ISOLASI DNA

Oleh :
Nama : Nurika Ciptaningsih
NIM : B1J010234
Rombongan :I
Kelompok : 6
Asisten : Kiki Ayuningrum

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS BIOLOGI
PURWOKERTO
2012
 I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi

genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis
seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA pada organisme
tingkat tinggi seperti manusia, hewan dan tumbuhan terdapat di
dalam inti sel dan beberapa organ lain di dalam sel seperti
mitokondria dan kloroplast, sehingga penyebutan nama DNA
juga didasarkan pada lokasi asalnya. DNA genome inti (nuclear
DNA genom) berasal dari inti sel, DNA genom mitokondria
(mitochondrial DNA genom) berasal dari mirikondria serta DNA
genom kloroplast berasal dari kloroplast (Windiastika, 2012).

Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah

satu prinsisp isolais DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi
merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan
berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat
molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul
ringan akan berada pada bagian atas tabung I (Adityawarman,
2010). Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi
yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada
bagian bawah (Campbell, 2002).

Isolasi DNA dengan teknik sentrifugasi akan

mengendapkan DNA. Proses isolasi DNA dicampur dengan
berbagai macam larutan supaya hasil isolasi berupa DNA murni
yang tidak tercampur dengan molekul-molekul lain. Larutan A
berfungsi sebagai resuspensi yaitu penggabunagn kembali pelet
yang telah terbentuk dengan larutan yang dicampurkan. Selain
itu larutan A juga berfungsi sebagai buffer. Pemilihan buffer
tersebut dilihat dari kemampuan buffer menghasilhkan arus
listrik. Larutan B yang terdiri atas SDS dan NaOH berfungsi
sebagai larutan pelisis. NaOH sendiri dapat mendenaturasi
protein. Larutan C berfungsi untuk merenarutasikan kembali.
Etanol 70% yang digunakan dalam proses isolasi berfungsi untuk
mengeluarkan endapan garam karena Na+ bermuatan positif dan
DNA bermuatan negatif. Larutan ddH2O yang ditambahkan
berfungsi agar endapan DNA yang dihasilkan didapat dengan
konsentrasi yang cukup tinggi. Larutan di vortex untuk
memudahkan bakteri tersuspensi. Bakteri yang telah diendapkan
tersebut lisis dengan penambahan larutan buffer, agar proses
lisisnya bakteri sempurna maka larutan dibolak-balik secara
halus. Bakteri yang telah lisis ini ditandai dengan munculnya
lendir. Cairan DNA yang dihasilkan kemudina dipisahkan dari
endapannya. Cairan ini ditambahkan RNAse untuk melisiskan
RNA supaya hasil yang diisolasi berupa DNA murni (Pradika,
2008).

DNA yang telah diisolasi diuji kualitas dan kuantitasnya

melalui elektroforesis dan spektrofotometer. Elektroforesis
memisahkan DNA, RNA, dan protein berdasarkan bobot molekul
dan muatanya dengan menggunakan media pemisah. DNA
bermuatan negatif sehingga pada elektroforesis DNA akan
bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan
pergerakan ini tergantung pada ukuran molekul DNA, kerapatan
media gel yang dilalui DNA, serta arus listrik yang diberikan
untuk bermigrasi molekul DNA. Sebelum proses elektroforesis,
suspensi DNA dicampur dengan larutan peyangga muatan
berwarna loading dye. Penambahan warna ini berfungsi untuk
menambah densitas sehingga DNA bearada di bagian bawah
sumur, selain itu pewarna ini digunakan untuk memudahkan
meletakan contoh DNA ke dalam sumur dan bergerak ke arah
 anoda dengan laju yang dapat diperkirakan sehingga dapat
digunakan sebagai tanda migrasi DNA (Arumingtyas, 2011).

Menurut Pradika (2008) ada sejumlah tujuan dari isolasi DNA,

antara lain:

* Visualisasi DNA dengan elektroforesis gel.

* Peninjauan pola fragmen DNA hasil pemotongan secara

enzimatik melalui teknik Hibridisasi Southern.

* Isolasi DNA genomik dalam rangka pembuatan pustaka

genomik.

* Isolasi plasmid atau DNA fage dalam prosedur rutin peminakan

DNA.

* Isolasi DNA yang diperlukan sebagai cetakan (template) dalam

prosedur perbanyakan DNA secara in vitro melalui teknik PCR.

Setiap penggunaan DNA yang beragam membutuhkan

persyaratan kualitas DNA yang berbeda. Kualitas DNA tersebut
ditentukan oleh hal-hal berikut:

* Kemurnian
* Panjang DNA
* Kemampuan untuk dipotong oleh sembarang enzim
* Tidak mengalami modifikasi kimiawi selama proses isolasi
berlangsung (Pradika, 2008).

B. Tujuan

Tujuan praktikum acara isolasi DNA adalah mengisolasi

DNA kromosom buah dan bakteri, mengetahui prinsip dan proses
isolasi DNA kromosom.
 II. MATERI DAN METODE

A. Materi

Materi yang digunakan adalah buah strawberry, buah

naga, buah alpukat, buah manga, bawang bombay, kultur atau
koloni bakteri Escherichia coli, deteren cair, alkohol 96%, NaCl
(garam dapur), akuades, tendelizer. Alat yang digunakan adalah
kantung plastik, blender, gelas beaker (200 ml), kain kasa
(perban), corong plastik, tabung eppendorf, rak plastik, pipet
plastic, jarum ose, penangas air, mikrosentrifuge, sarung tangan,
kamera digital.
B. Metode

Cara kerja praktikum isolasi DNA buah naga adalah sebagai

berikut :
1. Satu potong buah naga dimasukkan ke dalam kantung plastik.
2. Satu sendok NaCl dan 90 ml akuades dimasukkan ke dalam
plastik yang telah berisi buah.
3. Buah naga dalam kantung plastik dihancurkan dengan cara
meremas-remas, kemudian ditambahkan satu sendok deterjen
cair.
4. Hancuran buah naga disaring ke dalam gelas beaker, kemudian
ditambahkan sedikit tenderizer.
5. Hancuran buah naga yang telah dicamput tendelizer di ambil
sebanyak 2 ml menggunakan pipet plastik kemudian dimasukkan
ke dalam tabung eppendorf.
6. Tabung eppendorf yang telah berisi hancuran buah ditambahkan
dengan alkohol 96%.
7. DNA kromosom yang berbentuk kabut putih diamati.
Cara kerja praktikum isolasi bakteri Escherchia coli adalah
sebagai berikut:
1. Koloni Escherchia coli diambil sebanyak 1,5 ml, dimasukkan ke
dalam tabung eppendorf kemudian di sentrifuge dengan
kecepatan 5000 rpm selama 10 menit.
2. Supernatant dibuang, ditambahkan 10 l deterjen dan 90 l
akuades dan disuspensikan.
3. Tabung eppendorf dipanaskan pada suhu 1000c selama 10 menit
kemudian disentrifuge dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10
menit.
4. Tabung eppendorf disimpan pada suhu -200c.

III. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil

Isolasi DNA buah naga Isolasi DNA manga Isolasi

DNA strawberry
 Isolasi DNA alpukat Isolasi DNA bawang Bombay
Isolasi DNA E.coli
 B. Pembahasan

Isolasi DNA adalah suatu proses untuk mendapatkan DNA

murni yang dapat digunakan untuk keperluan pemeriksaan atau
diagnosa. DNa dapat di isolasi dari berbagai sel yang memiliki
inti sel, karena DNA terletak di dalam inti sel. Beberapa sumber
DNA yang dapat dipergunakan dalam isolasi DNA adalah urine,
darah, biopsi,rambut, gigi kuku dan lainya. Ekstraksi DNA dari
organisme eukaryote (manusia, hewan dan tumbuhan) dilakukan
melalui proses penghancuran dinding sel (lysis of cell walls),
penghilangan protein dan RNA (cell digestion) dan pengendapan
DNA (precipitation of DNA) dan pemanenan. Berbagai teknik
ekstraksi DNA telah dikembangkan dari prinsip dasar tersebut,
sehingga saat ini muncul berbagai teknik ekstraksi dan purifikasi
DNA. Prinsip dasar ekstraksi DNA adalah serangkaian proses
untuk memisahkan DNA dari komponen-komponen sel lainnya.
Hasil ekstraksi tersebut merupakan tahapan penting untuk
langkah berikutnya. Oleh sebab itu dalam pelaksanaannya harus
dilakukan dengan baik dan bebas kontaminasi (Jamilah, 2005).
DNA kromosom merupakan sumber DNA yang umumnya kita kehendaki
untuk diklon. Adapun menurut Watson dan Crick struktur heliks ganda seperti
DNA mempunyai ciri-ciri khas seperti tersusun oleh dua rantai polinukleotida
yang basanya berpasangan dengan ikatan hidrogen, dengan aturan perpasangan A-
T dan G-C. Pasangan A-T diikat oleh dua ikaan hidrogen, sedangkan G-C oleh
tiga ikatan hidrogen, perpasangan dengan ikatan hidrogen ini selain mengikat juga
mempertahankan jarak antara dua basa. Antara dua utasan membentuk pasangan
anti pararel yaitu antara kedua utasan terdapat arah yang berlawanan; ujung 5P
akan berhadapan dengan ujung 3OH, antara dua pasangan basa terdapat jarak
sebesar 3,4 A0. Dan pasangan dua utasan DNA membentuk suatu pilinan disekitar
suatu sumbu dengan arah pilinan kekanan atau searah dengan arah jarum jam,
setiap sepuluh pasang basa (3,4A0) akan membentuk satu pilinan atau perputaran
3600 yang berdiameter 200 (Lehninger, 1982).
 Prinsip isolasi DNA kromosom adalah memisahkan DNA
kromosom atau DNA genom dari komponen-komponen sel lain.
Sumber DNA bisa dari tanaman, kultur mikroorganise, atau sel
manusia. Membran sel dilisis dengan menambahkan detergen
untuk membebaskan isinya, kemudian pada ekstrak sel tersebut
ditambahkan protease (yang berfungsi mendegradasi protein)
dan RNase (yang berfungsi untuk mendegradasi RNA), sehingga
yang tinggal adalah DNA. Selanjutnya ekstrak tersebut
dipanaskan sampai suhu 900C untuk menginaktifasi enzim yang
mendegradasi DNA (DNase). Larutan DNA kemudian di presipitasi
dengan etanol dan bisa dilarutkan lagi dengan air (Albert, 1994).
Secara kimiawi penghancuran sel dilakukan dengan
memanfaatkan senyawa kimia seperti EDTA (ethyllenediamine
tetraacetic), dan SDS (Sodium Dodecyl Sulfate). EDTA berfungsi
sebagai perusak sel dengan cara mengikat ion magnesium (ion
ini berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun
mempertahankan aktivitas enzim nuklease yang merusak asam
nukleat). SDS merupakan sejenis detergen yang berfungsi
merusak membrane sel. Enzim proteinase K dapat digunakan
untuk menghancurkan protein. Kotoran akibat lisis sel dipisahkan
dengan cara sentrifugasi. Molekul nuleotida (DNA dan RNA) yang
telah dipisahkan dibersihkan dari protein yang masih ada dengan
menggunakan phenol, dalam proses ini sebagian kecil RNA juga
dapat dibersihkan, sedangkan choloform digunakan untuk
membersihkan sisa-sisa protein dan polisakarida dari larutan.
Enzim RNAse digunakan untuk menghancurkan RNA sehingga
DNA dapat diisolasi secara utuh. Pemurnian atau purifikasi DNA
dapat dilakukan dengan mencampur larutan DNA tersebut
dengan NaCl yang berfungsi memekatkan, memisahkan DNA dari
larutan, dan mengendapkan DNA sewaktu dicampur dengan
ethanol. Proses sentrifugasi dengan kecepatan tinggi akan
mengendapkan tepung berwarna putih (DNA) dan menempel di
dasar tabung ependorf (Jusuf, 2001).
Menurut Windiastika (2012) ada lima tahap untuk
melakukan isolasi DNA serta tujuan dari masing-masing
perlakuan, yaitu :
1. Isolasi jaringan
Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi jaringan
yang ingin digunakan.
2. Pelisisan dinding dan membran sel
Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran
sel dengan cara penggerusan (homogenasi), sentrifugasi
dengan kecepatan lebih dari 10.000 rpm atau dengan
menggunakan larutan pelisis sel atau buffer ekstraksi. Inti sel
harus dilisiskan, karena substansi gen yang diinginkan ada
didalamnya. Penambahan larutan pelisis sel ini bertujuan
untuk melisiskan sel yang tidak mengandung DNA agar sel
yang megandung inti sel dapat diisolasi atau dipisahkan dari
komponen-komponen sel lainnya yang tidak berfungsi.
3. Pengekstraksian dalam larutan
Supernatan yang terbentuk dibuang dan kemudian
dilakukan ekstraksi di dalam larutan. Hal tersebut agar di
dapat ekstrak.
4. Purifikasi
Tahap ini bertujuan untuk membersihkan hasil ekstrak dari
zat-zat lainnya. Pada larutan tersebut kemudian diberikan
RNAse dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 65 0c. hal
tersebut bertujuan untuk mengoptimalkan kerja enzim yang
sangat dipengaruhi oleh temperature. Penambahan RNAse
berguna untuk menyingkirkan kontaminasi RNA sehingga
DNA dapat diisolasi secara utuh.
5. Presipitasi
 Tahap terakhir yaitu persipitasi, bertujuan untuk
mengendapkan protein histon, sehingga untai-untai DNA
tidak lagi menggulung (coiling) dan berikatan dengan protein
histon, yang menyebabkan DNA menjadi terlihat. Tahap
presipitasi dilakukan dengan cara meneteskan laruta
presipitasi protein dan kemudian divortex yang bertujuan
untuk menghomogenkan larutan. Larutan presipitasi protein
terdiri atas ammonium asetat yang jika berikatan dengan
protein mengakibatkan terbentuknya senyawa baru dengan
kelarutan lebih rendah, sehingga menyebabkan protein
mengendap. Larutan tersebut kemudian disentrifugasi
kembali selama 5 menit dengan kecepatan 13.000 rpm.
Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan sebstansi
berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan
gaya sentrifugal sehingga substansi yang leih berat akan
berada di dasar, sedangkan substansi yang lbih ringan akan
terletak di atas.
Kesulitan untuk mengisolasi DNA berkualitas tinggi dari
jaringan A. unedo dalam elemen kunci penelitian yang
menggunakan teknik molekuler. Kesulitan yang dihadapi
disebabkan karena dalam A. unedo terdapat kandungan polifenol
yang tinggi, polisakarida, tanin dan metabolit sekunder lainnya.
Selain itu kontaminan dalam reaksi seperti pembatasan DNA,
amplifikasi dan kloning (Sa, 2011).
Bahan yang dibutuhkan untuk melakukan isolasi DNA
yaitu:
1. Binding buffer, yang terdiri dari berbagai macam komponen
yaitu:
a. NaCl : berfungsi untuk menstabilkan DNA sebagai rantai
ganda serta berfungsi 2M berfungsi sebagai neutralize
charge pada gula fosfat DNA.
 b. EDTA : akan berikatan dengan ion Mg sebagai komponen
yang menjaga regiditas sel.
c. Detergen : Penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat
menyebabkan rusaknya membrane sel, melalui ikatan yang dibentuk
melalui sisi hidrofobik deterjen dengan protein dan lemak pada
membrane membentuk senyawa lipid protein-deterjen kompleks.
Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki
ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga dengan deterjen,
sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia.
d. Enzim protease : berfungsi untuk merusak protein.
e. Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) berfungsi untuk merusak
membrane sel, mendenaturasi protein dan menghambat
aktivitas nuclease.
2. Isopropanol : berfungsi untuk melarutkan DNA, karena DNA
merupakan senyawa polar dan isopropanol bersifat polar.
Pengaruh isoporopanol pada presipitasi kompleks CTAB-DNA
sering digunakan untuk presipitasi pertama, tetapi tidak untuk
tahap akhir karena cenderung mengendapkan garam
dibandind ethanol.
3. Colletion tube yang di lengkapi matriks silica gel, berfungsi
untuk mengikat DNA.
4. Wash buffer : berfungsi untuk mencuci DNA
5. Elution buffer : berfungsi untuk melepaskan ikatan matriks
dan silica gel dan DNA (Adityawarman, 2010).
6. Alkohol 96% berfungsi untuk mengendapkan DNA plasmid dan
untuk membilas serta mencuci plasmid (Pradhika, 2008).
Praktikum ini dilakukan untuk dapat mengisolasi DNA kromosom dari
macam buah dan bakteri E. coli. Buah yang digunakan dalam proses isolasi DNA
ini adalah buah naga, alpukat, strawberry, manga, bawang Bombay dan DNA
bakteri E. coli, sedangkan jenis deterjen yang dipakai adalah sabun cair Sunlight.
Hasil praktikum isolasi DNA di dapat DNA atau kromatin
berwarna putih seperti benang-benang putih halus yang terdapat
pada tabung eppendorf. Banyaknya kabut putih yang terbentuk
pada masing-masing buah berbeda-beda, hal ini sesuai dengan
pernyataan Jamilah (2005), bahwa Jika isolasi DNA dilakukan dengan
sample buah, maka kadar air pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi
hasil yang berbeda-beda pula dan warnanya pun berbeda. Semakin tinggi kadar
air, maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA
yang terpretisipasi juga akan sedikit.
 IV. KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Berdasarkan hasil dan pembahasan dapat diambil

kesimpulan sebagai berikut:
Hasil isolasi DNA buah pada masing-masing kelompok terdapat
kabut putih, namun tidak tampak jelas karena kandungan air
pada masing-masing buah berbeda-beda.
Hasil isolasi DNA bakteri E. coli terdapat kabut putih, namun
tidak terlihat jelas.
Tahap-tahap isolasi DNA yaitu isolasi jaringan, pelisisan dinding
dan membran sel, pengekstraksian dalam larutan, purifikasi dan
presipitasi .

B. Saran

Pemberian akuades pada isolasi DNA disesuaikan dengan

jenis buah karena kadar air pada masing-masing buah berbeda-
beda sehingga di dapat kabut putih yang banyak.
 DAFTAR REFERENSI

Adityawarman, 2010. Isolasi DNA.

http://sharkest-aditya.blogspot.co/2010/03/isolasi-dna.html.
Diakses tanggal 26 Mei 2012.
Albert, Brush. 1994. Biologi Molekular Sel Edisi ke-2. Gramedia, Jakarta.
Arumingtyas, EL. 2011. Isolasi DNA dan RAPD. Laboratorium Sentral Ilmu
Hayati Universitas Brawijaya. Malang.
Campbell. 2002. Biologi Edisi Kelima Jilid 1. Erlangga. Jakarta.
Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Deterjen, Penambahan Garam dan
Ekstrak Nanas (Ananas Comusus) terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai
Macam Buah sebagai Topik Praktikum Mata Kuliah Genetika. Skripsi tidak
diterbitkan. Malang: Program Sarjana Biologi.
Jusuf, M. 2001. Genetika I. Sagung Seto, Jakarta.
Lehninger, A. L. 1982. Dasar-Dasar Biokimia III. Terjemahan Maggy
Thenawijaya. Erlangga, Jakarta.
Pradika. 2008. Isolasi DNA Plasmid dan DNA Kromosom.
http://nayatush.blogspot.com/2011/06/isolasi-dna-plasmid-
dan-dna-kromosom.html. Diakses tanggal 26 Mei 2012.
Sa, Olga., Jose, Alberto and Paula, Baptista. 2011. Optimization
of DNA Extraction for RAPD and ISSR Analysis of Arbutus
unedo L. Leaves. International Journal of Molecular Sciences.
12 : 4156-4164.
Windiastika, Gati. Teknik Isolasi DNA Benih Tanaman The
(Camelllia sinensis L.). Balai Besar Perbenihan dan Proteksi
Tanaman Perkebunan Surabaya.