ISOLASI DNA, UJI ELEKTROFORESIS DAN UJI SPEKTROFOTOMETRI

LAPORAN PRAKTIKUM
Diajukan untuk memenuhi salah satu tugas mata kuliah Genetika
Dosen Pengampu :
Dr. Hj. Diah Kusumawaty, M.Si
Dr. H. Riandi, M. Si

Oleh :
Kelompok 6
Biologi C 2014
Amanda Adistya 1401826
Eka Indah C T 1403692
Fajar Sukma P 1406487
Julia Francesca 1407073
Kezia Reinaria 1406598
Nadiah Rohadatul A 1400881
Rena Marwina 1400826
Rila Nadhira Dahlan 1401415
Yeyen Wijaya 1400241

PROGRAM STUDI BIOLOGI

DEPARTEMEN PENDIDIKAN BIOLOGI
FAKULTAS PENDIDIKAN MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS PENDIDIKAN INDONESIA
BANDUNG
2016
A. Judul

Isolasi DNA, Uji Elektroforesis dan Uji Spektrofotometri

B. Tujuan
1. Bagaimana cara melakukan isolasi DNA tanaman cabai?
2. Bagaimana teknik pemisahan senyawa dengan metode elektroforesis?
3. Bagaimana cara mengukur fragmen DNA dengan spektrofotometer?

C. Waktu Pelaksanaan

Praktikum Genetika dengan materi Isolasi DNA dan Uji Elektroforesis telah
dilaksanakkan pada:
Hari : Kamis
Tanggal : 22 dan 29 November 2016
Waktu : 13.00 – 14.40 WIB
Tempat : Laboratorium Mikrobiologi FPMIPA UPI

D. Landasan Teori
Molekul DNA dalam suatu sel dapat diekstraksi atau diisolasi untuk
berbagai macam keperluan seperti amplifikasi dan analisis DNA melalui
elektroforesis. Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA
dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Prisnsip utama dalam
isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan
DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA
(Corkill dan Rapley, 2008). Menurut Surzycki (2000), ada beberapa hal yang
perlu diperhatikan dalam proses isolasi DNA :
a. Menghasilkan DNA tanpa adanya kontaminan seperti protein dan RNA
b. Metode harus efektif dan bisa dilakukan untuk semua spesies metode
yang dilakukan tidak boleh mengubah struktur dan fungsi molekul DNA
c. Metode sederhana dan cepat.
 Isolasi DNA tanaman, isolasi DNA buah, isolasi DNA bakteri, dan isolasi
DNA hewan pada dasarnya memiliki prinsip yang sama. Prisnsip isolasi DNA
pada berbagai jenis sel atau jaringan pada berbagai organisme pada dasarnya sama
namun memiliki modifikasi dalam hal teknik dan bahan yang digunakan. Bahkan
beberapa teknik menjadi lebih mudah dengan menggunakan kit yang diproduksi
oleh suatu perusahaan sebagai contoh kit yang digunakan untuk isolasi DNA pada
tumbuhan seperti Kit Nucleon. Namun tahapan-tahapan isolasi DNA dalam setiap
langkahnya memiliki protokol sendiri yang disesuaikan dengan keperluan.
Penggunaan teknik isolasi DNA dengan kit dan manual memiliki kelebihan dan
kekurangan. Metode konvensional memiliki kelebihan harga lebih murah dan
digunakan secara luas sementara kekurangannya membutuhkan waktu yang relatif
lama dan hasil yang diperoleh tergantung jenis sampel.
Elektroforesis berasal dari bahasa Yunani yang mempunyai arti transport atau
perpindahan melalui partikel-partikel listrik. Elektroforesis adalah suatu cara
analisis kimiawi yang didasarkan pada pergerakan molekul-molekul protein
bermuatan di dalam medan listrik (titik isoelektrik). Pergerakan molekul dalam
medan listrik dipengaruhi oleh bentuk, ukuran, besar muatan dan sifat kimia dari
molekul. Molekul terlarut dalam medan listrik bergerak atau migrasi dengan
kecepatan yang ditentukan oleh rasio muatan dan massa. Sebagai contoh jika dua
molekul mempunyai massa dan bentuk yang sama, molekul dengan muatan lebih
besar akan bergerak lebih cepat ke elektrode. Bila arus listrik dialirkan pada suatu
medium penyangga yang telah berisi protein plasma maka komponen-komponen
protein tersebut akan mulai bermigrasi. Kecepatan molekul yang bergerak pada
medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian
elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan
asam nukleat). Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan
pewarnaan atau autoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan
densitometer (Magdeldin, 2012).
Dasar elektroforesis adalah pembentukan suatu ke tidak homogenan atau
gradasi konsentrasi sepanjang sistem. Koloid, protein enzim menunjukkan
mobilitas elektroforesis spesifik dan titik isoelektrik yang dapat digunakan untuk
identifikasi zat-zat spesifik. Pemisahan dapat dilakukan bila senyawa-senyawa
yang telah terpisah tidak secara spontan bercampur kembali akibat sirkulasi
konvektif. Pada elektroforesis, medan listrik dialirkan pada suatu medium yang
mengandung sampel yang akan dipisahkan (Martin, 1996).
Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-partikel
bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub
positif (anode), sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan
bergerak menuju kutub negatif (anode). Prinsip inilah yang dipakai dalam
elektroforesis untuk memisahkan molekul-molekul berdasarkan muatannya
sehingga pergerakan molekul-molekul tersebut pada suatu fase diam (stationary
phase) dalam sebuah medan listrik akan berbeda-beda. Oleh karena partikel sol
bermuatan listrik, maka partikel ini akan bergerak dalam medan listrik.
Kemampuan perpindahan pergerakan muatan molekul tersebut menuju ke arah
kutub yang berlawanan merupakan suatu parameter kecepatan dalam proses
elektroforesis yang dinyatakan sebagai mobilitas elektroforetik (Lisdiyanti, 1997).
Teknik elektroforesis dapat dibedakan menjadi dua cara, yaitu : elektroforesis
larutan dan elektroforesis daerah. Pada teknik elektroforesis larutan, larutan
penyangga yang mengandung makro-molekul ditempatkan dalam suatu kamar
tertutup dan dialiri arus listrik. Kecepatan migrasi dari makro-molekul diukur
dengan jalan melihat terjadinya pemisahan dari molekul (terlihat seperti pita) di
dalam pelarut. Sedangkan teknik elektroforesis daerah adalah menggunakan suatu
bahan padat yang berfungsi sebagai media penunjang yang berisi (diberi) larutan
penyangga. Media penunjang yang biasa dipakai adalah gel agarose, gel pati, dan
kertas sellulose poliasetat (David, 2009).
E. Alat dan Bahan

Tabel E.1. Alat yang digunakan.

No Nama Alat Jumlah

1. Mikropipet berbagai ukuran 2 buah

2. Pipet berukuran 1 buah

3. Tabung 1,5 ml 10 buah

4. Tips mikropipet berbagai ukuran 10 buah

5. Saringan 2 buah

6. Gelas kimia 2 buah

7. Sendok 1 buah

8. Penangas 1 buah

9. Vorteks 1 buah

10. Mini sentrifugal 1 buah

11. Blender/lumpang 1 buah

12. Elektroforesis unit (meliputi comb dan tray) 1 unit

13. Power supply 1 unit

14. Transilluminator UV 1 unit

15. Alat Spektrofotometer 1 unit

16. Cuvet 1 buah

17. Alat PCR 1 unit

Tabel E.2. Bahan yang digunakan.
No Nama Bahan Jumlah

1. Buah-buahan/sayuran 10 mL

2. EB 10 mL

3. FATG1 10 mL

4. Proteinase K 10 mL

5. FATG2 10 mL

6. ETOH 20° 100% 10 mL

7. W1 10 mL

8. Washing Buffer 10 mL

9. Buffer TBE 10 mL

10. Loading dye 10 mL

11. DNA marker 10 mL

12. Agarose 10 mL

13. Etidium Bromida 10 mL

14. ddH2O 10 mL
F. Langkah Kerja
F.1 Langkah Kerja Isolasi DNA

Prinsip Kerja : Memisahkan DNA dengan zat lain dengan melisiskan membran
dan dinding sel, mensentrifugasi dan menggumpalkan DNA.
 F.2 Langkah Kerja Elektroforesis DNA

Prinsip Kerja : Migrasi DNA dari muatan negative ke positif.

F.3 Langkah Kerja Spektrofotometer

Sampel dimasukkan
ke dalam tabung 1,5
ml sebanyak 1 µL.
Cuvet yang berisi
Ditambahkan 499 sampel dan ddH2O
µL ddH2O ke dalam dimasukkan ke alat
tabung. Dan Spektrofotometer, dan
dipindahkan ke ditunggu hinga hasil
cuvet. keluar.

Prinsip Kerja : Pengukuran konsentrasi dan Kemurnian DNA dengan absorbansi

panjang gelombang.
F. Hasil Pengamatan

Tabel F.1. Hasil pengamatan Isolasi DNA

Foto Hasil Pengamatan Keterangan

Proses pemasukan EB 50µl

Larutan bening

DNA

Gambar 1. Hasil Isolasi Sample DNA

Tumbuhan Kelompok 5
(Dokumentasi Pribadi, 2016)

Tabel F.2. Hasil pengamatan Elektroforesis DNA

Foto Hasil Pengamatan Keterangan

Kontrol fragmen-fragmen
DNA

Fragmen DNA yang

banyak terurai dan
kurang sempurna dialami
semua kelompok

Hasil kelompok 5 dengan

smear paling tipis karena
kesalahan penetesan pada
sumur yang kurang baik
dan jumlah DNA yang
Gambar 2. Hasil Elektroforesis Sample memang sedikit.
DNA Kelas Biologi C 2014
(Dokumentasi Pribadi, 2016)
 Tabel F.3. Hasil pengamatan Spektofotometri sample DNA

No Sample Dokumentasi Hasil Keterangan Kemurnian

Spektrofotometri Konsentrasi

1. Hasil no 1-3 Untuk

Untuk kelompok
1 kelompok 5

Konsentrasi
Hasil no 4-6
Untuk kelompok A260/A280
2
= 0,005/0,005
Gambar 3.
Pemasukan Sample Hasil no 7-9 = 1,000
Untuk kelompok
DNA Kelompok 5 3
pada alat
spektofotometri Kemurnian
Hasil no 17-19
Untuk kelompok A260x 50 x e
(Dokumentasi 6
Pribadi, 2016) = 0,005 x 50
Hasil no 21-23 x500
Untuk kelompok
4 = 125

Hasil no 24-26
Untuk kelompok
Gambar 4. Hasil 5
Spektrofotometri Sample
DNA Kelas Biologi C 2014

(Dokumentasi Pribadi,
2016)
G. Pembahasan
Isolasi DNA bertujuan untuk pemisahan DNA dari bahan lain, contohnya
protein, lemak dan karbohidrat. Isolasi DNA ini dapat menggunakan berbagai
macam bahan yang memiliki fungsi tertentu. Bahan-bahannya, yaitu Tris yang
berfungsi untuk mendenaturasi protein, EDTA sebagai penghancur sel dengan
cara mengikat ion magnesium yang diperlukan oleh sel untuk menjaga
keutuhan selubung sel, SDS berfungsi untuk melisiskan membran sel dan
mengurangi aktivitas enzim nuclease (enzim pendegradasi), NaCl sebagai
bahan penetral pada gula phosphate DNA, alcohol 70% sebagai pemurnian
DNA. (Lubis dan Gurusinga, 2013).
Terdapat tiga prinsip utama dalam isolasi DNA, yaitu penghancuran
(lisis), ekstaraksi (pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan
protein), dan pemurnian DNA. (Corkill dan Rapley, 2008)
Dari hasil pengamatan yang dilakukan dalam praktikum isolasi DNA
terdapat bahwa teknik mengisolasi dilakukan harus dengan cara yang sangat
higienis dan telaten.Terbukti pada saat pengadukan atau penghalusan
(blender)harus dilakukan sampai daun tanaman halus agar DNA dapat
terisolasi (DNA terpisah dari partikel lain yang tidak diinginkan). Pada
pengamatan yang dilakukan kelompok kami, terjadi kesulitan saat
menghaluskan daun tanaman sehingga memengaruhi hasil saat pengamatan
dengan menggunakan elekotroforesis.
Dasar elektroforesis adalah pembentukan suatu ke tidak homogenan atau
gradasi konsentrasi sepanjang sistem. Koloid, protein enzim menunjukkan
mobilitas elektroforesis spesifik dan titik isoelektrik yang dapat digunakan
untuk identifikasi zat-zat spesifik. Pemisahan dapat dilakukan bila senyawa-
senyawa yang telah terpisah tidak secara spontan bercampur kembali akibat
sirkulasi konvektif. Pada elektroforesis, medan listrik dialirkan pada suatu
medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan (Martin, 1996).
Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-partikel
bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju
kutub positif (anode), sedangkan partikel- partikel bermuatan positif (kation)
akan bergerak menuju kutub negatif (anode). Kemampuan perpindahan
pergerakan muatan molekul tersebut menuju ke arah kutub yang berlawanan
merupakan suatu parameter kecepatan dalam proses elektroforesis yang
dinyatakan sebagai mobilitas elektroforetik (Lisdiyanti, 1997).
Dari hasil elektroforesis DNA agarose dapat dilihat migrasi elektroforesis
DNA melalui gel agarose dipengaruhi oleh faktor ukuran dan konformasi
molekul DNA, konsentrasi agarose, arus listrik, dan temperatur (Lubis, et. al.,
2013). Namun, pada hasil praktikum kelompok terjadi kegagalan pada hasil
akhirnya. Didapatkan bahwa strip DNA yang ada sangatlah tipis. Hal ini
dikarenakan oleh beberapa kemungkinan yang ada baik saat penetesan pada
sumur yang kurang baik dan jumlah DNA yang memang sedikit. Hal ini
menyebabkan benang DNA yang teramati setelah proses elektroforesis
sangatlah sedikit. Selain sangat tipis stip DNA juga tidak hanya satu strip
tetapi ter-smear, yang menunjukan bahwa teknik yang digunakan mungkin
kurang rapih dan teliti sehingga hasilnya DNA ter-smear.
Sedangkan pada hasil pengamatan dari spektofotometri didapatkan bahwa
kandungan DNA terdapat dibawah batas normal. Pada kelompok kami
didapatkan nilai konsentrasi sebesar 1. Hal ini membuktikan bahwa DNA
yang terdapat pada sampel sangatlah sedikit, karena seharusnya normalnya
jumlah konsentrasi DNA dikisaran 1,8-2,0. Tetapi hasil spektofotometri dan
elektroforesis dari kelompok kami sangatlah berbeda, karena saat hasil
elektroforesis, pita DNAnya malah tidak terlihat/sangat tipis, yang
menandakan bahwa DNA yang terdapat sangat sedikit. Jika dibandingka
dengan kelompok lain, dalam hasil elektroforesis, kelompok kami hasil pita
DNAnya paling tipis, sementara dari hasil uji kuantitatif yaitu
spektofotometri, kelompok kami nilai konsentrasi DNAnya paling besar. Hal
ini dapat disebabkan oleh banyak hal salah satunya, saat memasukan ke sumur
agarose sampel yang terambil bukanlah sample yang mengandung banyak
DNA atau saat memasukan agarose sample yang dimasukkan kurang rapih
sehingga banyak yang tumpah keluar.
H. Jawaban Pertanyaan

Pertanyaan tentang Isolasi DNA

1. Hitunglah jumlah senyawa yang dimasukkan pada tahapan kerja nomer 5,
14, dan 18 (tahapan yang ada dibuku)!
Jawab :
- Pada tahapan kerja nomor 5, buffer ekstraksi yang ditambahkan adalah
sebanyak 400 µL dikarenakan sayuran yang dimasukkan ke dalam
tabung1,5 ml sebanyak 100 µL
- Pada tahapan kerja nomor 14, kloroform: isoamil alcohol (24:1) yang
ditambahkan adalah sebanyak 260µl. dikarenakan jumlah volume total
sampel adalah 520 µl, dari berbagai larutan yang dimasukkan.
- Pada tahapan kerja nomor 18, alcohol yang ditambahkan adalah
sebanyak: 1560 µl dikarenakan jumlah volume total yang sudah
ditambahkan kloroform: isoamil alcohol sebanyak 260 µl, sehingga
volume total sampel sebanyak 780 µl lalu dikalikan minimal 2x

2. Jelaskan apa fungsi senyawa-senyawa yang digunakan dalam proses isolasi

DNA!
Jawab :
- Buffer ekstraksi : untuk melisiskan membran sel dan membran
fosfolipid bilayer.
- Potassium asetat : berikatan dengan debris sel dan protein sehingga
membentuk senyawa kompleks dengan CTAB-Potassium asetat-
protein-debris sel.
- SDS 20% : pelarut lipid dari membran sel, melisiskan dinding sel dan
mendenaturasi protein.
- Kloroform & Isoamil alcohol : mendenaturasi protein yang masih
menempel pada kromosom dan mengekstrak dan dan mengendapkan
komponen polisakarida di dalam buffer ektraksi yang
mengkontaminasi larutan DNA.
- Alcohol : mempresipitasi asam nukleat.
 - CTAB atau Cetyl trimethylammonium bromide merupakan sejenis
deterjen yang dapat mendegradasi dinding sel, denaturasi protein,
memisahkan karbohidrat, merusak membran sel dan melarutkan DNA.
- TE tris electrophoresis berfungsi untuk melarutkan DNA yang
dihasilkan dan menjaga DNA agar tidak mudah rusak. Dalam buffer
TE mengandung EDTA atau Ethylene Diamine Tetra Acid yang
berfungsi sebagai senyawa pengkelat yang mengikat ion Magnesium,
yaitu kofaktor yang diperlukan untuk altivtas berbagai enzim nuclease.

Pertanyaan tentang Elektroforesis DNA

1. Coba sebutkan manakah yang disebut DNA pada hasil elektroforesis Anda!
Jawab :

Pita DNA yang

banyak terurai
dan kurang
sempurna

2. Mengapa DNA Anda hanya dapat diamati dengan bantuan sinar UV?
Jelaskan!
Jawab :
Molekul DNA yang berukuran kecil dan sulit diamati hanya dapat diamati
dengan bantuan sinar ultraviolet karena pada pewarnaan molekul DNA
tersebut menggunakan zat pewarna etidium bromida dan etidium bromida
yang akan berinteraksi dengan basa dari molekul DNA dan akan
 memberikan warna orange fluoresance yang dapat dilihat dengan bantuan
sinar ultraviolet.

3. Apakah etidium bromida? Bagaimana cara kerja etium bromida dalam

proses pewarnaan DNA?
Jawab :
Etidium merupakan sebuah molekul yang dapat mengikat kuat pada
DNA. Molekul etidium berpendar fluor ketika diiluminasi dengan cahaya
ultraviolet (UV) pada kisaran visible UV. Untuk memvisualisasi potong-
potongan DNA yang telah di pisahkan pada gel elektroforesis.
Etidium mengikat dengan cara menyisip di antara ikatan basa pada untai
ganda DNA. Etidium dapat membentuk kontak van der Walls tertutup
dengan pasangan basa dan karena Struktur cincin etidium adalah
hidrofobik dan mirip dengan struktur cincin pada DNA. Hal ini merupakan
jawaban bahwa mengapa etidium mengikat pada lokasi hidrofobik
molekul DNA. (Addy, 2009)

I. Kesimpulan
Maka kesimpulan dari praktikum ini :
1. Isolasi DNA tanaman cabai dengan cara penghancuran (lisis), ekstraksi
(pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein), dan
pemurnian DNA.
2. Teknik pemisahan DNA dengan cara pemisahan dapat dilakukan bila
senyawa-senyawa yang telah terpisah tidak secara spontan bercampur
kembali akibat sirkulasi konvektif. Pada elektroforesis, medan listrik
dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan
dipisahkan.
3. Panjang fragmen DNA dapat terlihat dengan menggunakan gel doc yang
pada saat didalamnya disinari dengan menggunakan sinar UV, yang
sebelumnya dilakukan tahap elektroforesis.
 DAFTAR PUSTAKA

Corkill, G., Rapley, R. 2008.The Manipulation of Nucleic Acids: Basic Tool and
Tchniques in Molecular Biomethods Handbook Second Edition. Ed:
Walker, J.M. ,Rapley, R. Humana Press, NJ, USA.
David G. Watson. 2009. Analisis Farmasi. Jakarta : EGC
Lisdiyanti. Polymerase Chain Reaction: Cara Mudah Memperbanyak DNA. Bogor:
Warta Biotek, 1997.
Lubis, N. A. & Gurusinga, F. P. (2013). Isolasi DNA Manusia (Epitelial Mulut dan Darah)
dan Teknik PCR dan Isolasi Protein dari Darah, Elektroforesis Agarose Dan Sds-Page.
[Online]. Tersedia: http://openwetware.org/images /8/8f/ (13 Desember 2016)
Magdeldin, Sameh. Gel Electrophoresis-Principles and Basics. Rijeka: InTech
Publisher, 2012.
Martin, R. Gel electrophoresis: Nucleid acids. Oxford: Bros Scientific Publishers
Ltd., 1996
Surzycky, R. 2000. Molecular and Celullar Biology.Wadsworth Inc. Belmont.