Laporan Praktikum Hari/Tanggal: Selasa/13 November 2018

Genetika Dasar Waktu : 08.00 – 11.00 WIB

Nama : Sandi Achmad A Asisten : Uswatun H (G34140004)
NIM : G34170037 Siti Dianur (G34140010)
Kel/Lab : 8/Lab Bio 1

ISOLASI DNA GENOM DAN PEMOTONGAN DNA DENGAN

ENZIM RESTRIKSI

PENDAHULUAN

DNA (Deoxyribo Nukleid Acid) adalah macam asam nukleat yang berhubungan
dengan hereditas. Penemu DNA adalah seorang ahli kimia asal Jerman Friederich
Mieschier (1869), yang menyelidiki susunan kimia dari nucleus. Berdasarkan hasil
penelitian Rosalind Franklin dan Maurice Wilkins pada DNA dengan menggunakan
sinar – X, James Watson dan Francis Crick (1953). mengemukakan suatu model
gen yang terkenal dengan nama double helix (tangga tali berpilin ganda). Watson
dan Crick mendapatkan hadiah nobel pada tahun 1962 atas penemuan tersebut.
Deoxyribo Nukleid Acid mengandung informasi genetik dari makhluk hidup, dan
kebanyakan terdapat di dalam kromosom (Brown 2002)
Enzim restriksi memotong DNA double strands dengan memutus ikatan
kovalen di antara fosfat dari satu deoksiribonukleotida dengan gula dari
deoksiribonukleotida yang berbatasan dengannya. Terdapat dua tipe hasil
pemotongan, ujung rata (blunt end) dan ujung kohesif (sticky end). Ujung rata
(blunt end) dihasilkan ketika dua utas molekul dipotong pada posisi yang sama,
bagian akhirnya rata dan tidak ada nukleotida yang tidak berpasangan. Ujung
kohesif (sticky end) dihasilkan ketika setiap molekul DNA dipotong pada posisi
yang tidak sama sehingga salah satu utas (5’ atau 3’) menggantung dengan beberapa
nukleotida (Suharsono dan Widyastuti 2006).
Enzim restriksi yang berbeda memiliki situs pemotongan yang berbeda, namun
ada beberapa jenis enzim restriksi yang diisolasi dari sumber yang berbeda
memiliki situs pemotongan yang sama. Enzim restriksi memiliki palindrom yaitu
situs pengenalan enzim restriksi yang terdiri atas beberapa basa dan memiliki basa
komplemen yang sama. Enzim restriksi dengan situs pengenalan yang sama tetapi
situs pemotonganya berbeda disebut neoshizomer. Enzim restriksi dengan situs
pengenalan dan pemotongan yang sama disebut isoschizomer. Enzim restriksi yang
memiliki situs pengenalan berbeda tetapi ujung terminasinya identik
disebut isocaudomer (Solomon. dkk. 1993). Praktikum ini bertujuan memahami
dan dapat melakukan proses isolasi pada DNA genom serta memahami dan dapat
melakukan pemotongan DNA dengan enzim restriksi.
 METODE

Tempat dan Waktu Praktikum

Praktikum dilaksanakan di Laboratorium Pendidikan Departemen Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor pada
hari selasa 13 November 2018 pukul 08.00 s.d. 11.00 WIB.

Alat dan Bahan

Isolasi DNA Genom
Alat yang digunakan pada praktikum ini adalah pemanas (water bath), blender
atau mortar, tabung 1,5 ml dan 15 ml, batang gelas pengaduk, kain kasa, corong,
perangkat elektroforesis, piper mikro 20, 200 dan 1000 mikro liter, tip pipet, dan
lampu UV. Sedangkan bahan yang digunakan adalah bawang bombay, larutan lisis,
alkohol absolut 95%, larutan penyangga dan Ethidium bromida.
Pemotongan DNA dengan Enzim Restriksi
Alat yang digunakan pada praktikum ini adalah tabungEfendorf, pipet mikrotip,
inkubator suhu, dan perangkat elektroforesis. Sedangkan bahan yang digunakan
adalah DNA plasmid, larutan penyangga untuk enzim retriksi Eco RI, enzim
retriksi, akuades steril
Prosedur Percobaan
Isolasi DNA daun selada

Daun Bayam ditambahkan

di water bath 60
dicacah dan 5ml larutan homogenisasi
ᵒC, 15 menit
dihaluskan lisis

disimpan di disaring ditambahkan

bak es 5 dengan alkohol
menit kain kasa abolut 10ml

Pemotongan dengan Enzim Restriksi

penambahan
ditambahkan 2
1,5 mL akuades pada tabung sampel
μl DNA
sampel dan tabung kontrol disimpan
plasmid
kontrol (-) sebanyak dalam bak es
tabung sampel
DNA

ditambahka menambahka
n 2 μl n 0,5 μl diinkubasi
ditambahka
larutan enzim 37 ᵒC,
n akuades
penyangga selama 1-2
restriksi ke steril 15,5 μ
ke setiap setiap tabung jam
tabung
 HASIL
DNA
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
yang
terama
ti

Gambar 1 Hasil isolasi DNA

Gambar atas adalah hasil isolasi DNA

Sumur 1 : marker lamda 1
Sumur 2 : kelompok 1
Sumur 3 : kelompok 2
Sumur 4 : kelompok 3
Sumur 5 : kelompok 4
Sumur 6 : kelompok 5
Sumur 7 : kelompok 6
Sumur 8 : kelompok 7
Sumur 9 : kelompok 8
Sumur 10 : kelompok 9
Sumur 11 : kelompok 10

Sumur 12 : kelompok 11
Sumur 13 : kelompok 12
 DNA
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 yan
g
tera
mat
i

Gambar 2 Hasil pemotongan DNA dengan enzim restriksi

Sumur 1 : marker 1 kB Ladder

Sumur 2 : Kontrol
Sumur 3 : kelompok 1
Sumur 4 : kelompok 2
Sumur 5 : kelompok 3
Sumur 6 : kelompok 4
Sumur 7 : kelompok 5
Sumur 8 : kelompok 6
Sumur 9 : kelompok 7
Sumur 10 : kelompok 8
Sumur 11 : kelompok 9

Sumur 12 : kelompok 10
Sumur 13 : kelompok 11
 PEMBAHASAN

Isolasi DNA adalah proses pemisahan molekul DNA dari molekul-molekul

lain di inti sel. Prosedur ini memiliki beberapa tujuan analisis yaitu visualisasi
DNA, peninjauan pola fragmentasi DNA, pembuatan pustaka genomik, rekayasa
gen, dan amplifikasi DNA. Isolasi DNA atau ekstraksi DNA memiliki tiga langkah
utama, yaitu perusakan dinding sel atau membran sel (lisis), pemisahan DNA dari
bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA. Metode isolasi
diawali dengan penggerusan untuk membantu memecahkan dinding sel secara
mekanik. Penambahan pasir kuarsa saat penggerusan bertujuan menghambat enzim
polifenol oksidase yang dapat mendegradasi rantai DNA dan menyebabkan
teroksidasinya senyawa fenol. Terjadinya oksidasi ditandai dengan terbentuknya
warna coklat pada jaringan tanaman yang akan diisolasi (Lee 1988).
Pada percobaan digunakan berbagai macam larutan dan reagen. Larutan-
larutan dan reagen tersebut memiliki fungsi tersendiri. Beberapa larutan yang
digunakan adalah ethanol 75%, buffer ekstraksi yang mengandung Tris-HCl,
EDTA, NaCl, dan CTAB. Masing-masing buffer memiliki fungsinya tersendiri,
misalnya saja salah satu reagen yang penting yakni buffer ekstraksi yang digunakan
mengandung Tris HCl, EDTA, dan CTAB. Tris HCl berperan sebagai buffer yang
mengatur pH larutan ekstraksi. Ethylenediamine tetraacetic acid atau EDTA
berperan sebagai chelating agent yang mengikat ion metal dalam larutan ekstraksi
(Henry dan Robert 2001). EDTA melemahkan sel dengan mengikat ion bivalen
(Mg+2 dan Ca+2) yang diperlukan untuk kestabilan membran sel. EDTA juga
digunakan agar enzim nuklease yang dapat mendegradasi DNA tidak aktif.
Sementara itu CTAB berfungsi membantu proses pemecahan membran sel. Buffer
CTAB perlu diinkubasi dalam water bath pada suhu 65°C, karena CTAB yang
berkemampuan melisis membran sel akan aktif pada kondisi panas (65°C) (Brooks
et al. 2013).
Elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul selular berdasarkan
ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium
yang mengandung sampel yang dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan
memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang
bermuatan negatif (Yuwono 2005).
Teknik elektroforesis mempergunakan medium yang terbuat dari
gel. Perpindahan partikel pada medium gel tersebut dipengaruhi oleh faktor-faktor
seperti ukuran partikel, komposisi dan konsentrasi gel, densitas muatan, kuat medan
listrik dan sebagainya. Semakin kecil partikel tesebut, maka pergerakan atau
migrasinya akan semakin cepat, karena matriks gel mengandung jaringan kompleks
berupa pori-pori sehingga partikel-partikel tersebut dapat bergerak melalui matriks
tersebut (Brown 2013) di dalam elektroforesis digunakan sumber arus listrik searah
(DC), ruang untuk elektroforesis (Comb, Well, platform dan cetakan wadah gel),
larutan buffer (buffer ionik dan loading buffer), matriks elektroforesis, marker dan
gel (Klug & Cummings 1994).
Pada percobaan, sampel DNA yang akan dielektroforesis ditambahkan
loading dye terlebih dahulu. Hal ini dikarenakan larutan loading dye memiliki
peran penting dalam menghasilkan ban DNA yang tajam. Tiga fungsi utama dari
larutan tersebut adalah untuk menterminasi reaksi enzimatik sebelum
elektroforesis, menyediakan kerapatan agar sampel dapat bergerak dalam sumur
gel, dan menyediakan cara untuk melihat pergerakan molekul DNA saat
elektroforesis (Surzycki 2003).
Enzim restriksi adalah enzim yang memotong pada situs spesifik. Situs yang
dipotong oleh enzim restriksi disebut situs pengenalan enzim (Recognition
sequences). Enzim yang berbeda dapat mengenali situs yang berbeda. Enzim yang
dihasilkan oleh berbagai jenis bakteri dan secara alami berfungsi untuk melindungi
bakteri dari intervensi DNA asing. Penamaan enzim restriksi biasanya berdasarkan
inangnya, misalnya EcoRI berasal dari bakteri Escherichia coli. Dalam biologi
molekuler, enzim restriksi biasanya digunakan untuk analisis kekerabatan, rekayasa
genetika dan identifikasi suatu molekul DNA. Enzim restriksi mampu memotong
DNA pada situs pengenal dengan sekuensi DNA yang sangat spesifik (Recognition
site). Dengan demikian enzim ini mampu memproses DNA menjadi potongan-
potongan yang lebih pendek asal DNA tersebut memiliki situs pengenal untuk
enzim restriksi tertentu. Berdasarkan tempat pemotonganya, enzim restriksi dibagi
menjadi dua yaitu endonuklease dan eksonuklease. Endonuklease merupakan
enzim restriksi yang memotong di tengah atau dalam DNA target sedangkan
eksonuklease merupakan enzim restriksi yang memotong di bagian ujung DNA
target (Pingoud 2005).
Percobaan yang telah dilakukan memperlihatkan adanya pita genom dan pita
plasmid pada setiap sumur. Adanya pita genom yang telihat pada gel menunjukkan
proses ekstraksi DNA plasmid yang kurang sempurna karena DNA genom yang
berukuran besar masih ada. Hal ini dapat terjadi karena pada saat ekstraksi DNA
terjadi kesalahan yang membuat DNA genom masuk ke dalam larutan, basa-basa
enzim restriksi kemudian berlekatan dengan basa-basa DNA genom dan DNA
genom ikut terpotong sehingga terlihat pada gel agarosa.
Hasil elektroforesis menunjukkan adanya DNA yang terlihat. Tapi yang
didapat pada percobaan kali ini berbentuk smear sehingga ukuran DNA tidak dapat
dihitung. Menurut Sambrook (1989) mengidentifikasi beberapa faktor utama yang
menyebabkan hasil elektroforesis tak sesuai dengan yang diharapkan. Hasil
elektroforesis yang buruk seringkali disebabkan oleh banyaknya zat-zat pengotor
dalam DNA atau dengan kata lain DNA yang didapat tidak murni. Beberapa faktor
yang memengaruhi kemurnian DNA yakni tingkat kontaminasi protein dalam
larutan, faktor pengencer, serta daya absorbansi. Pada elektroforesis, konsentrasi
DNA diukur secara Sprektrofotometri dengan menggunakan GeneQuant DNA
calculator. Dasar teknik ini adalah DNA yang dapat menyerap sinar ultraviolet
dengan kuat pada panjang gelombang 260 nm, sedangkan 280 nm merupakan
daerah serapan protein. Panjang gelombang dengan nilai serapan 1,0 (A260=1,0 )
setara dengan 50 mg DNA utas ganda per milliliter larutan. Oleh karena itu,
didapatkan bahwa konsentrasi DNA (µg/ml) diperoleh dari perkalian antara faktor
pengencer, faktor konversi (50 µg/ml) dan Absorbansi (A260).
Pita genom yang tidak smear atau bahkan tanpa latar pembayang di bagian
belakangnya mengindikasikan tingkat kemurnian DNA yang baik. DNA disebut
tidak terdegradasi atau terkontaminasi dan dapat diisolasi dengan baik.
Kontaminasi fenol dan bahan organik lainnya dapat dilihat dengan munculnya latar
pembayang atau smear di sepanjang jalur pergerakkan pita genom DNA (Tenriulo
et al 2001). Ada 3 hal yang menjadi faktor penentu dalam metode ekstraksi dan
purifikasi DNA secara optimal, yakni penghomogenan jaringan tanaman,
komposisi larutan buffer, dan penghilangan enzim penghambat polisakarida
(Syarifudin dan Santoso 2011).

SIMPULAN

Proses isolasi DNA memiliki tiga langkah utama, yaitu perusakan dinding
sel atau membran sel (lisis). Langkah selanjutnya pemisahan DNA dari bahan padat
seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA. Hasil Elektrolisis menunjukkan
adanya DNA pada daun lobak.

DAFTAR PUSTAK/A

Brooks G, Carroll KC, Butel J, Morse S. 2013. Jawetz, Melnick & Adelberg's
Medical Microbiology. 26th ed. New York (US): McGraw-Hill Medical.
Brown TA. 2002. Genomes 2nd edition. Oxford (UK): Willey – Liss.
Henry dan Robert J. 2001. Plant Genotyping : The DNA Fingerprinting of Plants.
New York (US): CABI Publishing.
Klug WS dan Cumming MR. 1994. Concepts of Genetic. New Jersey
(US):Prentice-Hall Inc.
Lee SB, Milgroom MG, Taylor JW. 1988. A rapid, high yield mini-prep method for
isolation of total genomic DNA from fungi. Fungal Genetics Newsletter 35:
23–24.
Pingoud, A. 2005.Type II restriction endonucleases: structure and mechanism.
Basel (SW): Birkhauser.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning. A Laboratory
Manual. New York(US): Cold Spring Harbour Laboratory Press.
Solomon EP, Berg LR, Martin DW, Ville C. 1993. Biology 3nd ed. Florida (US):
Saunders College Publishing,.
Suharsono & Widyastuti, U. 2006. Pelatihan Teknik Pengklonan Gen. Bogor (ID):
Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi.
Surzycki S. 2003. Human Molecular Biology Laboratory. USA: Blackwell Science
Ltd.
Syafaruddin dan Santoso TJ. 2011. Optimasi teknik isolasi dan purifikasi dna yang
efisien dan efektif pada kemiri sunan (Reutalis trisperma (blanco) airy shaw).
Jurnal Penelitian Tanaman Industri. 17(1): 11-17.
Tenriulo AE, Suryati E, Panrenrengi A, Rosmiat. 2001. Ekstraksi DNA rumput laut
Kappahpycus alvarezii dengan metode fenol kloroform. Marina Chimica Acta.
2(2): 6-10.
Yuwono T. 2005. Biologi Molekuler. Jakarta (ID): Penerbit Erlangga.