LAPORAN PRAKTIKUM

BIOLOGI MOLEKULER
TRANSFORMASI DAN KONFIRMASI KEBERHASILAN
TRANSFORMASI

Nama : Nur Afni Helia Dewi

NIM : 191810401002

Laboratorium Bioteknologi
Jurusan Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Jember
2020
I. Judul : Transformasi Dan Konfirmasi Keberhasilan Transformasi.

II. Tujuan Praktikum : Mahasiswa mampu melakukan transformasi molekul

DNA suatu organisme ke dalam sel organisem lain di dalam suatu medium.

III. Alat dan Bahan

3.1 Alat : 1. Ependorf
2. Waterbath
3. Mikropipet
4. Tip (10-100 µl) dan (100-1000µl)
3.2 Bahan : 1. E. coli, strain DH5-ɑ
2. 50 mM CaCl₂ steril
3. Plasmid pGLO
4. Media LB: LB agar plate, LN agar plate+ampicillin, LB agar
plate+ampicillin+arabinosa

IV. Skema Kerja

Dimasukkan koloni tunggal E. coli DH5-ɑ dalam 250 µl CaCl₂ 50 mM di
tabung ependorf 1 dan ependorf 2

Diresuspensi dan diinkubasi on ice, 10 menit

Ditambahkan 10 µl plasmid pGLO, hanya pada ependorf 1, dipipeting

Diinkubasi kedua ependorf on ice, 15 menit

Diinkubasi 42ºC, 50 detik

 Diinkubasi on ice, 2 menit

Ditambahkan 250 µl media LB

Diinkubasi pada suhu ruang, 10 menit

Diambil 100 µl (ependorf 1) disebar pada media LB agar+ ampicillin dan

LB agar+ampicillin+arabinosa

Diambil 100 µl (ependorf 2) disebar pada media LB agar dan

LB agar+ampicillin

Diinkubasi 37 ºC, overnight

Hasil

V. Hasil dan Pembahasan

5.1 Hasil
Hasil yang didapat pada acara transformasi dan konfirmasi keberhasilan
transformasi berupa plate yang telah diinkubasi selama overnight dan akan di
visualisasikan dengan sinar UV .
5.2 Pembahasan
Praktikum kali ini dengan acara transformasi dan konfirmasi keberhasilan
transformasi akan membahas mengenai proses transfer molekul DNA serta fungsi
dari setiap perlakuan. Bahan yang digunakan pada acara ini adalah plasmid
pGLO, larutan CaCl₂, E. coli DH5-ɑ dan beberapa media LB. Alat yang gunakan
yaitu waterbath dan mikropipet dan lain-lain.
Menurut Sambrook dan Russel (2001), Plasmid adalah molekul DNA
ektrakromosomal yang memiliki ukuran bermacam-macam. Ukuran Plasmid yaitu
sekitar <1 kb hingga >200 kb. Plasmid dapat beruntai ganda, molekul sirkuler
yang tertutup secara rapat karena adanya ikatan kovalen. Plasmid dapat ditemukan
pada eukariot yaitu khamir. Gen yang berada didalam plasmid dapat memberikan
keuntungan pada bakteri yaitu resisten terhadap toksin, enzim retriksi dan
antibiotik. Menurut Casali dan Preston (2003), Sifat resisten antibiotik didalam
plasmid dapat digunakan untuk proses kloning gen dimana sebagai penanda
seleksi hasil dari tranformasi.
Menurut Reece dkk (2011), Plasmid yang digunakan dalam menyisipkan
DNA dari sumber lain ke dalam plasmid akan menjadi suatu molekul DNA yang
rekombinan sehingga bakteri yang sudah tertransformasi akan menjadi bakteri
rekombinan. Plasmid tersebut akan diwariskan ke generasi berikutnya sehingga
DNA asing serta gen-gen yang sudah dibawa akan dikloningkan. Kloning gen
merupakan produksi salinan dari satu gen tunggal secara banyak.
Menurut Brown (2010), Transformasi adalah suatu metode dimana
kemampuan bakteri dalam mengambil DNA asing ke dalam selnya. Kemampuan
bakteri tersebut dimanfaatkan dalam memperbanyak suatu gen. Menurut
Hardianto dkk (2012), Prinsip tranformasi yaitu mengekstraksi DNA asing ke
dalam sel bakteri melalui pori pada dinding serta membrane selnya dengan proses
heat shock sehingga dari proses masuknya molekul DNA asing ke dalam
protoplasma akan mengakibatkan perubahan materi genetiknya. Menurut Sword
(2003), Transformasi pada DNA rekombinan didalam plasmid dibutuhkan induksi
oleh zat-zat tertentu. Sel bakteri yang sudah mengalami perlakuan fisik sehingga
mampu dalam mengambil DNA asing merupakan sel kompeten.
 Menurut Casali dan Preston (2003), Transformasi dilakukan beberapa cara
seperti heat shock, coldshock dan eletroporasi. Metode heat shock salah satu
metode yang sering dan mudah dilakukan jika dibandingkan dengan metode
lainnya. Prinsip yang digunakan yaitu kejutan dengan suhu 42ºC selama 90 detik
atau 120 detik dimana dinding sel bakteri akan terbuka dan plasmid akan mudah
masuk ke dalam sel. Transformasi membutuhkan persiapan sel dimana sel
direndam pada larutan garam dan dibuat dalam kondisi dingin terlebih dahulu
dengan suhu 4ºC.
Tahap pertama dalam transformasi yaitu memasukkan E. coli DH5-ɑ kedalam
larutan CaCl₂. Menurut Masfuroh dkk (2017), Penambahan larutan kalsium
klorida digunakan untuk mengganggu keseimbangan kalsium di dalam membrane
yang akan mengakibatkan membrane akan terbuka dan DNA insert akan masuk.
Menurut Sword (2003), larutan kalsium klorida dapat mengikat DNA serta
komponen lipopolisakarida dari dinding sel bakteri yang bermuatan negatif dan
Menurut Brown (2010), juga dapat meningkatkan permeabilitas membrane sel
yang menyebabkan plasmid dapat masuk ke dalam sel bakteri. Langkah
berikutnya dengan meletakkan atau menginkubasi on ice 4ºC yang bertujuan yaitu
Menurut Hardianto dkk (2012), agar terjadi kejutan suhu pada saat sel kompeten
ditempatkan pada suhu 42ºC. Langkah selanjutnya pada kontrol positif (ependorf
1) ditambahkan plasmid pGLO. Menurut Bassiri (2011), Plasmid pGLO
merupakan plasmid termutagenasi dimana plasmid pGLO membawa gen β-
laktamase untuk resisten terhadap ampicillin (AmpR) dan terdapat gen yang
mengkode protein fluoresen hijau (GFP) dan operon arabinosa repressor (araC).
Langkah selanjutnya dilakukan inkubasi (on ice) kembali pada kedua kontrol
(positif dan negative) selama 15 menit.
Tahap selanjutnya dilakukan proses heat shock pada suhu 42ºC yang
bertujuan yaitu Menurut Hyde (2009), memasukkan plasmid ke dalam sel bakteri
pada saat dinding sel terbuka akibat perubahan suhu yang signifikan, dan langkah
selanjutnya dilakukan pendinginan kembali (on ice). Menurut Richer dkk (2010),
Sel kompeten yang diberi perlakuan heat shock tetap hidup disebabkan
mengekspresikan protein kejutan panas (HSPs) yang merupakan protein yang
dihasilkan akibat sel dalam kondisi stress terhadap suhu. HSPs bersifat chaperone
yang dapat melipat beberapa protein lain di dalam sel yang mengakibatkan protein
sel tidak rusak akibat paparan panas.
Tahap berikutnya yaitu ditambahkan media cair (LB) pada kedua kontrol
(positif dan negative) dan diinkubasi pada suhu ruang. Tujuan tahap inkubasi
pada suhu ruang dilakukan yaitu Menurut Hardianto dkk (2012), untuk menjaga
atau memelihara sel bakteri dalam media setelah diberikannya perlakuan.
Langkah selanjutnya diambil 100µl preparasi transformasi positif (ependorf 1)
dan disebar pada media LB agar+ampicillin dan LB agar+ampicillin+arabinosa
sedangkan preparasi transformasi negative (ependorf 2) disebar pada media LB
agar dan LB agar+ampicillin. Inkubasi plate pada suhu 37ºC selama overnight.
Keberhasilan transformasi dapat diamati secara langsung pada morfologi
koloni bakteri. Menurut Hardianto dkk (2012), Dalam membedakan sel yang telah
mengalami transformasi dan tidak mengalami digunakan suatu penanda seleksi
yang telah dibawa oleh plasmid. Plamid yang digunakan pada praktikum kali ini
yaitu pGLO yang telah membawa gen GFP dengan araC sebagai pengatur
ekspresi gen GFP dan gen β-laktamase untuk resisten terhadap ampicillin
(AmpR). Menurut Henunili (2013), Penanda yang telah dibawah oleh plasmid
seperti penanda resisten terhadap antibiotic ini lah yang digunakan sebagai
pembeda antara sel yang sudah tertransformasi dan yang tidak tertransformasi.
Hasil transformasi yang didapatkan pada acara kali ini yaitu didapatkan
koloni E. coli (kontrol positif) yang tumbuh pada media LB
agar+ampicillin+arabinose dengan memendarkan warna hijau ketika proses
visualisasi UV dan koloni pada media LB agar+ampicillin juga tumbuh tetapi
tidak memendarkan ketika dilakukan visualisasi sinar UV. Menurut Langden dkk
(2017), Koloni yang tumbuh pada media ampicillin telah menunjukkan resistensi
terhadap keberadaan ampicillin sehingga sebagai penanda bahwa plasmid vector
telah berhasil masuk ke dalam sel E. coli yang mampu terekspresikan. Gen AmpR
pada plasmid vector yang dapat menyebabkan bakteri E. coli dapat tumbuh pada
media yang mengandung ampicillin. Terpendarnya warna hijau pada proses
visualisasi sinar UV disebabkan adanya kandungan arabinose pada media.
Menurut Bassiri (2011), Plasmid vector mengandung operon arabinosa repressor
(araC) dimana akan mengkode protein fluoresen hijau (GFP) sehingga pada saat
divisualisasikan akan memendarkan warna hijau.
Hasil transformasi (kontrol negative) juga menunjukkan yaitu pada media
LB+ampicillin tidak ada pertumbuhan bakteri E. coli dan pada media LB agar
bakteri E. coli dapat tumbuh dengan baik. Menurut Langden dkk (2017), Kontrol
negative pada sel kompeten E. coli tidak dapat tumbuh disebabkan adanya
kandungan ampicillin pada media yang menunjukkan bahwa E. coli tidak
memiliki kemampuan resistensi terhadap ampicillin pada media sedangkan pada
media yang tidak mengandung ampicillin bakteri E. coli dapat tumbuh karena
tidak terdapat kandungan ampicillin pada media tumbuhnya.

VI. Kesimpulan
Praktikum kali ini dengan acara transformasi dan konfirmasi keberhasilan
transformasi dapat ditarik kesimpulan bahwa dalam melakukan transformasi
menggunakan metode heat shock (kejutan panas) dalam memasukkan DNA asing
(Plasmid pGLO) ke dalam sel bakteri E. coli. Transformasi juga menggunakan
larutan CaCl₂ yang digunakan untuk mengganggu keseimbangan kalsium di dalam
membrane yang akan mengakibatkan membrane akan terbuka dan DNA insert
akan masuk. Keberhasilan transformasi dapat diamati secara langsung pada
morfologi koloninya yaitu dapat tumbuh pada media yang mengandung
ampicillin.
 DAFTAR PUSTAKA

Bassiri, A. E. 2011. pGLO Mutagenesis: A Laboratory Procedure in Molecular

Biology for Biology Students. Jurnal BAMBED, (39) 6: 432-439.

Brown, T. A. 2010. Gene Cloning and DNA Analysis. United Kingdom: Wiley –
Blackwell.

Casali, N. dan Preston, A. 2003. E. coli plasmid vectors: methods and

applications. New Jersey: Humana Press.

Hardianto, D. dkk. 2012. Transformasi Plasmid PTRLI Dengan Teknik

Elektroporasi Pada Aspergillus terreus Dan Uji Stabilitas Transforman.
Jurnal Sains dan Teknologi Indonesia, (14) 1: 24-28.

Henunili, V. 2013. Genetika Molekular. Yogyakarta: Diktat Kuliah FMIPA Jurdik

Biologi Universitas Negeri Yogyakarta.

Hyde, D. R. 2009. Introduction to Genetic Principle. New York : McGraw-Hill

Companies Inc.

Langden, S. S. dkk. 2017. Transformasi Dan Kloning Plasmid PJ804: 77539 Pada
E. coli TOP’10. Jurnal Biologi, (6) 1: 65-70.

Masfuroh dkk. 2017. Konstruksi Plasmid PRHA Sebagai Pembawa Gen ARAA
Penyandi Enzim L-Arabinosa Isomerase dari Thermotoga thermarum. Jurnal
Biologi, (6) 3: 57-65.

Reece, J. B. dkk. 2011. Campbell : biology, ninth edition. San Fransisco: Pearson
Education Inc.

Ritcher, K. dkk. 2010. The Heat Shock Response : Life On The Verge of Death.
Molecular cell, (40) 1: 253 – 266.

Sambrook, J. dan Russel. 2001. Molecular Cloning- A Laboratory Manual. New

York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Sword, W. E. 2003. Chemical transformation of E. coli. New Jersey: Humana
Press.