LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI FARMASI

PRAKTIKUM 7
KONSTRUKSI PLASMID (SELEKSITRANSFORMASI)

Nama : Pramudia Putra Muhawandi

NIM : 200106143
Kelompok : 4D

Hari/Tanggal Praktikum : Jumat, 13 Januari 2023

Dosen Pengampu : apt. Anis Puji Rahayu, M.Si.

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH BANDUNG
2022-2023
I. TUJUAN

1.1 Menentukan, Menetapkan Metode dan Melaksanakan Prosedur Seleksi

Transforman

II. PRINSIP PERCOBAAN

Prinsip dari transformasi berdasarkan hasil ligasi fragmen DNA yang
dimasukkan dengan vektor kloning ke dalam sel E. coli. Pada proses
transformasi disiapkan terlebih dahulu sel kompeten, merupakan sel yang
disiapkan untuk menerima hasil ligasi (Rostinawati dan Retnoningrum., 2016).
Lalu untuk seleksi transforman memiliki prinsip seleksi untuk memilih sel inang
transforman yang membawa DNA rekombinan. Selanjutnya, di antara sel-sel
transforman yang membawa DNA rekombinan masih harus dilakukan seleksi
untuk mendapatkan sel yang DNA rekombinannya membawa fragmen sisipan
atau gen yang diinginkan.
Untuk seleksi resistensi antibiotik memiliki prinsip untuk mengetahui
berhasil tidaknya sebuah plasmid diinsersikan ke dalam sel inang (Casali, 2003).
Ketika plasmid yang mengandung gen merB berada di dalam E. coli, maka
bakteri tersebut akan mengalami transformasi yaitu perubahan resistensi
terhadap antibiotik ampisilin. Hal ini dikarenakan pada plasmid terdapat gen
yang resisten terhadap antibiotik ampisilin. Bakteri E. coli yang awalnya tidak
mampu bertahan hidup (tidak resisten) pada media yang mengandung antibiotik
ampisilin, setelah memperoleh plasmid yang mengandung gen resisten ampisilin
menjadi mampu bertahan hidup (resisten) pada media yang mengandung
antibiotik ampisilin (Rotinsulu, et.al., 2019).
III. ALAT DAN BAHAN
3.1 Alat

No. Alat Kegunaan Gambar Alat

1. BSC Untuk bekerja

secara aseptis karena
(Biosafety BSC mempunyai
Cabinet) pola
pengaturan dan
penyaring aliran
udara sehingga
menjadi steril dan
aplikasi sinar UV
beberapa jam
sebelum digunakan.
2. Botol semprot Untuk menyimpan
alcohol 70%

3. Bunsen Untuk melakukan

pemanasan

4. Catu Daya Untuk memasok

listrik energi untuk
satu atau lebih
beban listrik

5. Cawan selektif Untuk membiakkan

sel dengan
menyediakan
penyimpanan dan
mencegah terjadinya
kontaminasi
6. Cetakan Gel Untuk membuat gel
Agarosa agarosa

7. Conical tube menampung bahan

yang akan
diendapkan dalam
mesin sentrifugasi

8. Elektroforesis Untuk memastikan

molekul berdasarkan
molekul berdasarkan
ukuran

9. Erlenmeyer Untuk wadah bahan

kimia cair

10. Gelas Ukur Untuk mengukur

volume larutan atau
zat cair
11. Inkubator Memproduksi
kumpulan mikroba
dan menginkubasi
kultur suatu media
atau media pada
temperatur tertentu

12. Jarum Ose Menginokulasi

mikroba dari suatu
media ke media
lainnya

13. Kit isolasi Tempat untuk

plasmid memisahkan
plasmid dari
molekul yang
terdapat di
dalam sel
14. Kolom PD Untuk wadah cairan

15. Mikropipet Untuk memindahkan

larutan atau cairan
dari satu tempat ke
tempat yang lainnya,
tetapi untuk volume
yang sangat kecil <
1 mL

16. Mikrotube Untuk melindungi

agar melakukan
sampel tetap steril
dalam isolasi
plasmid

17. Mircrowave Untuk keperluan

sterilisasi kering
18. PCR Untuk
mengaplikasikan
nukleotida

19. Roller Drum Untuk

menumbuhkan
preparat dengan
menggunakan
metode roller tub

20. Spektrofotometer Untuk mengukur

transmitan atau
absorbans suatu
sampel sebagai
fungsi panjang
gelombang

21. Sentrifugasi Untuk memisahkan

pelet dengan
substansi dari
sampel cair

22. Sisir Sumur Gel Untuk pembentukan

Agarosa sumur

23. Tabung reaksi Untuk menampung

sampel

24. Tangki Untuk tempat

elektroforesis running
elektroforesis
25. Thermal cycler Untuk
memperbanyak
segmen DNA
melalui polymerase

26. Tip Untuk mengambil

larutan dalam
jumlah kecil

27. Tube polymerase Untuk menyimpan

bahan dalam bentuk
cairan

28. Uv Untuk
transluminato memvisualisasi
r DNA setelah proses
elektroforesis

29. Vortex mixer Untuk

mencampurkan
larutan yang ada
dalam tabung reaksi

30. Water bath Untuk proses

pemanasan reagen
atau cairan lainnya
3.2 Bahan

No Bahan Kegunaan Pre-Caution

1. 10x buffer o Untuk proses restriksi dan Toksisitas,

ligasi iritasi mata

2. 10x loading buffer Sebagai pemberat agar Toksisitas,

tidak keluar dari sumur iritasi mata
gel agarosa dan untuk
penambah densitas

3. Agarosa Sebagai pemadat dan Tidak

sebagai media berbahaya
elektroforesis

4. Antibiotik Untuk sekesi DNA Tidak

rekombinan berbahaya
menggunakan resistensi
antibiotik

5. Antibiotik Kelompok obat yang Tidak

ampisilin digunakan untuk berbahaya
mengatasi dan mencegah
infeksi

6. Buffer Sebagai larutan Tidak

elektroforesis penyangga berbahaya

7. Binding buffer Untuk melakukan DNA Dapat terjadi

binding kerusakan pada
mata

8. DNA Clean up kit Untuk membersihkan Iritasi

DNA

9. DNA plasmid DNA untuk proses Tidak

transformasi berbahaya

10. Ethanol Untuk pencucian DNA Iritasi

11. Elution buffer Untuk melakukan elusi Tidak
pada bagian berbahaya
tengahmatrik kolom PD

12. Ethanol absolut Untuk proses pencucian Iritasi

pada isolasi plasmid dan
untuk pengendapan DNA

13. Enzim restriksi Untuk memotong Iritasi

Hindi I dan plasmid (ligasi)
10x buffer
spesifik
14. Enzim Untuk memotong ujung Tidak
restriksi NotI dan tumpul DNA (ligasi) berbahaya
10x buffer spesifik

15. Enzim Untuk memotong ujung Tidak

restriksi NotI tumpul DNA (stiky end) berbahaya
dan salt
16. Es batu Untuk melakukan Tidak
pendinginan pada berbahaya
penyiapan sel kompeten

17. Etidium bromide Untuk pewarna DNA Alergi pada

hasil elektroforesis gel kulit
agarosa

18. Larutan Untuk meneruskan arus Iritasi

penyangga TAE listrik sehingga diterima
(trisiacatale oleh fragmen DNA yang
EDTA) berada pada gel agarosa

19. Larutan CaCl2 Untuk mengganggu Tidak

keseimbangan kalsium berbahaya
dalam membrane
berhasil terbuka dan
DNA insert dapat masuk

20. Lysogeny Sebagai media bakteri Tidak

broth (LB) berbahaya
21. Kultur E.coli Sebagai sampel kultur Tidak
berbahaya

22. Koloni tunggal Sebagai koloni sel yang Tidak

sel E.Coli BL21 akan diinokulasi pada berbahaya
media LB cair

23. Media DNA Sebagai media penanda Tidak

berbahaya

24. Media LB cair Untuk menseleksi Tidak

plasmid rekombinan dan berbahaya
untuk menumbuhkan
bakteri. Keperluan
analisis bakteri gram
negative

25. Media LB steril Untuk menumbuhkan Tidak

bakteri E. coli berbahaya

26. MgCl-free Menstimulasi aktivitas Tidak

PCR buffer DNA polymerase berbahaya

27. Nuclease Untuk menjaga pH Tidak

free buffer optimum pada proses berbahaya
restriksi agar stabil

28. Nuclease Untuk meloloskan DNA Tidak

free water dari membrane tabung berbahaya
eppendorf dan untuk
mengurangi penanda
SDS

29. PD 1 buffer Untuk resuspensi Tidak

berbahaya

30. Pd 2 buffer Untuk lisis Tidak

berbahaya
 31. Pd buffer Untuk netralisasi Tidak
berbahaya

32. Plat agar Untuk seleksi plasmid Tidak

LB rekombinan berbahaya
mengandun
g Ampisilin
33. Sampel DNA Sebagai sampel uji Tidak
elektroforesis berbahaya

34. Taq DNA Untuk tahap pemisahan Tidak

polymerase 5U denaturasi sel template berbahaya
DNA

35. Template DNA Sebagai cetakan untuk Tidak

pembentukan molekul berbahaya
DNA yang sama

36. Wash buffer Untuk membersihkan Tidak

kolom PD berbahaya

37. Rnase Sampel plasmid Iritasi

IV. PROSEDUR
4.1 Tahap Penumbuhan Kultur
Transforman Pertama diambil 5 (lima) koloni yang tumbuh pada hasil
transformasi, kemudian diinokulasikan masing-masing ke dalam 3 mL media
LB cair yang mengandung ampisilin 100 µg/µL. Lalu ditumbuhkan overnight
pada suhu 37ºC dengan moderate shaking (250 rpm).
4.2 Tahap Isolasi Plasmid

Ditambahkan RNase A ke PD1 Buffer, kemudian dicampur dengan cara

diguncang selama beberapa detik. Lalu centang kotak di botol dan disimpan
campuran PD1 dan RNase A pada 2- 8ºC hingga 6 bulan.Selanjurnya
ditambahkan etanol absolut ke Wash Buffer sebelum penggunaan pertama.
4.2.1 Panen sel
Ditransfer 1,5 ml kultur sel ke mikrotube. Kemudian sentrifuga tabung
 pada 14-16.000 xg selama 1 menit kemudian buang supernatan. (Jika
menggunakan lebih dari 1,5 ml kultur sel bakteri, ulangi tahapan panen
sel)
4.2.2 Resuspensih
Ditambahkan 200 μl PD1 Buffer (pastikan RNase A telahditambahkan)
ke dalam tabung. Selanjutnya resuspensi pelet sel dengan vortex atau
pipetting.
4.2.3 Lisis
Ditambahkan 200 μl PD2 Buffer (pastikan semua presipitat terlarut),
kemudian dicampur dengan cara membalik tabung 10 kali. Lalu
diamkan pada suhu udara paling tidak untuk setidaknya 2 menit
(jangan melebihi 5 menit) catatan: Jangan vortex untuk
menghindaripemotongan DNA genom.
4.2.4 Netralisasi
Ditambahkan 300 μl PD3 Buffer dan diaduk segera dengan membalik
tabung 10 kali, kemudian sentrifuga pada 14-16.000 xg selama 3 menit.
4.2.5 DNA-binding
Diletakkan Kolom PD dalam tabung penampung. Lalu ditambahkan
supernatan dari langkah sebelumnya, kemudian sentrifuga pada 14-
16.000 xg selama 30 detik. Selanjutnya supernatant pada tabung
penampung dibuang dan diletakkan kembali Kolom PD dalam tabung
penampung.
4.2.6 Pencucian dan Pengeringan

Ditambahkan 600 μl Wash Buffer (pastikan ethanol sudah

ditambahkan) ke dalam kolom PD lalu sentrifugasi pada 14- 16.000xg
selama 30 detik. Kemudian supernatant pada tabung
penampungdibuang. Lalu letakkan kembali Kolom PD di tabung
penampung. Selanjurnya sentrifuga pada 14-16.000 xg selama 3 menit
untuk mengeringkan matriks kolom. Lalu tabung penampung dibuang
dandiletakkan kembali Kolom PD di tabung Mikrotube 1,5 ml yang
baru.
4.2.7 Elusi
Ditambahkan 50 μl elution buffer pada bagian tengah matriks
KolomPD. Kemudian didiamkan selama minimal 2 menit. Lalu
sentrifuga pada 14-
 16.000 xg selama 2 menit untuk mengelusi DNA yang telahdimurnikan.
4.3 Tahap Digesti
Menggunakan Enzim Restriksi Plasmid yang telah diisolasi dan diketahui
konsentrasinya kemudian siap untuk didigesti menggunakan enzim restriksi
NotI dan SalI. Disiapkan reagen yang akan digunakan.
Dilakukanpencampuran pada reagen plasmid, enzim notlI, enzim SalI, 10x
buffer o dan nuclease free water. Kemudian diortex dan spin down
masingmasing campuran. Lalu diinkubasi masing-masing campuran pada
suhu 37℃selama 4 jam.
4.4 Clean-up
Hasil Digesti Ditambahkan Binding Buffer dengan volume 1:1 dengan
volume larutan hasil PCR. Kemudian diperhatikan warna campuran. Hasil
warna kuning menunjukkan pH optimal.
4.4.1 DNA-binding
Diletakkan Kolom PD dalam tabung penampung. Lalu ditambahkan
supernatan dari langkah sebelumnya, kemudian sentrifuga pada 14-
16.000 xg selama 30 detik. Selanjutnya supernatant pada tabung
penampung dibuang. Setelah itu, letakkan kembali Kolom PD dalam
tabung penampung.

4.4.2 Pencucian
Ditambahkan 700 μl Wash Buffer (pastikan ethanol sudah
ditambahkan) ke dalam kolom lalu sentrifugasi pada 14-16.000 xg
selama 30 detik. Lalu supernatant pada tabung penampung
dibuang.Kemudian diletakkan kembali Kolom PD di tabung
penampung.
4.4.3 Pengeringan
Disentrifuga pada 14-16.000 xg selama 3 menit untuk mengeringkan
matriks kolom. Kemudian tabung penampung dibuang. Setelah itu,
letakkan kembali Kolom PD di tabung Mikrotube 1,5 ml yang baru.
4.4.4 Elusi
Ditambahkan 50 μl elution buffer pada bagian tengah matriks
KolomPD. Lalu didiamkan selama minimal 2 menit. Setelah itu,
sentrifugapada 14-
16.000 xg selama 2 menit untuk mengelusi DNA yang telahdimurnikan.
4.5 Konfirmasi Hasil Restriksi Melalui Elektrforesis Agarosa
4.5.1 Pembuatan Gel agarose
 Disiapkan volume buffer elektroforesis yang memadai (TAE lihat
Kritis Parameter, buffer elektroforesis) untuk mengisi tangki
elektroforesis dan menyiapkan gel. Lalu ditimbang agarose untuk
volume 40 mL. Kemudian dituang larutan penyagga TAE 1x ke dalam
labu erlenmeyer. Tutup mulut labu Erlenmeyer. Selanjutnya dilarutkan
agarosa dengan cara dipanaskan di dalam microwave. Kemudian
agarosa yang telah dipanas didinginkan dahulu sebelum dituang ke
cetakan gel. Lalu disegel cetakan gel jika terbuka pada sisi yang
terbuka. Dituang agarosa leleh dan masukkan sisir gel, pastikan tidak
ada gelembung yang terperangkap di bawah sisir dansemua gelembung
di permukaan agarosa dihilangkan sebelum gel mengeras.
4.5.2 Dimasukkan gel dan dijalankan perangkat elektroforesis

Setelah gel mengeras, dilepaskan selotip dari ujung terbuka cetakan gel
dan tarik sisir gel, berhati-hatilah agar tidak merobek sumur sampel.
Kemudian cetakan gel yang berisi gel set dimasukkan ke tangki
elektroforesis. Lalu dituang buffer elektroforesis hingga merendam gel
hingga kedalaman sekitar 1 mm (atau hanya sampai bagian atas sumur
terendam). Selanjutnya dipastikan tidak ada kantong udara yang terjebak
di dalamnya sumur. Kemudian di campurkan 5 µL sampel DNA dengan
2 µL Loading dye dan dipipet campuran tersebut dan 5 µL marka DNA
ke dalam sumur gel yang terpisah. Kemudian ditutup tangki
elektroforesis dan pastikan Input listrik sudah masuk kedalam Shocket
sehingga DNA akan berpindah ke arah gel anoda atau lead positif. Atur
voltase menjadi
40 V dan waktu eletroforesis selama 50 menit, kemudian jalankan
elektroforesis. Lalu dimatikan catu daya jika pewarna biru bromphenol
dari Loading buffer telah bermigrasi hingga jarak yang dinilai cukup
untuk pemisahan fragmen DNA. Gel kemudian diwarnaidengan
merendam gel dalam larutan encer etidium bromida (0,5 g / ml dalam
air) dan diaduk perlahan 10 sampai 30 menit. Gel direndamdi dalam air
selama 30 menit. Pada sumur agarosa tempatkan 3 µL marka DNA, 2 µL
hasil restriksi, dan 2 µL plasmid yang belum direstriksi.

V. HASIL PENGAMATAN
5.1 Hasil Pegamatan

Hasil elektrogram dengan keterangan,Ket

:
1. Koloni A
2. Koloni B

3. Koloni C
4. Koloni D
5. Koloni E
6. Plasmid sebelum digesti
7. DNA ladder (bp)

5.2. Studi Kasus

Ket :
1. Koloni A
Koloni A terletak pada ukuran 3500 bp yang mejadikan migrasi
pergerakkannya menjadi lambat atau sulit dikarenakan ukuran nya
besar.Hal ini juga sama dengan koloni B, dimana koloni A dan B memiliki
pergerakkan yang sama dan ukuran yang sama. Dapat di duga bahwasannya
pita ini merupakan pita plasmid rekombinan TAGZyme - subB.
2. Koloni B
Pada koloni B didapatkan 2 pita dimana pita yang satu berukuran
sekitar3500 bp dan pita kedua berukuran 1000 bp. Pita koloni B terletak
pada ukuran 3500 bp yang mejadikan migrasi pergerakkannya menjadi
lambatatau sulit dikarenakan ukuran nya besar. Lalu pada pita koloni B
yang terletak pada ukuran 1000 bp migrasi nya lebih cepat karena
ukurannya

yang ringan. Dapat di duga bahwasannya pita 3500 bp merupakanplasmid

sedangkan pita pada 1000 bp merupakan DNA.
3. Koloni C
Pada koloni C tidak didapatkan satupun pita. Hal ini kemungkinan nya
karena tidak berhasilnya DNA untuk bermigrasi sehingga tidak terdapatnya
pita pada elektroforesis gel agarose. Beberapa faktor yang sangat
mempengaruhi keberhasilan proses elektroforesis diantaranya adalahukuran
molekul DNA, konsentrasi gel agarose, konformasi DNA, voltase,
keberadaan pewarna DNA dan komposisi buffer elektroforesis.
Keberhasilannya dapat dilihat dengan adanya pita pada elektroforegam.
4. Koloni D
Pada koloni D, didapatkan pita di ukuran 4000 bp. Pita koloni D ini
bergerak atau memiliki migrasi yang sangat lambat dibandingkan pita
lainnya. Hal ini dikarenakan pita koloni D memiliki ukuran yang besar dan
sesuai teori, semakin besar ukurannya maka semakin lambat waktu mjgrasi
nya. Dapat di duga bahwasanya pita ini merupakan berat
plasmidrekombinan.
5. Koloni E
Pada koloni E didapatkan 2 pita dimana pita yang satu berukuran
sekitar3500 bp dan pita kedua berukuran 1000 bp. Pita koloni E terletak
pada ukuran 3500 bp yang mejadikan migrasi pergerakkannya menjadi
lambatatau sulit dikarenakan ukuran nya besar. Lalu pada pita koloni E
yang terletak pada ukuran 1000 bp migrasi nya lebih cepat karena
ukurannya yang ringan. Dapat di duga bahwasannya pita 3500 bp
merupakanplasmid sedangkan pada pita 1000 bp merupakan insert DNA.
6. Plasmid sebelum digesti
Pada koloni F, didapatkan pita di ukuran 4000 bp. Pita koloni F ini bergerak
 atau memiliki migrasi yang sangat lambat dibandingkan pita lainnya. Hal
ini dikarenakan pita koloni D memiliki ukuran yang besar dan sesuai teori,
semakin besar ukurannya maka semakin lambat waktu

mjgrasi nya. Dapat di duga bahwasanya pita ini merupakan berat plasmid
sebelum di digesti.
7. DNA ladder (bp)
DNA ladder atau marker merupakan kumpulan fragmen yang spesifik dan
telah diketahui ukurannya yang berfungsi sebagai penanda untuk
memperkirakan ukuran DNA hasil amplifikasi. Setelah elektroforesis, DNA
divisualisasi di atas lampu UV untuk melihat pita-pita DNA.
 Dari elektroforegram yang diperoleh:
1. Manakah koloni yang membawa plasmid rekombinan yang diharapkan?
Jelaskan!
Jawab :
Koloni no 2 dan no 5. Karena digesti yang digunakan itu adalah enzim
retriksi dan terdapat 2 pita yang terbentuk yang masing-masingnyamemiliki
3500 bp dan 1000 bp, dimana pita yang memiliki 3500 bp merupakan
plasmid dan pita yang memiliki 1000 bp yaitu insert DNA.
2. Jelaskan pada setiap sampel apa yang terjadi dan bagaimana cara
mengatasinnya (jika tidak sesuai dengan yang diharapkan)!
Jawab :
 Koloni A, bentuk pita tidak jelas karena terkontaminan oleh
senyawayang ikut terekstraksi. Solusinya, diberi larutan peluntur
Destainingsolution.
 Koloni B, mengalami pemotongan yang baik yaitu membentuk 2
ukuran plasmid yaitu 3,5 kb dan 1 kb.
 Koloni C, tidak muncul pita karena terlalu lalu lama direndam dalam
buffer TAE. Solusinya, waktu optimal perendaman 30-50 menit.
 Koloni D, bentuk pita tidak jelas karena terkontaminan oleh
senyawayang ikut terekstraksi. Solusinya, diberi larutan peluntur
Destainingsolution.
 Koloni E, mengalami pemotongan yang baik yaitu membentuk 2
ukuran plasmid yaitu 3,5 kb dan 1 kb.

 Plasmid sebelum digesti, bentuk pita tidak jelas karena plasmid belum
terestriksi
 3. Bagaimana cara memperbanyak dan menyimpan transforman yang telah
dipastikan membawa plasmid rekombinan yang diinginkan!
Jawab :
Memperbanyak transforman dapat dilakukan dengan cara kloning gen,
kloning gen adalah teknik untuk memperbanyak gen. Teknik ini dilakukan
dengan insersi fragmen DNA rekombinan melalui suatu pembawa gen
berupa plasmid, bakteriofage, dan kosmid (Sudjadi, 2008). Setelah itu,
pembawa gen diinsersi ke dalam sel inang, kemudian DNA rekombinan
diperbanyak melalui propagasi atau pembelahan organismeinang. Selain itu
memperbanyak dan menyimpan transforman dengan cara merangkai
konstruksi plasmid pada suhu 25-37◦C yang diakhiri dengan seleksi
transforman dari hasil transformasi.
- DNA yang ingin disisipkan, diisolasi dan dipotong oleh enzim retriksi
endonuklease, ditempat yang urutan nukleotidanya spesifik
- Plasmid bakteri e.coli, diisolasi dan dipotong pula oleh enzim yang sama.
Plasmid ini biasanya disebut sebagai vektor pengklon
- Fragmen DNA kemudian disisipkan kedalam vektor dan disatukan oleh
enzim ligase.

VI. DISKUSI DAN PEMBAHASAN

6.1 Diskusi

1. Apa yang dimaksud dengan Satellite Colonies? Apakah

koloni jenis ini dapat dipilih untuk seleksi transforman?
Jelaskan! Jawaban:
 Koloni satelit adalah pertumbuhan sel oportunistik yang tidak
berubah karena pelat seleksi dibiarkan di inkubator cukup lama
agar dapat tumbuh di tempat yang dimiliki laktamase menyebarke
dalam agar-agar.
 Selama pemilihan antibiotik, Anda mungkin melihat beberapa
koloni kecil tumbuh di sekitar koloni besar di cawan petri. Koloni
kecil ini adalah koloni satelit dan koloni besar adalah koloni yang
diminati, yang mengandung gen resistensi antibiotik(penanda yang
 dapat dipilih) dan sisipan gen (Kroemer, T., 2022).
2. Hitung volume plasmid yang dibutuhkan untuk proses digesti oleh
enzim restriksi jika konsentrasi plasmid hasil isolasi diperoleh sebesar
0,2 µg/µL!
Jawaban:
Diketahui: Ukuran plasmid = 4.5kb (4500pb)
Konsentrasi plasmid = 0,2 µg/µL
Rumus: plasmid (µg) x insert/plasmid x insert lenght (bp)/plasmid
size(bp)= insert needed (µg)
Berapa jumlah DNA insert (500bp) yang diperlukan? (uL)
= 500 ng x 5 x 500 = 27,77 ng
1 4500bp

Berapa volume plasmid yang diperlukan?

0,2 µg /uL =0,00072ng
2777,77 ng

3. Gambarkan elektroforegram yang akan diperoleh dari hasil seleksi

transforman pada praktikum ini! Interpretasikan hasil elektroforegram
tersebut!
Jawaban:
Diketahui :
 Berat plasmid rekombinan : 3700 pb (3,7 kb)
 Plasmid rekombinan TAGZyme - subB : 4500 pb (4,5 kb)
 Enzim restriksi yang digunakan : NotI dan HindIII
 Sumur 1 : NotI
 Sumur 2 : NotI dan HindIII
 Perhitungan DNA rekombinan :
= (Plasmid DNA rekombinan TAGZyme - subB) - (Berat plasmid
rekombinan)
= 4500 pb - 3500 pb
 = 1000 pb

Interprestasi :
Sumur 1 : TAGZyme + DNA sisipan
Sumur 2 : TAGZyme
I : Memiliki migrasi yang lambat dikarenakan memiliki ukuran pb
yangbesar yakni plasmid serta DNA sisipan
II : Memiliki migrasi yang cepat karena memiliki ukuran pb yang
kecilyakni plasmid saja.

4. Jelaskan prinsip 2 (dua) metode lain yang dapat digunakan untuk seleksi
transforman!
Jawaban:
1. Seleksi Antibiotik
Prinsip : Ketika plasmid yang mengandung gen merB berada di dalam
E.coli, maka bakteri tersebut akan mengalami transformasi yaitu
perubahanresistensi terhadap antibiotik ampisilin. Hal ini dikarenakan pada
plasmidterdapat gen yang resisten terhadap antibiotik ampisilin. Bakteri E.
coli yang awalnya tidak mampu bertahan hidup (tidak resisten) pada media
yang mengandung antibiotik ampisilin, setelah memperoleh plasmid yang
mengandung gen resisten ampisilin menjadi mampu bertahan
hidup(resisten) pada media yang mengandung antibiotik ampisilin
(Rotinsulu,et.al., 2019).
2. Seleksi Biru Putih
Prinsip : Digunakan enzim β-galaktosidase. β-galaktosidase adalah enzim
yang dihasilkan dari ekspresi gen lacZ. Gen ini diatur ekspresinyaoleh
operon lac. Aktivator untuk ekspresi gen ini adalah molekul laktosayang
dalam jumlah tertentu dapat menginduksi terekspresinya gen lacZ. Pada
MCS terdapat gen lacZ yang akan mengkode β- galaktosidase. Sehingga
X-gal
 akan menjadi biru. Apabila telah ada DNA sisipan, makaDNA sisipan tsb
akan merusak gen lacZ → β-galaktosidase tidak diproduksi X-gal tidak
diuraikan = putih (Kauffman, S., 1995) (Gupta, P.K., 2008).
5. Jika metode seleksi transforman yang akan digunakan adalah seleksi biru
putih, jelaskan minimal 3 (tiga) faktor utama yang harus dipertimbangkan agar
seleksi berjalan dengan sukses
Jawaban:
Protokol utama dan lengkap skrining biru-putih mencakup 3 langkahpenting:
A. Ligasi: ligasi DNA asing ke MCS vektor plasmid

B. Transformasi: pengenalan vektor plasmid dengan memasukkan DNA asing

ke dalam E. coli yang kompeten
C. Skrining: skrining biru-putih untuk mengidentifikasi koloni bakteri
rekombinan
Faktor utama yang harus dipertimbangkan:
1. Jenis vektor yang tepat dan sel kompeten merupakan pertimbangan
penting saat merencanakan layar biru-putih.
2. Plasmid harus mengandung lacZα, dan contoh plasmid tersebutadalah
pUC19 dan pBluescript.
3. Sel E. coli harus mengandung gen lacZ mutan dengan urutan yang
dihapus (yaitu lacZΔM15), dan beberapa sel yang umum digunakan
dengan genotipe tersebut adalah JM109, DH5α, dan XL1-Blue.
4. Adanya glukosa, karena perlu diketahui bahwa operon lac dipengaruhi
oleh adanya glukosa. Protein EIIAGlc, yang terlibat dalam impor
glukosa, mematikan permease laktosa saat glukosa diangkut ke dalam
sel. Oleh karena itu, media yang digunakan dalam cawan agar tidak
boleh mengandung glukosa.
5. Cahaya, X-gal sensitif terhadap cahaya dan oleh karena itu larutan dan
pelat yang mengandung X-gal harus disimpan dalam gelap.
6. Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG), yang berfungsi sebagai
penginduksi operon lac, dapat digunakan dalam media untuk
meningkatkan ekspresi LacZ.
6. Mengapa dalam praktikum ini tidak digunakan seleksi biru putih?
Jelaskan!
 Jawaban:
Karena pada plasmid nya terdapat gen penanda seleksi, yakni gen resistensi
antibiotik ampicillin yang berguna untuk seleksi klon. Sehingga digunakan
seleksi antibiotik dibandingkan seleksi biru putih. Lalu, untuk seleksi biru
putih ini membutuhkan MCS (multiple cloning site) yang terdapat gen
lacZuntuk (mengkode β- galaktosidase), X-gal → biru.

7. Tindakan apa yang dapat dilakukan jika diketahui tidak terdapat DNA
insert dalam plasmid yang diisolasi? Jelaskan
Jawaban:
 Mengulang tahapan awal dengan cara membuat ulang konstruksi plasmid
rekombinan yang baru, disiapkan vektor (plasmid) dan insert (gene of
your interest).
 Agar insert ini bisa masuk dan menyisip ke dalam vektor pada posisi dan
orientasi yang benar, maka perlu dilakukan pemotongan dengan enzim
restriksi. Dipilih pemotongan yang menghasilkan hasil lancip. Ujung
potongan yang kohesif sangat menguntungkan karena pasanganinsert dan
vektor akan dapat diligasi jiga dipotong dengan enzim restriksi yang sama.
Sedangkan ujung tumpul akan dapat menempel dengan ujung tumpul
lainnya yang tidak spesifik.
 Singkatnya, untuk preparasi:
vektor: vektor murni prep → digesti → isolasi dari gel → penetapan
konsentrasi → ligasi
insert: amplifikasi →isolasi dari gel → digesti → ekstraksi fenol-
kloroform → penetapan konsentrasi → ligasi
 Agar bisa melakukan reaksi ligasi dengan baik dilakukan purifikasi vektor
maupun insert, agar tidak terkontaminasi dengan fragmen- fragmen DNA
yang lain. Oleh karena itu, biasanya vektor yang telah dipotong di-run
pada gel agarosa, dan diisolasi fragmen yang diinginkan dari gel. Sebelum
melakukan reaksi ligasi, diperlukan penetapan konsentrasi DNA vektor
maupun insert, karena perbandingan yang tidak sesuai dapat menyebabkan
hasil yang tidak diinginkan
6.2 Pembahasan
Pada percobaan kali ini dilakukan praktikum konstruksi plasmid uji
transformasi dan seleksi transforman. Tujuan dari praktikum kali ini yaitu
Mengidentifikasi metode dan melakukan prosedur seleksi transforman.
Plasmid merupakan DNA sirkular untai ganda ekstrakromosomal pada bakteri
dengan panjang kurang dari 20 kb yang dapat bereplikasi sendiri, sehingga
memungkinkan terdapatnya banyak kopidalam satu sel. Sebagian besar
plasmid dalam sel tersusun dalam struktur molekul yang sangat berpilin
(supercoiled). Supercoiling ini terjadi karena sebagian heliks ganda DNA
plasmid terbuka oleh kerja enzim topoisomerase selama replikasi. Bentuk
berpilin ini hanya dapat dipertahankan jika kedua untai polinukleotida dalam
keadaan utuh, sehingga disebut DNA sirkular yang tertutup secara kovalen
(DNA kovalen-tertutup). Jika salah satu untai polinukleotida terputus, maka
heliks ganda akan berelaksasi kembali ke keadaan normalnya, ke bentuk
alternatif plasmid yang disebut sirkular terbuka (open circular) (Hogg, 2005).

Transformasi merupakan proses memasukkan DNA plasmid hasil konstruksi

yang telah mengandung materi asing ke dalam sel target. Dalamproses ini,
untuk sementara dinding sel dibuat permeabel dan dapat dilalui oleh molekul
DNA kecil. Transformasi dapat dilakukan dengan beberapa cara, antara lain
dengan heat shock dan dengan elektroporasi. Pada metodeheat shock,
campuran sel dan DNA plasmid rekombinan didinginkan dalam waktu yang
lama, kemudian dipanaskan dengan segera pada suhu sekitar 42oC. Adapun
metode elektroporasi menggunakan suatu alat yang dialiri arus listrik.
Transformasi genetik merupakan salah satu metode yang dapat dimanfaatkan
untuk mempelajari regulasi gen, identifikasi fungsi gen, pengujian
metabolisme, serta mempelajari fisiologi dan perkembangan sebagai akibat
dari ekspresi gen tersebut. Agar gen yang berupa fragmen DNA tersebut dapat
masuk, diperlukan suatu vektor DNA untuk menyisipkan gen, misalnya vektor
plasmid (Brown, 2010). Digunakan sel E.coli BL21 (DE3) sebagai inang,
Escherichia coli merupakan bakteribatang gram negatif, tidak berspora, motil
berbentuk flagel peritrik, berdiameter ± 1,1 – 1,5 µm x 0,2 – 0,6 µm. E. coli
dapat bertahan hidup dimedium sederhana menghasilkan gas dan asam dari
glukosa dan memfermentasi laktosa. Pergerakan bakteri ini motil, tidak motil,
dan peritrikus,
ada yang bersifat aerobik dan anaerobik fakultatif. Media pertumbuhan yang
digunakan yaitu media LB cair, media ini dipilih karena merupakan media
pertumbuhan yang baik dan cepat untuk bakteri Escherichia coli dimana
komposisi nya terdiri atas tripton, ekstrak khamir, NaCl dan akuades. Langkah
pertama yaitu penyiapan sel kompeten, tujuannya untuk meningkatkan
kemampuan bakteri dalam menerima DNA rekombinan. koloni tunggal E.coli
BL21 diinokulasikan ke dalam media LBcair, digunkaan media ini karena
dapat tumbuh dengan cepat dan baik untukberbagai jenis bakteri. Media ini
memiliki pH 7 dan tersusun atas tripton, ekstrak khamir, NaCl, dan aquabides.
Sumber karbon utama dari medium adalah asam amino terkarboksilasi
(Sezonov dkk., 2007).
Kemudian ditumbuhkan semalaman pada suhu 37◦C. Selanjutnya
diinokulasikan 4 ml kultur ke dalam 400 mL media LB steril dalam 2
Literflask, dan ditumbuhkan pada suhu 37◦C dishaking pada kecepatan 250
rpmhingga mencapai OD590 bernilai 0,375. Dilakukan pembagian kultur ke
dalam 50 mL tube polipropilen yang telah didinginkan, lalu tube disimpan
pada es selama 5- 10 menit. Selanjutnya dilakukan pemekatan sel dengan
sentrifugasi selama 7 menit pada 1600 x g (3000 rpm), di suhu 4◦C. Pada
pembuatan sel kompeten dilakukan dalam kondisi dingin yaitu suhu 4◦C agar
terjadi kejutan suhu pada sel kompeten ketika ditempatkan pada suhu 42◦C
(Seprianto, 2017).

Dituangakan supernatan dan setiap pellet diresuspensi dengan menggunakan

10 mL larutan CaCl2 dingin.penambahan. CaCl, dingin dapat menjadikan sel
Escherichia coli menjadi sel kompeten. Larutan CaCl, dalamkeadaan dingin
efektif menyebabkan perubahan permeabilitas dinding sel bakteri. Sel
kompoten yang ditumbukan dalam media Luria Bertani ion Ca akan menempel
pada dinding sel bakteri sehingga menarik muatan negatif DNA. Selanjtnya
dilakukan transformasi sel kompeten metode heat shock pada suhu 42◦C.
Metode heat shock merupakan metode sederhana yang dapat menyebabkan
pori
-pori dari membran sel Escherichia coli terbuka dalam waktu yang singkat dan
siap untuk menerima vektor rekombinan yang akan masuk. Proses
transformasi yaitu suspensi sel Escherichia coli dan plasmid rekombinasi,
Proses ini dilakukan dengan cara menambahkan 10 mg DNA ke dalam tube
steril 15 mL lalu ditempatkan di es, kemudian sel kompeten dicairkan dan dan
dipindahkan
sebanyak 100 μl ke dalam tubeberisi DNA secara cepat, lalu tube ditampatkan
dalam water bath bersuhu 42◦C selama 2 menit. Pada saat inilah terjadi
heatshcok (kejut panas)dikarenakan perpindahan suhu dari dingin ke panas
yang secara tiba-tiba. Selanjutnya ditambahkan 1 ml media LB ke dalam setiap
tube, dan tube ditempatkan pada roller drum agar homogen dengan kecepatan
250 rpm selama 1 jam di suhu 37◦C.
Dilakukan uji resistensi antibiotik untuk memastikan bahwa proses
transformasi berjalan dengan sukses dengan cara menempatkan kultur
transformasi ke dalam media LB/ ampisilin, ditunggu hingga mengering,
kemudian diinkubasi pada suhu 37◦C selama 12 hingga 16 jam. Uji resistensi
antibiotik merupakan salah satu cara yang digunakan untuk mengetahui
berhasil tidaknya sebuah plasmid diinsersikan ke dalam sel inang. setelah
memperoleh plasmid yang mengandung gen resisten ampisilin menjadi
mampu bertahan hidup (resisten) pada media yang mengandung antibiotik
ampisilin. Hasil dari transformasi menunjukkan koloni yang sedikit yaitu 5
koloni pada media LB/ampisilin, hal ini bisa disebabkan oleh nutrisi, suhu,
pH, dan faktor pertumbuhan lainnya yang kurang memadai, sehingga koloni
yang dihasilkan sedikit. Bakteriumumnya tumbuh pada suhu optimal yaitu
37◦C dan untuk E.coli sendiri tumbuh optimal pada rentang suhu 35-37◦C.
Pada suhu yang optimal, sel bakteri dapat memperbanyak diri dan tumbuh
sangat cepat. Sedangkan pada suhu yang lebih rendah atau lebih tinggi, masih
dapat memperbanyak diri, tetapi dalam jumlah yang lebih kecil dan tidak
secepat jika dibandingkan dengan pertumbuhan pada suhu optimalnya.
Selanjutnya percobaan seleksitransforman.
Faktor yang mempengaruhi keberhasilan transformasi antara lain

adalah konsentrasi DNA konsentrasi plasmid dan kompetensi sel. konsentrasi

DNA yang terlalu rendah memungkinkan koloni tidak dapat tumbuh. Terdapat
beberapa metode dari seleksi transforman diantaranya seleksi biru putih,
seleksi resistensi antibiotik, seleksi secara digesti. Seleksi biru putih (blue-
white screening) yaitu metode untuk memisahkan sel yang mengandung
plasmid rekombinan dengan sel yang mengandung plasmid tanpa insert.
Seleksi biru putih dilakukan untuk mengetahui keberhasilan proses ligasi atau
keberadaan DNA sisipan. Metode ini menggunakan mediayang
mengandung X-gal dan
IPTG (Isopropyl Thiogalactoside atau isopropyl B-D-thiogalactopyranoside).
Transforman yang dihasilkan ada yang berwarna biru dan putih, adanya warna
biru karena senyawa X-gal dalam medium. Koloni berwarna putih ini berarti
sel bakteri mengandung DNA plasmid rekombinan dan proses ligasi
dinyatakan berhasil. Proses ligasi atau penyambungan fragmen DNA tidak
berhasil ditandai dengan warna koloni berwarna biru. Proses ligasi dan
transformasi fragmen DNA berhasil dilakukan karena terdapat koloni putih
(Sambrook & Russell, 2001).

Langkah pertama yang dilakukan adalah penumbuhan kultur tranformasi,

penumbuhan ini dilakukan pada media LB cair cair yangmengandung
ampisilin
100 μg/μL. dimana media ini dipilih karena media ini merupakan media
pertumbuhan yang baik dan cepat untuk bakteri Escherichia coli dimana
komposisi nya terdiri atas tripton, ekstrak khamir, NaCl dan akuades. Langkah
kedua, adalah proses isolasi plasmid Prinsip dasar isolasi plasmid adalah
pemecahan dan mengekstraksi jaringan sehingga akan terbentuk ekstrasel yang
terdiri atas sel-sel jaringan, DNA dan RNA. Ekstrak sel diverifikasi sehingga
didapatkan pada sel yang mengandung DNA atau RNA total (Lehninger,
1982). Isolasi plasmidberguna untuk mendapatkan plasmid dengan konsentrasi
dan kemurnian yang tinggi. Kemudian dilanjutkan tahap digesti menggunakan
enzim retriksi. enzim retriksi juga dapat digunakan untuk membuat fragmen
DNAyang bersifat kompatibel untuk disambungkan dengan fragmen DNA
lainnya. (Das & Dash, 2015). Setelah itu hasil digesti akan melalui proses
clean up. Pemurnian/pencucian DNA dari reaksi PCR biasanya diperlukan
untuk menghilangkan enzim, nukleotida, primer dan komponen buffer dari
proses PCR, sehingga diperoleh DNA murni untuk diinsersi ke dalam plasmid.
Prinsipnya adalah pengikatan molekul DNA dengan binding buffer, DNA
kemudian terperangkap dalam kolom, lalu dilanjutkan dengan pencucian
menggunakan wash buffer agar pengotor terelusi sehingga tidakmengganggu
DNA target, dilanjutkan dengan proses ellusi untuk memperoleh DNA target
murni yang terbebas dari buffer maupun komponen lainnya. Terakhir
dilakukan adalah konfirmasi hasil retriksi melalui elektroforesis agarosa.
Elektroforesi melalui gel agarosa merupakasuatu metode pemisahan yang
biasa digunakan dalam pemisahan fragmen DNA dan protein. Fragmen
tersebut dapat dideteksi
 oleh pewarnaan gel. Pewarna yang biasa digunakan adalah pewarna
intercalating, EthidiumBromide, selanjutnya akan divisualisasi dibawah sinar
UV. Larutan elektrolit sangat diperlukan dalam metode elektroforesis gel,
berfungsisebagai penghantar arus listrik dalam elektroforesis. Larutan
elektrolit yangbiasa digunakan adalah buffer (Fuad dkk, 2016).
Dari hasil elektrofogram dapat diketahui koloni yang membawa
plasmid rekombinan terdapat pada nomor 2 dan 5 yaitu koloni B dan E.
Haltersebut dikarenakan, diantaranya banyak pita yang muncul pada setiap
koloni, pita pada Pada koloni B didapatkan 2 pita dimana pita yang satu
berukuran sekitar 3500 bp dan pita kedua berukuran 1000 bp. Pita koloni
Bterletak pada ukuran 3500 bp yang mejadikan migrasi pergerakkannya
menjadi lambat atau sulit dikarenakan ukuran nya besar. Lalu pada pita koloni
B yang terletak pada ukuran 1000 bp migrasi nya lebih cepat karenaukurannya
yang ringan. Dapat di duga bahwasannya pita 3500 bp merupakan plasmid
sedangkan pita pada 1000 bp merupakan DNA.

Lalu pada koloni E didapatkan 2 pita dimana pita yang satu berukuran sekitar
3500 bp dan pita kedua berukuran 1000 bp. Pita koloni Eterletak pada ukuran
3500 bp yang mejadikan migrasi pergerakkannya menjadi lambat atau sulit
dikarenakan ukuran nya besar. Lalu pada pita koloni E yang terletak pada
ukuran 1000 bp migrasi nya lebih cepat karenaukurannya yang ringan. Dapat
di duga bahwasannya pita 3500 bp merupakan plasmid sedangkan pada pita
1000 bp merupakan insert DNA.

VII. KESIMPULAN
7.1 Dari hasil elektroforogram dapat diketahui koloni yang membawa
plasmid rekombinan terdapat pada nomor 2 dan 5 yaitu koloni B dan
E. Pita pada kedua koloni menunjukan hasil yang sangat bagus, karena
hanya menunjukkan lebih dari satu pita. Dan keduanya terletak pada
ukuran 1000 bp.
VIII. DAFTAR PUSTAKA
Brown, T. A. 2010. Gene cloning and DNA analysis. Blackwell Publishing,
Oxford. Halaman : 95-99.
Casali, N. and Preston, A. (2003). E. coli plasmid vectors: methods and
applications. New Jersey, Humana Press. Diakses pada tanggal
9 Desember 2022.

Fuad, A. R., Ulfin, I., & Kurniawan, F. (2016). Penggunaan Agar-agar

Komersial sebagai Media Gel Elektroforesis Pada Zat Warna
Remazol: Pengaruh Komposisi Buffer, pH Buffer dan
Konsentrasi Media. Jurnal Sains Dan Seni ITS, Volume5 (2),
1- 4.
Gupta, P.K. (2008). Molecular Biology and Genetic Engineering. New
Delhi: Rastogi. Diakses pada tanggal 9 Desember 2022.
Hamdiyati, Y. 2011. Pertumbuhan dan Pengendalian Mikroorganisme II.
Bandung: Universitas Pendidikan Indonesia.
HiMedia Technical Data. 2018. Buffered Peptone Water M1494I. HiMedia
Laboratories Pvt.

Hogg, S. 2005. Essential Microbiology. England: John Wiley & Sons Inoue, H.,
Nojima, H., Okayama, H. 1990. High efficiency transformation
of Escherichia coli with plasmids. Gene 96 (1) : 23- 28.
Kauffman, S. (1995). At Home in the Universe: The Search for the Laws
ofSelf- Organization and Complexity. Oxford: Oxford
University. Diakses pada tanggal 9 Desember 2022.

Lenhinger , A. L. (1982). Dasar-Dasar Biokimia. Jilid I. Jakarta : Penerbit

Erlangga.
Liu, X., Liu, L., Wang, Y., Wang, X, Ma, Y., dan Li, Y. 2014. The study onthe
factors affecting transformation efficiency of Escherichia coli
competent cells. Pakistan journal of pharmacy science 27 (3) :
679-684.
Rostinawati, T., Retnoningrum, D.S. (2016). Kloning Fragmen Dna Pengkode
S80-180 Galur Alami Dan Mutan G145r Virus Hepatitis B Pada
 Escherichia Coli Jm109. Jurnal Farmaka. Vol. 14 (1).
Rotinsulu, S.H.C., Fatimawali., Tallei, T.E. (2019). Transformasi Plasmid
Yang Mengandung Gen Merb Pada Bakteri Escherichia
ColiTop-10. Journal Pharmacon. Vol. 8 (2): 290-297.
Sambrook, J., dan Russel, D. W. 2001. Molecular cloning, third edition.
Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
Seprianto, 2017. Isolasi Dan Penapisan Bakteri Selulolitik Dari Berbagai Jenis
Tanah Sebagai Penghasil Enzim Selulase. Indonesian Journal
of Biotechnology and Biodiversity. Vol. 1 No.2.

Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., dan D’Ari, R. (2007). Escherichia coli

physiology inLuria-Bertani broth. Journal of bacteriology.189
(23): 8746-8749
Widyasari, W.B. dan Suhandono, S. 2007. Konstruksi vektor biner untuk
ekspresi gen dip22 (yang diisolasi dari tebu varietas M 442- 52)
pada tanaman. Berk. Penel. Hayati 13:15-26.