LAPORAN PRAKTIKM MIKROBIOLOGI FARMASI

PERCOBAAN KE–3
ISOLASI, IDENTIFIKASI, KONFIRMASI MIKROBA DAN PEWARNAAN
GRAM

Di susun oleh:
SIFA FAUZIAH ARIF
220106250
FA22-5B

Dosen pengampu : apt. Nurul Zakiyah, M.S Farm

Asisten praktikum : Ariel Muhammad Yusuf
Hari/tanggal : Sabtu, 11 november 2023

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH BANDUNG
2023
I. TUJUAN
1.1.1 Mengetahui dan melakukan cara inokulasi
1.1.2 Mengidentifikasi dan konfirmasi terhadap mikroba, terutama mikroba patogen.
1.1.3 Mengenal dan melakukan salah satu pewarnaan terhadap bakteri E. Coli dan
Staphylococus aureus.
1.1.4 Mempelajari morfologi, struktur, sifat-sifat bakteri dan juga membantu dalam
melakukan identifikasi bakteri E.coli dan Staphylococus aureus.

II. PRINSIP
Prinsip isolasi mikroba didasarkan dengan memisahkan satu jenis mikroba dengan
mikroba lain yang berasal dari campuran berbagai mikroba. Ini bisa dilakukan dengan
menumbuhkannya di media padat, sel mikroba akan membentuk koloni sel yang tetap di
tempatnya (Lestari dan Hartati 2017).

Prinsip isolasi mikroba didaskan pada pemisahan satu jenis mikroba dengan mikroba
lain yang berasal dari campuran berbagai mikroba. Ini bisa dilakukan dengan
menumbuhkannya di media padat, sel mikroba akan membentuk koloni sel yang tetap di
tempatnya. Pentingnya mengisolasi mikroba dari lingkungan, seperti makanan (substrat
padat), minuman (substrat cair), dan diri Anda sendiri karena banyaknya mikroba yang
sulit diamati atau dibedakan secara langsung menggunakan panca indera. Sehingga isolasi
akan membuat lebih mudah untuk melihat dan mengamati bentuk-bentuk pertumbuhan
mikroba dalam beberapa media dan dapat melihat morfologi mikroba, yaitu inokulasi yang
merupakan (Lestari dan Hartati 2017).
Prinsip Identifikasi bakteri didasarkan pada dilakukannya dengan cara mengamati
morfologi koloni meliputi bentuk koloni bakteri, warna koloni, tepi koloni, dan elevasi
koloni bakteri (Nurhari 2009).

Prinsip Inokulasi didasarkan menggunakan media cair dengan cara pengenceran,

melakukan pengenceran adalah penurunan mikroorganisme sehingga suatu saat hanya
ditemukan satu sel di dalam tabung, metode tusuk yaitu yang digunakan pada medium
tegak, yang dilakukan dengan cara menusukan ujung jarum yang didalamnya terdapat
inokluan dan dimasukan kedalam media. (Dwijaseputro,2019). Inokulasi yaitu
menanam inokula secara aseptik ke dalam media steril. Inokula adalah bahan
yang mengandung mikroba atau biakan mikroba, baik dalam keadaan cair maupun padat.
(Henny dan Seprianto, 2019).
Prinsip: Pewarnaan gram didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri,
sehingga menyebabkan perbedaan reaksi dalam permeabilitas zat warna dan penambahan
larutan pencuci. Dinding sel bakteri Gram positif terdiri dari lapisan peptidoglikan yang
tebal sedangkan dinding sel bakteri Gram negatif mempunyai kandungan lipid yang tebal.
Ketika ditambahkan pewarnaan kristal violet maka dinding sel bakteri Gram positif
maupun Gram negatif akan menyerap zat warna tersebut namun ketika diberi alkohol,
kristal violet pada Gram negatif akan luntur disebabkan struktur dinding selnya yang
sebagian besar tersususun oleh lipid, sehingga ketika diberi safranin (zat warna kedua)
dinding sel bakteri gram negarif akan menyerapnya kembali sehingga hasil pewarnaan
bakteri Gram negatif akan berwarna merah, sedangkan bakteri gram positif akan tetap
berwarna ungu walaupun diberi zat warna kedua, karena dinding selnya tersusun oleh
lapisan peptidoglikan yang tebal sehingga tidak dapat dicuci oleh alkohol. Hal ini memberi
hasil pewarnaan ungu pada bakteri Gram positif.
III. ALAT DAN BAHAN
III.1 Alat

No Nama Alat Gambar Alat Kegunaan

.
1. Bunsen Untuk pemanasan
dan pembakaran.

2. Cawan petri Untuk penyelidikan

tropi juga mengukur
bakteri dan spora.

3. Inkubator 37C Digunakan untuk

menyimpan suatu
bakteri,agar dapat
hidup dalam suatu
media.

4. Kaca objek sebagai alas untuk

meletakkan preparat
yang akan diamati
pada alat mikroskop

5. Mikroskop untuk memperbesar

benda yang terlalu
kecil untuk dilihat,
menghasilkan
gambar di mana
obyek tampak lebih
besar

4. Ose bundar Dilakukan untuk

melakukan
inokulasi.
 5. Ose lurus Dilakukan untuk
melakukan
inokulasi.

6. Pinset Untuk mengambil

media dengan cara
menjepit.

7. Pipet Untuk mengambil

suatu larutan

9. Rak tabung reaksi Untuk menyimpan

tabung reaksi.

10. Tabung reaksi Sebagai alat untuk

pengembangbiakan
mikroba dalam
media cair.

III.2 BAHAN
No Nama Bahan Kegunaan Precaution
1. Nacl Larutan uji / media Iritan
percobaan.
2. Nutrien agar Larutan uji / media Aman
percobaan.
3. Nutrien borth Larutan uji / media Tidak ada
percobaan.
4. Bacillus subtillis Sebagai mikroba uji Iritan
coba.
5. Speudomonas Sebagai mikroba uji Menyebabkan
aeruginosa coba. penyakit
6. Staphylococcus Sebagai mikroba uji Menyebabkan
aureus. coba. penyakit
7. Streptococus Sebagai mikroba untuk Menyebabkan
thermophylus uji coba. penyakit
IV. PROSEDUR PERCOBAAN

4.1 Inokulasi
Pertama diinokulasikan suspensi bakteri pada media MCA, VJA,
CETA, XLDA. Inkubasikan pada inkubator 37 oC selama 1 minggu. iamati
setiap hari, pertmbuhan dan warna koloni yang terjadi pada setiap media.
Hasil Pengamatan : - MCA : positif E. coli, bila terdapat koloni berwarna
merah - VJA : positif Staphylococcus aureus, bila terdapat koloni hitam
dengan atau tanpa lingkaran kuning - CETA : positif Pseudomonas
aeruginosa, bila terdpaat koloni hijau kebiruan - XLDA : positif Salmonella,
bila terdapat koloni merah.
Diinokulasikan juga suspensi bakteri tersebut pada media IMVIC +
TSIA, Indol, metil merah, dan Voges Proskauer dalam bentuk media cair,
sedangkan Simons sitrat berbentuk agar miting. TSIA merupakan kombinasi
antara agar miring dengan agar tegak. Diinkubasikan pada inkubator 37 oC
selama 1 minggu dan amati tiap hari.
- Indol
pada biakan usia 24 jam ditambahkan 3-4 tetes pereaksi Kovacs. Dikocok, bila
timbul warna merah pada lapisan permukaan, berarti Indol positif. Contoh
bakteri yang positif: E.coli
- Metil Merah
pada biakan usia 48 jam, diteteskan 1-2 tetes pereaksi Metil merah, dikocok.
Terjadinya warna merah berarti reaksi positif. Bakteri yang memberi hasil
positif : Salmonella, Shigella, E.coli.
- Voges prokauser
pada biakan usia 48 jam ditambahkan: 0,5 ml larutan alfa naftol dan 1 ml
larutan KOH 16%. Dikocok kuat-kuat, dibiarkan 10 menit pada suhu kamar.
Bila timbul warna rosa atau merah pada permukaan/ merata pada seluruh
biakan berarti reaksi positif. Bakteri yang memberi hasil positif: Enterobacter,
Serratia, Klebsiella.
- Simmons sitrat
Pada Simmon Sitrat yang positif akan terjadi perubahan warna dari warna
hijau menjadi biru. Contoh bakteri yang sitratnya positif : Klebsiella,
Enterobacter
- TSIA
Diamati perubahan yang terjadi pada biakan agar TSIA yang berusia 48 jam
atau lebih. Glukosa : amati pada bagian agar tegaknya, positif bila terjadi
perubahan warna dari merah menjadi kuning. 17 Laktosa dan Sakarosa : amati
pada bagian agar miringnya, positif bila media menjadi kuning. Pembentukan
 gas : timbul gelembung gas pada bagian tegak. Gas H2S : positif, bila terjadi
warna hitam pada bagian tengah yang merupakan batas atara bagian tegak dan
bagian miring.
4.2 Pewarnaan gram
Dibersihkan kaca objek yang akan digunakan dengan alkohol hingga
bebas lemak. Setelah itu diflambir tiga kali dengan cara melewatkan kaca
objek tersebut pada nyala api Bunsen. Diberi tanda nama bakteri pada bagian
bawah kaca objek. Dibuat preparat dari biakan bakteri yang akan diwarnai
dengan cara : - diletakkan 1 tetes akuades di atas kaca objek. Disuspensikan 1
Ose biakan bakteri dalam tetesan akuades tersebut, dan disebarkan setipis
mungkin membentuk lingkaran dengan diameter kurang lebih 1 cm. - Preparat
dibiarkan mengering di udara atau dengan cara menghangatkan di atas api
Bunsen - Preparat siap diwarnai.
Kemudian Preparat diwarnai/ ditetesi dengan Kristal violet selama
kurang lebih 1 menit. Zat warna dibuang. Dituangkan lugol untuk membuang
sisa Kristal violet (Kristal violet dibilas oleh lugol). Lalu ditutup preparat
dengan larutan lugol, dibiarkan kurang lebih 30 detik. Larutan lugol dibuang.
Preparat dibilas dengan alkohol 96%, tetes demi tetes sampai tetes bilasan
alkohol terakhir sampai jernih, Preparat dicuci dengan akuades dan diwarnai
dengan zat warna Fukhsin selama 30 detik. Dibilas dengan Akuades dan
biarkan kering. Diamati di bawah mikroskop dengan pembesaran lensa
objektif 100x dengan memakai oli imersi. Dicatat warna, susunan dan bentuk
bakteri yang didapat.
V. HASIL PENGAMATAN
V.1 ISOLASI, IDENTIFIKASI, DAN KONFIRMASI MIKROBA
5.1.1 bakteri e.coli

Media Pengamatan pada hari ke- kesimpulan

1 2 3 4
CETA Hasil negativ
karenmedi CETA
untuk bakteri
pseudomonas
aeruginosa hasil
positifnya
Media Media Media berwarna Media berwarna ditandai dengan
berwarna berwarna kuning keruh, kuning pucat, warna koloni
kuning agak kuning agak koloni lebih koloni lenih hijau kebiruan.
keruh, terdapat keruh,terdapat banyak, banyak,
koloni bakteri koloni bakteri berwarna putih bentuknya agak
berwarna putih berwarna putih kekuningan. lonjong
pucat. pucat. berwarna
kekuningan.
 MCA Menunjukan
hasil positif
ditandai dengan
tumbuh koloni
berwarna merah
muda
VJA Hasilnya
menunjukan
negativ karena
positif nya untuk
bakteri
staphylococus
aureus bila
terdapat koloni
berwarna hitam
berwarna
kuning.
XLDA Hasilnya
menunjukan
negativ harusnya
pada XLDA untuk
bakteri
sallmonela
terdapat koloni
merah
SIMONS Positif
SITRAT semuannya

TSIA -Media miring -Media miring -Media miring - media miring Glukosa laktosa
warna merah warna merah merah merah sukrosa
-Media tegak - media tegak -Media tegak -warna tegak membentuk gas
warna kuning warna kuning merah merah +H2o
-tengah media -ten
hitam
 5.1.2 Bakteri staphylococus aureus

Media Pengamatan pada hari ke- kesimpulan

1 2 3 4
CETA Hasil negativ
karenmedi CETA
untuk bakteri
pseudomonas
aeruginosa hasil
positifnya
Media Media Media berwarna Media berwarna ditandai dengan
berwarna berwarna kuning keruh, kuning pucat, warna koloni
kuning agak kuning agak koloni lebih koloni lenih hijau kebiruan.
keruh, terdapat keruh,terdapat banyak, banyak,
koloni bakteri koloni bakteri berwarna putih bentuknya agak
berwarna putih berwarna putih kekuningan. lonjong
pucat. pucat. berwarna
kekuningan.
MCA Menunjukan
hasil positif
ditandai dengan
tumbuh koloni
berwarna merah
muda
VJA Hasilnya
menunjukan
negativ karena
positif nya untuk
bakteri
staphylococus
aureus bila
terdapat koloni
berwarna hitam
berwarna
kuning.
XLDA Hasilnya
menunjukan
negativ harusnya
pada XLDA untuk
bakteri
sallmonela
terdapat koloni
merah
SIMONS Positif
SITRAT semuannya

TSIA -Media miring -Media miring -Media miring - media miring Glukosa laktosa
warna kuning warna kuning kuning warna kuning sukrosa
-Media tegak - media tegak -Media tegak -warna tegak membentuk gas
warna hitam hingga tengah hingga tengah hingga tengah +H2o
koloni putih warna hitam hitam berwarna hitam
koloni putih Koloni putih terdapat koloni
putih.

VI. DISKUSI DAN PEMBAHASAN

VII. KESIMPULAN

VII.1 Dapat menyiapkan dan melakukan sterilisasi alat-alat yaitu seperti

batang pengaduk, cawan petri, erlenmeyer, gelas ukur, pipet tetes, spatula
dll menggunakan metode sterilisasi basah yang dilakukan dengan autoklaf
pada suhu 121°C selama 15 menit.
VII.2 Dapat melakukan pembuatan media padat menggunakan nutrient agar,
media cair menggunakan nutrient broth, serta pembuatan larutan pengencer
NaCl 0,9 %.
VII.3 Memahami konsep sterilisasi, berbagai teknik sterilisasi, serta
mempertahankan keadaan steril saat melakukan eksperimen mikrobiologi
dan selalu mengikuti prosedur laboratorium yang sesuai dan aman.

VIII. DAFTAR PUSTAKA

Gupta, N, V., dan Sukhshith, K, S. (2016). Qualification of Autoclave.
International Journal of Pharmatech. Vol 9(4) : 220-226.
Ikenganyia, E,F., Anikwe, M, A, N., Omeje, T, E., dan Adinde, J, O.
(2017).
Plant Tissue Culture Regeneration and Aseptic Techniques. Asian
 Journal of Biotechnlogy and Bioresource Technology. Vol 1(3) : 1-6.
Purnawijayanti, H. A. 2001. Sanitasi, Higine dan keselamatan kerja dalam
pengolahan makanan. Kanisius. Yogyakarta.
Parwati dkk. 2014. Mikrobiologi sterilisasi. Jakarta: erlangga
Waluyo, Lud. (2010). Teknik dan Metode Dasar Dalam Mikrobiologi.
Malang
: Universitas Muhammadiyah Malang Press.
Yuyun, A., dan Gunaisa, D. 2011. Cerdas mengemas produk makanan
& minuman. AgromediaPustaka. Jakarta