LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI FARMASI

MINGGU - 2
ISOLASI PLASMID, PURIFIKASI HASIL PCR, LIGASI, DIGESTI DAN ISOLASI
FRAGMEN DNA

Kelompok 8
BIOTEKNOLOGI KELAS A1
Agnes Rebecca Novalia
Chavella Avatara
Gerardo Laudus
Hilda Nur Aziza
Lidya Kartika
Metah Putri Mutia
Merry Flora
Rahma Suci

1306480862
1306402545
1306411934
1306396920
1306396901
1306396946
1306376931
1306377120

UNIVERSITAS INDONESIA
FAKULTAS FARMASI
DEPOK
2016

ISOLASI PLASMID

I.

PENDAHULUAN

Setiap organisme memiliki DNA yang terletak dalam inti sel atau nucleus yang
disebut sebagai DNA kromosomal, begitu pula bakteri. Selain dna kromosomal bakteri
juga memiliki DNA ekstrakromosomal. Plasmid merupakan DNA ekstrakromosomal
yang berbeda karakternya dengan DNA kromosomal. Bentuk plasmid berupa molekul
DNA utas ganda sirkuler yang berukuran kecil dan berat sekitar 1-300 kb (Snustad dan
Simmons 2003), terdapat didalam sitoplasma dan dapat melalukan replikasi secara
autonom karena adanya suatu urutan DNA sebagai asal replikasi dan plasmid juga
merupakan salah satu vector dalam proses pengklonan gen.
Dalam bidang bioteknologi, teknik kloning mikroba merupakan salah satu teknik
yang umum dilakukan untuk menghasilkan produk hasil merekayasa genetika. Pada
teknik ini, sekuens DNA yang diinginkan disisipkan ke dalam vektor sebelum nantinya
diperkenalkan kepada sel. Vektor yang biasa digunakan adalah plasmid bakteri.
Plasmid bakteri yang biasanya digunakan dalam teknologi DNA rekombinan
menggunakan E. coli sebagai host, sehingga dalam rekayasa genetika plasmid sering
digunakan sebagai vektor untuk membawa molekul DNA yang diinginkan ke dalam
suatu sel inang. Penggunaan plasmid dalam DNA rekombinan dilakukan karena plasmid
memiliki tiga region yang berperan penting untuk DNA kloning, yaitu, replication origin,
marker yang memungkinkan adanya seleksi (biasanya gen resisten antibiotik) dan
region yang mampu disisipi oleh fragmen DNA dari luar. Salah satu karakteristik
plasmid, yaitu memiliki ORI (Origin of replication). Inti dari isolasi plasmid bakteri
adalah menghancurkan membran sel sehingga semua organel sel dapat keluar (Jusuf
2001).
Isolasi plasmid adalah aktivitas yang melakukan pengklonan gen. salah satu metode
yang banyak digunakan dalam isolasi plasmid saat ini adalah metode alkaline lysis.
Metode ini pertama kali dipublikasikan oleh Birnboim dan Dolly tahun 1979 (Nucleic
Acids Res. 7, 1513-1523). Metode alkaline lysis secara garis besar terbagi ke dalam
enam tahap, yakni tahap kultivasi bakteri dan pemanenan sel, tahap resuspensi sel,
tahap lisis sel dan denaturasi DNA, tahap netralisasi, tahap purifikasi, dan tahap
pemekatan DNA. Secara umum, isolasi plasmid bertujuan mengekstrak plasmid dan
memisahkannya dari berbagai komponen selular bakteri lainnya, seperti protein, lemak,

RNA, dan DNA kromosomal. Keberhasilan tahap isolasi bergantung pada sumber bahan,
konsentrasi bahan, stabilitas dan kadar kemurnian produk akhir.
II.

PRINSIP
Prinsip dalam melakukan isolasi plasmid adalah penghancuran dinding sel, lisis sel,
pembersihan debris sel, dan presipitasi DNA. Prinsip-prinsip tersebut akan dibahas lebih
lanjut dalam bagian pembahasan

III.

TUJUAN
Isolasi/ekstraksi DNA plasmid bertujuan untuk memperoleh DNA plasmid dengan
kualitas kemurnian yang baik menggunakan metode modifikasi Alkalin Lisis atau
menggunakan kolom(kit)

IV.

ALAT DAN BAHAN

1. Alat
Sentrifuge mikro
Tabung mikro 1,5 ml
Pipet mikro 1000 l dan 200 l, beserta tipnya
Beberapa beaker glass
Rak tabung mikro
Bak es dan es yang telah dihancurkan
Tabung reaksi steril
Vortex mixer
2. Bahan
E .coli DH5 (Puc19) yang telah ditumbuhkan 16 jam dalam medium LB dengan

V.

penambahan antibiotic penisilin

Larutan A : 50 mM glukosa, 25mM Tris-HCL (pH 8,0), 10 mM EDTA
Larutan B : larutan 10% SDS (Sodium dodesil sulfat) + larutan 0,2 N NaOH
Larutan C : Larutan KOAc/HOAc (pH 5,2) dingin
70% etanol dingin
Etanol absolute dingin
Fenol-CHCL3-Isoamilalkohol (25:24:1)
dH2o steril
1XTE pH 8,0

PROSEDUR KERJA

 Protokol (Metode Alkalin Lisis)

1. Sel E.coli DH5 (pUC19) ditumbuhkan dalam medium LB+Amp (100 g/ml) pada
37C secara aerobik selama semalam.
2. Sebanyak 8 tabung mikro diambil dan diberi label pUC19 pada 4 buah tabung.
Masukkan 1,5 ml kultur bakteri ke dalam tabung mikro.
3. Sel bakteri dikumpulkan melalui sentrifusi pada sentrifuge mikro pada 10000rpm
selama 2 menit. Supernatan dibuang sampai tinggal peletnya saja.
4. Pellet diresuspensikan dalam 110 L larutan A dan diamkan pada suhu ruang selama
5-10 menit.
5. Larutan B yang telah disiapkan terdiri dari campuran 4,25 ml dH 2O steril; 0,5 ml 10%
SDS ; 0,25 ml 4N NaOH
6. Sebanyak 200 L larutan B ditambahkan pada masing-masing tabung mikro,
kemudian tabung dibolak-balikkan dan secara perlahan tercampurkan sampai terjadi
lisis (larutan menjadi bening dan kental)
7. Kemudian diinkubasi pada 0C (diatas pecahan es) selama 5-10 menit. Tambahkan
larutan C sebanyak masing-masing 150 L, lalu divorteks selama sekitar 10 detik.
Lalu inkubasi kembali pada 0C (taruh di atas es) selama 5-10 menit.
8. Sentrifusi pada 5000 rpm selama 3 menit. Supernatan dipindahkan pada tabung mikro
lain yang steril dan ditambahkan 0,5 ml campuran fenol-CHCl 3-isoamil alkohol.
Vorteks sebentar sampai terbentuk suspensi lalu sentrifusi pada 13000 rpm selama 10
menit.
9. Supernatan (fase cair) dipindahkan pada tabung mikro steril. Usahakan untuk
mengambil sebanyak mungkin supernatant tetapi jangan terkontaminasi dengan
bagian fenol.
10. Sebanyak 1 ml etanol absolut dingin ditambahkan. Campurkan dan inkubasikan pada
20C selama minimum 10 menit.

Sentrifusi pada 10000rpm selama 5 menit.

Supernatan dibuang.
11. Pellet dicuci (mengandung DNA+ RNA stabil + mungkin sedikit protein kontaminan)
dengan menambahkan 700L 70% etanol dingin.
12. Keringkan pellet dalam chamber yang terhubung dengan pompa vakum selama
beberapa menit, namun jangan sampai terlalu kering.
13. Pellet disuspensikan dalam 40-50 L 1xTE pH 8 kemudian simpan dalam freezer
-20C.
Protokol (Prepease Kit)

Kultur disiapkan dengan menginokulasikan bakteri ke media LB. Lalu, diinkubasi

selama 24 jam sambil dishaking. Kultur bakteri dimasukkan ke tabung mikro dan
disentrifugasikan selama 30 detik dengan kecepatan 11.000 rpm. Supernatan dibuang dan
pellet diresuspensikan dengan buffer A1. Campuran divortex. Buffer A2 ditambahkan ke
dalam suspensi dan dikocok perlahan (tidak menggunakan vortex). Kemudian, buffer A3
ditambahkan dan dikocok perlahan sampai suspensi berwarna keputihan. Campuran
disentrifugasi selama 5 10 menit dengan kecepatan 11.000 rpm. Lisat murni
dimasukkan ke minispin column-centrifuge. Lalu, lisat dicuci dengan buffer A4 atau
wash buffer. Kemudian campuran disentrifugasi. Campuran kemudian dikeringkan dan
disentrifugasi kembali. Buffer elusi ditambahkan dan diinkubasi selama 1 menit.
Campuran disentrifugasi

VI.

ALUR KERJA
Tumbuhkan Sel E.coli DH5 (pUC19) di dalam
medium LB+Amp pada suhu 370c selama semalam

TAHAP
PEMANENAN
SEL

Ambil 8 tabung mikro dan diberi label Puc19,

tambahkan 1,5 ml kultur bakteri ke dalam 4
buah tabung mikro
Kumpulkan Bakteri melalui sentrifusi pada sentrifuge
mikro pada 10000rpm selama 2 menit. Supernatan dibuang
sampai tinggal peletnya saja.

TAHAP
RESUSPENSI
SEL

Pellet diresuspensikan dalam 110 L larutan A

dan diamkan pada suhu ruang selama 5-10
menit.
Tambahkan Sebanyak 200 L larutan B pada masingmasing tabung mikro, kemudian tabung dibolakbalikkan secara perlahan hingga tercampurkan sampai
terjadi lisis (larutan menjadi bening dan kental)

TAHAP LISIS SEL

&DENATURASI
DNA

inkubasikan pada 0C (diatas pecahan es) selama

5-10 menit. Tambahkan larutan C sebanyak
masing-masing 150 L, lalu divorteks selama
sekitar 10 detik. Lalu inkubasi kembali pada 0C
(taruh di atas es) selama 5-10 menit.

Supernatan (fase cair) dipindahkan pada tabung mikro

steril dan jangan terkontaminasi dengan bagian fenol.

TAHAP LISIS SEL

&DENATURASI
DNA

TAHAP
PEMEKATAN DNA

Sentrifusi pada 5000 rpm selama 3 menit. Supernatan

dipindahkan pada tabung mikro lain yang steril dan
ditambahkan 0,5 ml campuran fenol-CHCl3-isoamil
alkohol. Vorteks sebentar sampai terbentuk suspensi
lalu sentrifusi pada 13000 rpm selama 10 menit.

Tambahkan 1 ml etanol absolut dingin. Campurkan

dan inkubasikan pada 20C selama minimum 10
menit. Sentrifusi pada 10000rpm selama 5 menit.
Supernatan dibuang.
Pellet dicuci (mengandung DNA+ RNA stabil +
mungkin sedikit protein kontaminan) dengan
menambahkan 700L 70% etanol dingin

TAHAP
NETRALISASI

Keringkan pellet dalam chamber yang terhubung

dengan pompa vakum selama beberapa menit, namun
jangan sampai terlalu kering

Pellet disuspensikan dalam 40-50 L 1xTE pH 8

kemudian simpan dalam freezer -20C.

VII.

Pembahasan

Plasmid dari bakteri E. coli DH5 yang akan diperoleh sebagai hasil isolasi
adalah pUC19. Untuk mendapatkan plasmid tersebut maka sel bakteri harus dihancurkan
terlebih dahulu kemudian dilakukan purifikasi untuk membersihkan plasmid dari
komponen sel lainnya. Untuk melakukan isolasi ini maka metode yang akan digunakan
adalah alkalin lisis.
Tahap pertama yang dilakukan adalah meresuspensi dalam larutan A (larutan
glukosa-EDTA). Selanjutnya ditambahkan larutan B yang mengandung NaOH, larutan
alkali ini akan membuat sel pecah.Pada proses melisiskan ini digunakan pula sodium
dodecyl sulphate (SDS) yang merupakan detergen. Detergen ini berperan dalam
mengurangi aktivitas enzim nuklease yang merupakan enzim pendegradasi DNA
(Switzer, 1999). Cara dan bahan yang digunakan pada penghancuran dinding sel dan lisis
sel bergantung pada jenis bakteri yang digunakan juga. Misalnya lisozim digunakan pada
bakteri Gram positif. selanjutnya Larutan C yang bersifat asam kemudian ditambahkan,
tujuan dari penambahannya adalah untuk menetralkan suasana basa dan mendenaturasi
protein, yang menyebabkan protein akan mengendap. Endapan ini dapat dipisahkan
setelah larutan disentrifugasi.
Supernatan yang diperoleh kemudian diekstraksi menggunakan campuran fenolkloroform-isoamil

alkohol.

Campuran

isoamil

alkohol-fenol

digunakan

untuk

mengefektifkan pemisahan protein kontaminan, karena kloroform saja hanya mampu

memisahkan sedikit protein kontaminan namun sangat efektif untuk memisahkan lemak.
Pada bagian supernatan akan diperoleh fase air yang mengandung asam nukleat dan
pellet yang merupakan fase organik berisi kontaminan. Kemudian supernatan yang
diperoleh ditambahkan etanol absolut dingin dan disentrifuse dengan kecepatan tinggi
untuk memperoleh pellet yang berisi plasmid. Plasmid lalu dicuci dengan etanol 70%.
Penyimpanan DNA yang diinginkan dapat menggunakan buffer TE. Buffer TE
bekerja dengan cara mengkhelat logam yang bekerja sebagai kofaktor enzim DNAse
sehingga tidak terjadi degradasi pada DNA. Namun, buffer TE juga dapat menyebabkan
enzim polimerase tidak aktif. Selain menggunakan buffer TE, suhu rendah (-20 oC) dapat
digunakan untuk mencegah aktifnya enzim DNAse.
VIII. KESIMPULAN
DNA plasmid dapat digunakan sebagai vector cloning karena dapat bereplikasi
secara

autonomous.

Plasmid

berhasil

diisolasi

dengan

penumbuhan

Kultur

E.coli,pemanenan E.coli, dan pemurnian dari kontaminan lain melalui metode lisis alkali.
Plasmid dari bakteri E. coli DH5 yang akan diperoleh sebagai hasil isolasi adalah
pUC19.
IX.

DAFTAR PUSTAKA
Karp, Gerald. 2010. Cell and Molecular Biology. Denver, AS : Johns Wiley & Sons Co.
Malik, A. 2016. Penuntun Kerja : Isolasi Plasmid dan Kloning DNA. Depok : Fakultas
Farmasi Universitas Indonesia
Brown TA. 2003. Pengantar Kloning Gen. Muhammad SA, penerjemah. Terjemahan dari
: Gene Cloning an introduction. Yogyakarta (ID) : Yayasan Essentia Medika
Twyman RM. 1998. Advanced Molecular Biology. New York (US) : BIOS Scientific
Publishe
Snustad DP & MJ Simmons. 2003. Principle of genetic. Hoboken (US) : Wiley & Sons
inc
Plasmid DNA Transformation in Escherichia Coli: Effect of Heat Shock Temperature,
Duration, and Cold Incubation of CaCl2 Treated Cells. (2010). International Journal
of Biotechnology and Biochemistry,Volume 6 Number 4.

PURIFIKASI HASIL PCR

I.

PENDAHULUAN
Purifikasi hasil PCR merupakan metoda untuk mengamplifikasi fragmen DNA
spesifik dalam jumlah besar secara in vitro dari sejumlah kecil template awal. Pertama
kali ditemukan oleh Kary Mullis pada tahun 1983. Percobaan ini menggunakan PCR
karena PCR memiliki keutamaan sebagai berikut :

Dapat mengamplifikasi fragmen DNA dalam wakturelatif singkat (~ 2 jam)

DNA template tidak perlu dalam keadaan murni
Produk PCR dapat di digesti dengan enzim restriksi,sekuen atau di klon
Mampu mengamplifikasi single DNA molekul e.g.single sperm
Purifikasi

hasil

PCR

Fragments Ekstraction Kit

dilakukan

dari

Geneaid

dengan
(2008).

menggunakan
Prosesnya

Gel/PCR
adalah

DNA

penguraian

gel, pengikatan DNA, pencucian DNA, dan elusi DNA. Tahapan purifikasi dilakukan
sesuai dengan prosedur yang terdapat dalam metode. Purifikasi bertujuan memurnikan
produk PCR yang diperoleh dari pengotor yang mungkin ada pada produk PCR. Hasil
purifikasi kemudian diuji dengan elektroforesis gel agarosa.

II.

PRINSIP
Prinsip dasar PCR berdasarkan reaksi amplifikasi enzimatik dari fragmen DNA
yang terletak diantara dua sekuen primer oligonukleotida yang berhibridisasi dengan utas
yang berlawanan pada sekuen target.

III.

IV.

TUJUAN

Purifikasi hasil PCR adalah teknik yang bertujuan untuk memperoleh DNA hasil PCR

(DNA amplikon) yang murni.

Memahami Purifikasi Hasil PCR

ALAT DAN BAHAN

IV.1. Alat
Sentrifus mikro
Tabung mikro 1.5 mL baru dan steril
Tabung penampung 2 mL (tersedia dalam kit)
Pisau silet atau cutter yang baru dan steril
Vortex.

Gambar 1. Bahan-bahan yang digunakan pada proses purifikasi hasil PCR.

IV.2. Bahan
Gel atau PCR DNA fragmen extraction kit yang yang terdiri dari dapar DF, wash
buffer+etanol 95%, serta kolom DF, dan aquabidestilata.

V.

PROSEDUR KERJA
Sebanyak 20 L DNA hasil amplikasi PCR dan 5 L loading buffer
dielektroforesiskan di gel agarosa 1%. Pita yang diinginkan dipotong dengan

menggunakan pisau silet atau cutter yang baru dan steril. Irisan gel dipindahkan ke dalam
tabung mikro 1.5 mL baru dan steril. 300 L dapar DF ditambahkan lalu dipurifikasi
dengan vortex dan diinbukasi pada 55-600C selama 10-15 menit hingga irisan gel terlarut
sempurna. Selama inkubasi tabung mikro dibolak-balik setiap 2-3 menit. Kemudian
campuran tersebut didiamkan dingin pada suhu kamar. Campuran tersebut dipipet dan
dimasukkan ke dalam kolom DF yang terpasang pada tabung penampang. Pada kecepatan
maksimum (13.000 rpm) disentrifusikan selama 30 detik. Cairan yang tertampung
dibuang dan kolom DF ditempatkan kembali pada tabung penampung. 600 L dapar
pencuci (wash buffer) yang telah ditambah etanol ditambahkan dan disentrifusi kembali
pada kecepatan maksimum selama 30 detik. Cairan yang terkumpul dibuang kembali dan
kolom DF ditempatkan kembali ke dalam tabung penampung, pada kecepatan maksimum
selama 3 menit disentrifus sampai membran kolom mengering. Kolom DF yang telah
kering dipindahkan ke dalam tabung mikro 1.5 mL yang baru dan steril. Kemudian 25 L
akuabides steril ditambahkan ke dalam bagian tengah dari membran kolom DF agar
pengendapan pada dinding kolom dapat dihindari. Biarkan akuabides terserapselama 2
menit kemudian pada kecepatan maksimum disentrifus selama 1 menit untuk
mendapatkan DNA murni. DNA disimpan pada suhu 20 oC. DNA hasil purifikasi diamati
secara visual, lalu DNA dianalisa kembali dengan elektroforesis agaros gel mini. Jika
informasi sekuens DNA amplikon diperlukan, maka dapat dilakukan sekuensing DNA.

VI.

ALUR KERJA

Hasil PCR +
loading buffer
dielektrofores
iskan di gel
agarosa

Pita yang
diinginkan
dipotong,
dipindahkan
ke tabung
mikro

Dapar DF
ditambahkan lalu
dipurifikasi
vortex,
kemudian
diinkubasi

Cairan
tertampung
dibuang,
tambahkan
dapar pencuci
dan etanol,
sentrifusi
kembali

Sentrifugasi
di
kecepatan
maksimum
(13.000
rpm) , 30
detik

Didinginkan,
dipipet, dimasukkan
ke kolom DF

(bioneer.com, 2016)

VII.

PEMBAHASAN

Cairan terkumpul
dibuang, tempatkan
di tabung
penampung,
sentrifugasi sampai
membran
mengering

Kolom DF dipindahkan,
tambahkan akuabides
steril ke bagian tengah
membran kolom, biarkan 2
menit, sentrifugasi
kecepatan maksimum

Didapatkan
DNA, disimpan
di suhu 20oC,
diamati,
dianalisis
dengan
elektroforesis
agaros gel mini

Bila hasil purifikasi menunjukan pita tunggal yang ukurannya sesuai yaitu tidak
terjadi perubahan ukuran setelah dilakukan purifikasi menunjukan bahwa purifikasi
berhasil dilakukan karena sampel tidak mengalami degradasi. Pita hasil purifikasi terlihat
lebih tebal dan lebih terang yang mengindikasikan bahwa pengotor telah berhasil
dibersihkan atau dihilangkan.
Tabel 2. Masalah yang sering terjadi dan penyelesaiannya
Masalah
Hasil rendah

Penyelesaian
Sel tidak lisis secara sempurna, terlalu banyak sel bakteri

yang digunakan
Proses purifikasi DNA tidak
1. Adanya kontaminasi RNA (sebelum menggunakan
berjalan dengan baik

bufer

PM1,

periksa

kembali

ditambahkan

apakah

masih

RNase A yang
layak

atau

sudah

kedaluarsa, dan juga terlalu banyak sel bakteri yang

dgunakan)
2. Adanya kontaminasi

DNA

genom

(jangan

menggunakan sampel kultur yang sebelumnya sudah

Kolom tersumbat

ditumbuhi bakteri)
Terlalu banyak sel bakteri yang digunakan (lebih dari 150 ml)

VIII. KESIMPULAN
Karena praktikum bersifat simulasi dan latihan terhadap keseluruhan pemahaman
terhadap purifikasi hasil PCR, maka perolehan hasil PCR murni tidak didapatkan namun
pembelajaran dapat dipahami.

IX.

DAFTAR PUSTAKA
D.J Harvey, D.R Wing, B Kster, I.B.H Wilson, Composition of N-linked carbohydrates
from ovalbumin and co-purified glycoproteins, Journal of the American Society
for Mass Spectrometry, Volume 11, Issue 6, June 2000, Pages 564-571, ISSN

1044-0305, http://dx.doi.org/10.1016/S1044-0305(00)00122-7.
(http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1044030500001227)
Eng.bioneer.com. (2016). AccuBead Silica Coated Magnetic Bead. [online] Available
at: http://eng.bioneer.com/products/Protein/MagneticBeads-technical.aspx
[Accessed 9 Apr. 2016].
Malik, Amarila. (2015). Penuntun Kerja :PCR, Purifikasi PCR, dan SDS-PAGE. Depok:
Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi Fakultas Farmasi UI.
Qiagin, S. (n.d.). Genomic DNA Purification. 1st ed. [ebook] Available at:
http://science.marshall.edu/murraye/links%20for%20students/samantha
%20qiagin%20method.pdf [Accessed 9 Apr. 2016].
Hidayatulloh, Syarif. PCR and Primer Design.
https://www.academia.edu/7722484/PCR_and_Primer_Design (diakses pada
Sabtu, 09 April 2016 pukul 22.01)
Aqmarina, Arie., dkk. Kloning Fragmen DNA Mikrosatelit Aquilaria malaccensis.
https://www.academia.edu/9162085/Kloning_Fragmen_DNA_Mikrosatelit_Aquil
aria_malaccensis (diakses pada Sabtu, 09 April 2016 pukul 22.35)

PEMOTONGAN/DIGESTI DNA PLASMID DENGAN ENZIM

RESTRIKSI
I.

PENDAHULUAN

DNA hasil isolasi masih berupa sekuens yang panjang dengan fragmen-fragmen
yang saling berikatan. Pemotongan dengan suatu enzim pada DNA tersebut dilakukan
untuk menghasilkan sekuens DNA tertentu yang spesifik. Enzim retriksi dapat mengenali
situs pengenalan pada DNA secara spesifik dan memotongnya secara spesifik.
Digesti merupakan proses pemotongan fragmen DNA dengan menggunakan suatu
enzim khusus yaitu enzim restriksi. Enzim restriksi yang digunakan yaitu enzim restriksi
endonuklease yang akan mengenali dan memotong fragmen DNA pada sekuens yang
spesifik. Fragmen yang dipotong akan digabungkan dengan suatu fragmen DNA lain
yang berperan sebagai vektor. Vektor merupakan molekul DNA yang dapat bereplikasi
secara autonom yang akan memfasilitasi proses manipulasi dan identifikasi molekul
DNA rekombinan yang terbentuk (Klug & Cummings, 1994).
Tiga jenis enzim restriksi endonuklease telah ditemukan, dan lebih dari 80 enzim
dari ketiga tipe telah dikenali. Enzim restriksi tipe I mengenali suatu DNA pada suatu
lokasi secara acak pada beberapa jarak dari situs pengenalannya. Enzim restriksi tipe II
mengenali suatu sekuens spesifik dan memotong dengan tepat kedua untai di dalam
sekuens. Enzim tipe ini, situs pengenalannya berupa palindromik yang membaca secara
sama arah 5 ke 3 pada untai komplementer. Enzim restriksi tipe III mengenali urutan
DNA yang spefisik dan memotong di dekat situs pengenalannya, biasanya sekitar 25 bp.
Dari 3 jenis, enzim tipe II yang sering digunakan pada teknik genetika. Satu diantaranya
enzim yang ditemukan berasal dari E.coli dan telah diberi nama EcoRI (Pierce, 2002).
II.

PRINSIP
Pemotongan fragmen DNA menggunakan enzim restriksi yaitu enzim restriksi
endonuklease yang akan mengenali dan memotong fragmen DNA pada sekuens yang
spesifik. Situs pengenalannya berupa palindromik yang membaca secara sama arah 5 ke
3 pada untai komplementer dan menghasilkan potongan ujung kohesif (sticky end) dan
ujung rata (blunt end).

III.

TUJUAN
Pemotongan DNA Plasmid dengan enzim restriksi bertujuan untuk memperoleh
fragmen DNA plasmid yang tergolong menjadi linier agar siap untuk disisipi dengan

fragmen DNA sisipan. Teknik digesti ini banyak dipakai untuk mengklon DNA asing ke
vektor, maupun pada verifikasi plasmid rekombinan.
IV.

ALAT DAN BAHAN

Bahan
a. pUC19 (yang diisolasi sebelumnya)
b.
Enzim endonuklease restriksi (ER): BamHI, EcoRI
c. Buffer masing-masing ER
d. dH2O steril (atau 1XTE pH 8)
e. Standar ukuran molekul DNA
Alat
a.
b.
c.
d.
e.

Pipet mikro 0-20 l

Pipet mikro 20-200 l
Tabung mikro 1,5 mL
Rak tabung mikro
Bak es dan es yang telah dihancurkan*)
*)

Bak es dan es ataupun cooler digunakan untuk menjaga agar kondisi buffer enzim

restriksi tidak terlalu hangat akibat suhu ruangan yang cukup tinggi 25-30oC. Sedangkan
untuk menjaga kondisi enzim restriksi tidak terpapar suhu tinggi ruangan menggunakan
chiller yang tersedia di dalam freezer -20oC.

V. CARA KERJA
1. Masukkan komponen-komponen berikut ke dalam tabung mikro:
DNA

Enzim restriksi/

(l)

10X buffer
(l)

Total Volume

5 unit (l)

dH2O steril
(l)

pUC19 (2)

20

pUC19 (2)

BamHI

20

pUC19 (2)

EcoRI

20

(l)

2. Inkubasikan pada 37oC; minimum 2 jam. (Ingat tidak semua enzim restriksi optimum
pada suhu 37oC). selama menunggu inkubasi, siapkan gel.
3. Tambahkan 5 L blue juice dan panaskan dalam penangas air 65oC; 5 menit.
4. Masukkan ke dalam sumur-sumur elektroforesis dengan urutan sebagai berikut (mulai
paling kiri):
Standar ukuran molekul
pUC19 BamHI
pUC19 EcoRI
pUC19 utuh

VI.

ALUR KERJA

Ambil DNA pUC19 2 l, masukkan ke tabung mikro

Masukkan enzim restriksi

Tambahkan 2 l 10x buffer

Tambahkan dH2O steril 4 l

Inkubasikan pada 37oC; minimum 2 jam

Tambahkan 5 l blue

juice, panaskan 5 menit;

65oC
Masukkan ke sumur
elektroforesis

VII.

PEMBAHASAN
Enzim restriksi yang digunakan pada praktikum ini adalah EcoRI dan BamHI.
Enzim EcoRI memotong DNA pada bagian yang urutan basanya adalah GAATTC
(sekuens pengenal bagi EcoRI adalah GAATTC). Di dalam sekuens pengenal tersebut ,
enzim EcoRI memotongnya tidak pada sembarang situs tetapi hanya memotong pada
bagian atau situs antara G dan A. Pada DNA utas ganda, sekuens GAATTC ini akan
berpasangan dengan sekuens yang sama tetapi berlawanan arah. Pemotongan yang hanya
situs G dan A saja berakibat fragmen-fragmen DNA utas ganda yang dihasilkan akan
memiliki ujung berutas tunggal. Ujung seperti ini yang dikenal dengan istilah sticky ends
atau cohesive ends. Sama halnya seperti EcoRI, enzim BamHI memiliki situs pengenalan
untuk dilakukan pemotongan dengan urutan basa 5-GGATCC-3 (utas atas) / 3CCTAGG-5 (utas bawah).
Buffer berfungsi untuk melisiskan membran sel dan membran fosfolipid bilayer.
dH2O atau disebut juga aqua destilata adalah air yang sangat murni karena telah melalui
berbagai macam cara permunian. Biasanya dH2O tidak perlu disterilkan lagi
menggunakan autoklaf. DNA atau RNA akan lebih stabil jika dilarutkan dalam TE buffer
karena pH-nya dijaga sekitar 8. Jika dilarutkan dalam dH 2O ada peluang untuk
berubahnya pH. Ini dapat terjadi karena DNA dan RNA memiliki sifat asam lemah, yang
dalam waktu lama dapat menyebabkan degradasi DNA/RNA.

VIII. KESIMPULAN

Pemotongan fragmen DNA menggunakan enzim restriksi yaitu enzim restriksi

endonuklease yang akan mengenali dan memotong fragmen DNA pada sekuens yang
spesifik. Enzim EcoRI memotong DNA pada bagian yang urutan basanya adalah
GAATTC. Sedangkan enzim BamHI memotong DNA pada bagian yang urutan basanya
adalah GGATCC.

IX.

DAFTAR PUSTAKA
Klug, WS & Cummings, MR. 1994. Concept of Genetics, 4th Ed. Prentice Hall:
Englewood cliffs.
Malik, A. 2016. Protokol Kerja Bioteknologi. Depok: Laboratorium Mikrobiologi dan
Bioteknologi Fakultas Farmasi Universitas Indonesia.
Pierce, BA. 2002. GENETICS: A Conceptual Approach, 3th Ed. Paperback.

LIGASI
I.

PENDAHULUAN
Tahap terakhir dalam penyusunan molekul DNA rekombinan adalah menyambung
molekul vektor dan molekul DNA yang akan diklon, proses ini disebut ligasi dan enzim
yang mengkatalisis reaksi disebut DNA ligase. Enzim ligase merupakan enzim yang
digunakan dalam manipulasi DNA. Enzim ini berfungsi untuk menyambung asam
nukleat menjadi satu, selain itu fungsinya di dalam sel untuk mereparasi tempat putusnya
untai tunggal (diskontinyuitas) yang terjadi pada molekul DNA untai ganda yang
mungkin terjadi pada replikasi DNA. DNA ligase yang berasal dari kebanyakan
organisme juga akan menyambung dua fragmen DNA untai ganda (Brown, 1991).
Keberhasilan penyambungan dua atau lebih molekul DNA ini tergantung dari
ujung-ujung dimana DNA akan disambung. Ujung-ujung tersebut harus kompatibel
sehingga penyambungan dapat berlangsung. Dua frgamen DNA dengan ujung yang
runcing (sticky end) akan mudah disambungkan satu sama lain daripada fragmen DNA

dengan ujung tumpul (blunt end). Terdapat tiga cara yang dapat dilakukan untuk meligasi
fragmen-fragmen DNA diantaranya adalah menggunakan enzim ligase yang diambil dari
bakteri, ligasi dengan menggunakan DNA ligase dari sel-sel Escherichia coli yang telah
diinfeksikan dengan bakteriofag T4 atau biasa disebut enzim T4 ligase, dan terakhir
dengan pemberian enzim deoksinukleotidil transferase. Dalam praktikum ini enzim yang
digunakan adalah T4 DNA ligase dan menggunakan bakteri E.coli.
II.

PRINSIP
Penyambungan dua ujung DNA yang semulanya terpotong oleh enzim ligase
dengan cara menyambung dua ujung DNA melalui ikatan kovalen antara ujung 3OH dari
utas satu dengan ujung 5P dari utas lain. Ligasi DNA ini digunakan untuk mengkatalisis
ikatan fosfodiester antara kedua ujung DNA sehingga fragmen yang terpotong dapat
bersatu.

III.

TUJUAN
Ligasi bertujuan untuk menyambungkan fragmen DNA sisipan dengan vektor DNA
sirkular yang telah menjadi linier untuk memperoleh suatu DNA rekombinan.

IV.

ALAT DAN BAHAN

Bahan
a.
b.
c.
d.

Fragmen Kanr (EcoRI+PstI) dari pUC4K

pUC19-EcoRI+PstI
T4-DNA ligase beserta buffer 5X atau 10X
dH2O steril
Alat
a.
b.
c.
d.
e.

Pipet mikro 0-20 l beserta tip-nya

Pipet mikro 20-200 l beserta tip-nya
Tabung mikro 1,5 mL
Rak tabung mikro
Bak es dan es yang telah dihancurkan
*)
Bak es dan es ataupun cooler digunakan untuk menjaga agar kondisi buffer enzim

restriksi tidak terlalu hangat akibat suhu ruangan yang cukup tinggi 25-30 oC. Sedangkan

untuk menjaga kondisi enzim restriksi tidak terpapar suhu tinggi ruangan menggunakan
chiller yang tersedia di dalam freezer -20oC.
V.

CARA KERJA
1. Masukkan komponen-komponen berikut ke dalam tabung mikro:
No
.

DNA Vektor
(l)

DNA Sisipan
(l)

dH2O
(l)

5X
buffer
ligase
(l)

pUC19EcoRI+PstI
(3)

---

12

20

15

20

20

2
@

--pUC19EcoRI+PstI
(2)

Kanr
-EcoRI+PstI
(5)
Kanr
-EcoRI+PstI
(8)

T4-DNA
Ligase
(l)

Total
Volume
(l)

Sebaiknya dibuat berbagai perbandingan komposisi DNA vektor-sisipan

Perhatian: Pekerjaan ini dilakukan di atas es

2. Inkubasikan semalam dalam lemari es ( 10-15oC). Campuran ini siap
ditransformasikan ke sel kompeten E. coli DH5.

DNA Vektor

VI.

ALUR KERJA
Tambahkan DNA Sisipan

T4 DNA Ligase 1 l

Tambahkan 4 l 5x buffer ligase

Tambahkan ddH2O

Inkubasikan semalam dalam

lemari es ( 10-15oC)

VII.

PEMBAHASAN
Pada praktikum ligasi, enzim yang digunakan untuk ligasi adalah T4 DNA ligase.
Peran T4 DNA ligase adalah pembentukan ikatan fosfodiester antara nukleotida DNA
yang akan disambung dengan kofaktor ATP. Enzim ini mengkatalisasi pembentukan
ikatan kovalen antara gula dengan fosfat dari nukleotida yang berdekatan, sehingga
terbentuk ikatan phospodiester dimana satu nukleotida memiliki ujung 5 phosphate
bebas dan nukleotida lain memiliki ujung 3 gugus hidroksil. Ligasi berhasil bila kedua
ujung fragmen DNA yang akan disambungkan berkomplemen.
Mekanisme T4 DNA ligase dalam penggabungan DNA adalah terjadinya hidrolisis
kofaktor, yaitu NAD+ atau ATP. Hidrolisis kofaktor ini menghasilkan enzim adenylate
AMP yang berikatan kovalen dengan protein lysin pada sisi aktif enzim dengan
melepaskan pyrophospate inorganic (PPi). Kemudian sebagian AMP akan berpindah dari
sisi aktif lysin ke ujung bebas 5 fosfat. Ujung 3-OH akan menyerang ikatan AMP-5fosfat sehingga terbentuklah ikatan fosfodiester antara ujung 3-OH dengan 5-fosfat
serta melepaskan AMP dan enzim adenylate.
Buffer berfungsi untuk melisiskan membran sel dan membran fosfolipid bilayer.
Buffer yang digunakan adalah 10x Buffer Ligase. dH2O atau disebut juga aqua destilata
adalah air yang sangat murni dan tidak perlu disterilkan lagi menggunakan autoklaf.
DNA atau RNA akan lebih stabil jika dilarutkan dalam buffer karena pH-nya dijaga

sekitar 8. Jika dilarutkan dalam dH 2O ada peluang untuk berubahnya pH. Ini dapat terjadi
karena DNA dan RNA memiliki sifat asam lemah, yang dalam waktu lama dapat
menyebabkan degradasi DNA/RNA.
VIII. KESIMPULAN
Ligasi merupakan penyambungan dua ujung DNA yang semulanya terpotong oleh
enzim ligase. Enzim ligase yang digunakan adalah T4 DNA ligase dengan cara
menyambung dua ujung DNA melalui ikatan kovalen antara ujung 3OH dari utas satu
dengan ujung 5P dari utas lain dan mengkatalisis ikatan fosfodiester antara kedua ujung
DNA.
IX.

DAFTAR PUSTAKA
Brown, TA. 1991. Pengantar Cloning Gen. Yogyakarta: Yayasan Essentia Medica.
Klug, WS & Cummings, MR. 1994. Concept of Genetics, 4th Ed. Prentice Hall:
Englewood cliffs.
Malik, A. 2016. Protokol Kerja Bioteknologi. Depok: Laboratorium Mikrobiologi dan
Bioteknologi Fakultas Farmasi Universitas Indonesia.
Pierce, BA. 2002. GENETICS: A Conceptual Approach, 3th Ed. Paperback.