujuan untuk menghomogenkan larutan agar lisis dari sel sempurna.
Kemudian ditambahkan 10 µL proteinase K 20mg/mL dengan tujuan untuk
 memotong-motong atau memutus ikatan peptida dari protein-protein sel bukal
tersebut. Setelah itu dilakukan inkubasi selama 15 min pada suhu 55 ˚C untuk
mengoptimalkan kerja enzim yang sangat dipengaruhi oleh temperatur. Lalu
dihomogenasikan dengan vorteks selama 20 detik, diinkubasi pada suhu 99 oC,
dan sel lisat disentrifuga selama 2 menit dengan kecepatan 6000ppm sehingga
lisis dari sel sempurna dan dipindahkan kedalam mikrosentrifuga sehingga
didapatkan supernatannya yang jernih untuk kemudian digunakan dalam proses
selanjutnya. Hasil yang didapatkan adalah DNA siap guna yang disimpan pada
suhu -20 oC. Penyimpanan pada suhu -20 oC ini agar DNA tidak rusak.
Sedangkan pada isolasi DNA total rambut manusia, tahap pertama yang
dilakukan adalah memotong-motong rambut menjadi bagian yang lebih kecil dari
5 helai rambut sepanjang 1 cm dari akarnya. Tujuannya adalah mempermudah
merusak membran sel saat lisis sehingga DNA dapat keluar. Lalu disentrifuga
selama 1 menit untuk mengumpulkan potongan rambut pada bagian bawah
mikrotube. Lalu untuk mengoptimalkan kerja enzim, dilakukan resuspensi dengan
mempertahankan harga pH yaitu buffer lisis yang diberikan sebanyak 140 µL dan
ditambahkan 10 µL proteinase K 20mg/mL dengan maksud untuk memotong-
motong atau memutus ikatan peptida dari protein-protein sel rambut tersebut.
Kerja enzim sangat dipengaruhi oleh temperatur, maka untuk mengoptimalkan
kerjanya dilakukan inkubasi selama 15 menit pada suhu 55 oC. Lalu divorteks
selama 20 detik untuk menghomogenkan larutan agar lisis dari sel sempurna.
Kemudian diinkubasi lagi selama 15 menit pada suhu 55 oC, lalu dipindahkan
pada suhu 99 oC selama 10 menit. Kemudian dihomogenasikan menggunakan
vorteks selama 20 detik, sel lisat disentrifuga selam 2 menit pada kecepatan
6000rpm, dan dipindahkan pada mikrosentrifuga sehingga didapatkan supernatan
jernih tanpa pelet. Hasil yang didapatkan adalah DNA siap guna yang disimpan
pada suhu -20 oC. Penyimpanan pada suhu -20 oC ini agar DNA tidak rusak.

VII. Kesimpulan
……….

VIII. Daftar Pustaka

Campbell, Neil A et all. 2009.Biology Consepts and Connection. San
&ransico: Pearson Benjamin Cummings.

Cole, A.S., dan Eastol, J.E., “Biochemistry and oral biology”, Toppan Co.
Ltd., Singapore, 1978