BAB I

PENGENALAN ALAT-ALAT LABORATURIUM MIKROBIOLOGI

1.1 Alat gelas di laboraturium mikrobiologi farmasi

No Nama Alat Fungsi Gambar

1. Tabung Reaksi untuk uji-uji biokimiawi dan menumbuhkan
mikroba.Tabung reaksi dapat diisi media
padat maupun cair

2. Erlenmeyer Berfungsi untuk menampung larutan, bahan

atau cairan. Labu Erlenmeyer dapat
digunakan untuk meracik dan
menghomogenkan bahan-bahan komposisi
media, menampung akuades, kultivasi
mikroba dalam kultur cair, dll.

3. Beaker Glass Berfungsi untuk preparasi media media,

menampung akuades dll

4. Gelas ukur Berfungsi untuk mengukur volume suatu

cairan

5. Cawan Petri Berfungsi untuk membiakkan (kultivasi)

mikroorganisme.

1
6. Tabung Durham Berfungsi untuk menampung hasil
fermentasi mikroorganisme berupa gas.

7. Jarum Ose ujung Pada batang ose ujung kolongan biasanya

bulat dan ujung digunakan untuk inokulasi pada media
lurus cair sedangkan ose yang berbentuk lurus
biasanya digunakan pada inokulasi dengan
cara metode gores pada media agar.

8. Batang L Untuk meratakan sampel yang dimasukkan

kedalam media yang ada di cawan petridish
dengan cara diputar.

1.2 Alat non-gelas di laboraturium mikrobiologi farmasi

No Nama Alat Fungsi Gambar

1. Colony Counter Berfungsi untuk menghitung koloni
bakteri yang ditumbuhkan dimedia
yang disimpan dalam cawan petridish.

2. Mikroskop Berfungsi untuk melihat objek yang

sangat kecil ( tidak bisa dilihat dengan
mata telanjang)

2
3. Inkubator Digunakan sebagai tempat inkubasi.

4. Autoklaf Berfungsi untuk mensterilisasi suatu

benda ataupun media dengan
menggunakan uap bersuhu tdan
bertekanan tinggi (121 derajatC, 15 lbs)

5. Oven Berfungsi sebagai alat sterilisasi dengan

menggunakan panas kering

6. Lampu Spiritus Berfungsi :

a. Sterilisasi ( memijarkan ose) sebelum
inokulasi sample
b. Mengkondisikan area dalam kondisi
aseptis dengan jarak max dari pijaran
lampu spirtus 30 cm

7. Rak Tabung Reaksi Tempat meletakkan tabung reaksi,

8. Mikropipet Berfungsi untuk mengukur volume

cairan dalam sekala mikroliter

3
9. Vortex Berfungsi Untuk mengaduk senyawa
kimia yang ada dalam tabung reaksi
atau wadah.

10. Baloon pipet Berfungsi untuk menghisap larutan

yang akan di ambil.

11. Pipet volume Berfungsi untuk mengukur volume

larutan

4
 BAB II

DASAR – DASAR TEKNIK MIKROBIOLOGI

2.1 PEMBUATAN DAN STERILISASI MEDIA MIKROBIOLOGI

2.1.1 Tujuan :

- Mempelajari cara pembuatan media dan syarat-syarat yang dibutuhkan oleh

suatu media untuk pertumbuhan mikroba.

- Mempelajari macam-maccam teknik sterilisasi.

- Mempelajari cara-cara pemidahan mikroba secara aseptis.

- Mempelajari teknik-teknik isolasi dan penanaman mikroba.

- Mempelajari teknik pembuatan pulasan bakteri untuk pengecetan atau

pewarnaan bakteri

- Mengenal bermacam-macam mikroba.

2.1.2 Dasar Teori

Media dan Cara Pembuatan Media

Pembiakan mikrobia di laboratorium memerlukan media yang berisi zat hara

serta lingkungan pertumbuhan yang sesuai bagi mikroba.Media adalah suatu bahan
yang digunakan untuk menumbuhkan mikroba yang terdiri atas campuran nutrisi atau
zatzat makanan. Selain untuk menumbuhkan mikroba, media dapat juga digunakan
untuk isolasi, memperbanyak, pengujian sifat-sifat fisiologis dan perhitungan jumlah
mikroba (Lay, 1994; Jutono dkk, 1980).

Syarat media yang baik untuk pertumbuhan mikroba adalah lingkungan

kehidupannya harus sesuai dengan lingkungan pertumbuhan mikroba tersebut, yaitu :
susunan makanannya (media harus mengandung air untuk menjaga kelembaban dan
untuk pertukaran zat/metabolisme, juga mengandung sumber karbon, mineral, vitamin
dan gas), tekanan osmose yaitu harus isotonik, derajat keasaman/pH umumnya netral
tapi ada juga yang alkali, temperatur harus sesuai dan steril. Media harus mengandung
semua kebutuhan untuk pertumbuhan mikroba, yaitu: sumber energi (contoh: gula),

5
sumber nitrogen, juga ion inorganik essensial dan kebutuhan yang khusus, seperti
vitamin (Jawetz dkk, 1996).

Berdasarkan komposisi kimianya, media dapat dibedakan menjadi media

sintetik yaitu media yang susunan kimianya diketahui dengan pasti, medium ini
biasanya digunakan untuk mempelajari kebutuhan makanan mikroba. Media non
sintetik (kompleks) yaitu media yang susunan kimianya tidak dapat diketahui dengan
pasti, media ini digunakan untuk menumbuhkan dan mempelajari taksonomi mikroba.
Berdasarkan konsistensinya media dapat dibedakan menjadi : media cair, media padat,
dan media padat yang dapat dicairkan (Lay, 1994; Jutono dkk, 1980; Jawetz dkk, 1996).

2.1.3 PELAKSANAAN PRAKTIKUM

2.1.3.1 Alat dan bahan:

1. Media Nutrien Agar (NA) (Oxoid)

2. Media Nutrien Broth (NB) (Oxoid)

3. Aquadest

4. Cawan petri

5. Tabung reaksi

6. Batang pengaduk

7. Pipet volume

8. Erlenmeyer

9. penangas/elemen pemanas

6
2.1.3.2 Cara kerja:

1. Timbang media NA (Oxoid) dan NB (Oxoid) sesuai prosedur di kemasan. (Catatan

: Buatlah 50 ml media NA untuk setiap kelompok kecil praktikum dan 50 ml media NB
untuk satu golongan praktikum). Penimbangan media dilakukan secara teliti dan cepat,
kemudian serbuk media dimasukkan secara hati-hati ke dalam erlenmeyer.

2. Tambahkan aquades dan aduk sampai merata dengan batang pengaduk

3. Panaskan dengan hati-hati menggunakan penangas/elemen pemanas sampai media

tercampur homogen (ditunjukkan dengan warna yang kuning jernih). Perhatian :pada
saat pemanasan jangan sampai terbentuk buih berlebihan sampai meluap!

4. Sebelum diautoklaf, tuangkan media NA dengan volume tertentu menggunakan pipet

volume : 5 ml ke dalam tabung reaksi untuk NA miring, 10 ml ke dalam tabung reaksi
untuk NA tegak, 15 ml untuk NA dalam cawan petri untuk percobaan 4b (metode isolasi
pour plate), sisanya untuk NA dalam cawan petri untuk percobaan 6 (pengenalan
mikroba di alam). Tutup tabung reaksi denganpenutup tabung (penutupan jangan terlalu
rapat!)

5. Sebelum diautoklaf,tuangkan NB ke dalam tabung reaksi untuk 6 kelompok

praktikum dalam 1 golongan. Masingmasing tabung reaksi @ 8 ml. Tutup tabung reaksi
dengan kapas atau penutup tabung (penutupan jangan terlalu rapat!)

6. Sterilkan seluruh media dalam tabung reaksi tersebut dengan menggunakan autoklaf
selama 15 menit, tekanan 1 atm 121°C. Pelajari cara mengoperasikan autoklaf dengan
benar!

7. Setelah diotoklaf : media NA 10 ml dalam tabung reaksi diletakkan tegak pada rak
tabung dan biarkan memadat, media NA 5 ml inkubasikan miring dan biarkan
memadat. Media sisa NA tuangkan dalam cawan petri dan biarkan memadat (untuk
percobaan 6 : pengenalan mikroba di alam). Media NA 15 ml dibiarkan sampai suhu
45-50oC (untuk percobaan 4b : metode isolasi pour plate).

8. Media NB dalam tabung reaksi biarkan dingin. Seluruh media NA dan NB ini akan
digunakan untuk percobaan selanjutnya.

7
2.1.4 DATA PENGAMATAN

No Larutan Pengamatan Bentuk Media

Sebelum Setelah Sebelum Setelah
Dimasak dimasak sterilisasi sterilisasi
1. NA I Larutan Adanya Larutan Terjadi
( 5, 0319 g ) berwarna gelembung berwarna perubahan
orange pekat setelah orange pekat warna agak
dan ada sedikit dipanaskan kecoklatan
endapan dan larutan
berkurang dan
agak padat
2. NA II Larutan Adanya Larutan Terjadi
( 5, 0024 g ) berwarna gelembung berwarna perubahan
orange pekat setelah orange pekat warna agak
dan adanya dipanaskan kecoklatan
sedikit endapan dan larutan
berkurang dan
agak padat
3. PDA I Larutan Adanya Larutan Terjadi
( 9,7129 g ) berwarna gelembung berwarna perubahan
orange bening setelah orange bening warna coklat
dan adanya dipanaskan bening dan
sedikit endapan larutan
berkurang dan
agak padat
4. PDA II Larutan Adanya Larutan Terjadi
( 9, 7559 g ) berwarna gelembung berwarna perubahan
orange bening setelah orange bening warna coklat
dan adanya dipanaskan bening dan
sedikit endapan larutan
berkurang dan
agak padat

8
2.2 Teknik - Teknik Pemindahan Kultur Mikroba

2.2.1 Tujuan :

Untuk mencegah tercemarnya biakan murni, perlu diadakan teknik aseptik

pada waktu memindahkan mikroba. Dalam percobaan ini akan dipelajari cara-cara
memindahkan biakan murni dengan cara aseptik.

2.2.2 Pelaksanaan Praktikum

2.2.2.1 Alat dan bahan:

1. Media NA miring dalam tabung reaksi (hasil percobaan 1)

2. Media NA tegak dalam tabung reaksi (hasil percobaan 1)

3. Media nutrien cair atau NB dalam tabung reaksi (hasil percobaan 1)

4. Jarum ose

5. Jarum inokulasi o

6. Kultur murni bakteri

7. Lampu bunsen

8. Vortex mixer

2.2.2.2 Cara kerja:

1. Siapkan media NA dan NB hasil percobaan 1 (media NA miring, media NA tegak

dan media NB/cair). Pemindahan kultur mikroba dilakukan satu persatu untuk masing-
masing media.

2. Longgarkankan tutup dari masing-masing tabung reaksi yang berisi media.

3. Pegang tabung reaksi yang mengandung kultur murni bakteri di tangan kiri.

4. Pegang jarum ose pada tangan kanan dan bakar di atas nyala lampu bunsen hingga
kawat memijar.Perhatian : pemanasan jarum ose dilakukan dari pangkal ke ujung
sampai memijar, sebelum digunakan kawat didinginkan beberapa saat!

5. Pegang ose menggunakan ibu jari dan jari telunjuk, gunakan jari kelingking untuk
membuka tutup tabung reaksi (tutup tabung reaksi tetap dipegang seperti posisi
semula).

9
6. Bakar mulut tabung reaksi, masukkan jarum ose dan ambil 1 ose biakan bakteri.

7. Bakar kembali mulut tabung reaksi dan tutup tabung reaksi kembali.

8. Ambillah tabung reaksi yang akan diinokulasi dengan tangan kiri, dengan cara yang
sama buka tutup tabung reaksi, dan bakar mulut tabung reaksi.

9. Inokulasikan biakan bakteri pada tabung reaksi inokulasi dengan cara goresan zigzag
pada permukaan NA miring.

10. Bakar mulut tabung reaksi dan tutup tabung reaksi kembali, kemudian bakar ose.

11. Beri label : tanggal percobaan, nama bakteri, teknik pemindahan dan nama
kelompok.

12. Lakukan dengan cara yang sama untuk media nutrien cair/NB menggunakan jarum
ose dan media agar tegak secara tusukan tegak lurus menggunakan jarum inokulasi.

13. Inkubasikan selama 24 jam pada suhu kamar dan amati pertumbuhannya.

2.3 Teknik-teknik Isolasi atau Penanaman Mikroba

2.3.1 Tujuan :

Adapun tujuan dari percobaan teknik isolasi mikroba adalah sebagai berikut :

1. Untuk mengetahui dan memahami teknik pengisolasian mikroba.

2. Untuk mengetahui teknik pemindahan biakan mikroba dari wadah satu ke wadah
lain sehingga tidak bercampur dengan bakteri lain.

2.3.2 Dasar Teori

Untuk menanam suatu mikroba perlu diperhatikan faktorfaktor nutrisi serta

kebutuhan akan oksigen (gas, O2 atau udara). Cara menumbuhkan mikroba yang
anaerob sangat berbeda dengan yang aerob. Mengisolasi suatu mikroba ialah
memisahkan mikroba tersebut dari lingkungannya di alam dan menumbuhkannya
sebagai biakan murni dalam medium buatan. Untuk isolasi harus diketahui cara-cara
menanam dan menumbuhkan mikroba pada medium biakan serta syarat-syarat lain
untuk pertumbuhannya (Jutono dkk, 1980).

10
 Mikroba jarang terdapat di alam dalam keadaan murni. Kebanyakan
merupakan campuran bermacam-macam spesies mikroba. Macam-macam cara
mengisolasi dan menanam mikrobia adalah :

1). Spread plate method (cara tebar/sebar).

2). Streak platemethod (cara gores) .

3). Pour plate method (cara tabur).

1). Spread PlateMethod (Cara Tebar/Sebar)

Teknik spread plate merupakan teknik isolasi mikroba dengan cara menginokulasi
kultur mikroba secara pulasan/sebaran di permukaan media agar yang telah memadat.
Metode ini dilakukan dengan mengencerkan biakan kultur mikroba. Karena konsentrasi
sel-sel mikroba pada umumnya tidak diketahui, maka pengenceran perlu dilakukan
beberapa tahap, sehingga sekurang-kurangnya ada satu dari pengenceran itu yang
mengandung koloni terpisah (30-300 koloni). Koloni mikrobia yang terpisah
memungkinkan koloni tersebut dapat dihitung.

Alat dan bahan:

1. Spreader/batang bengkok/batang Drigalsky

2. Pipet volume, lampu bunsen

3. Media NA dalam cawan petri

4. Kultur murni bakteri

5. Larutan pengencer (BPW atau NaCl fisiologis 0,9%)

Cara kerja:

1. Buatlah pengenceran 10-1 – 10-6 dari kultur murni bakteri dengan larutan pengencer.

2. Ambil tabung reaksi yang mengandung kultur murni bakteri, buka dan bakar leher
tabung.

3. Pindahkan 0,1 ml kultur bakteri secara aseptis ke permukaan media NA dalam cawan
petri.

4. Bakar spreader yang sebelumnya telah dicelupkan dalam alkohol, biarkan dingin.

11
5. Tebarkan/sebarkan kultur bakteri dengan spreader secara merata dan biarkan sampai
permukaan agar mengering

6. Setelah permukaan agar mengering, selanjutnya inkubasikan secara terbalik selama

24 jam pada suhu kamar dan amati pertumbuhannya.

7. Bandingkan pertumbuhan dari tiap-tiap pengenceran dan bandingkan

pertumbuhannya dengan hasil teknik spread plate pada percobaan 2 (sterilisasi secara
filtrasi).

2). Pour PlateMethod (Cara Tabur)

Cara ini dasarnya ialah menginokulasi medium agar yang sedang mencair pada
temperatur 45-50oC dengan suspensi bahan yang mengandung mikroba, dan
menuangkannya ke dalam cawan petri steril. Setelah inkubasi akan terlihat koloni-
koloni yang tersebar di permukaan agar yang mungkin berasal dari 1 sel bakteri,
sehingga dapat diisolasi lebih lanjut (Jutono dkk, 1980).

Alat dan bahan:

1. Media NA dalam tabung reaksi (hasil percobaan 1)

2. Cawan petri steril

3. Kultur murni bakteri

4. Pipet volume, lampu bunsen

Cara kerja:

1. Dinginkan mediaNA dalam tabung reaksi sampai suhu ± 45 - 500C (cirinya : terasa
hangat di kulit/tidak ‘kemranyas’).

2. Buka tutup tabung yang mengandung kultur murni bakteri, dan bakar leher botol.

3. Pindahkan 1 ml kultur murni bakteri ke dalam tabung reaksi yang mengandung NA

secara aseptis.

4. Bakar leher tabung di atas bunsen, dan tuangkan media NA yang telah mengandung
kultur murni bakteri ke dalam cawan petri.

12
5. Goyangkan perlahan-lahan untuk mencampur kultur bakteri dengan NA sampai
homogen.Penggoyangan petri jangan terlalu kuat. Pada saat penuangan media, petri
bisa diletakkan dalam radius maksimal 20 cm dari sumber api (zona steril)

6. Setelah agar memadat diinkubasi terbalik pada suhu kamar selama 24 jam. Inkubasi
terbalik dilakukan setelah agar memadat. Amati pertumbuhannya.

3). Streak PlateMethod (Cara Gores)

Cara gores umumnya digunakan untuk mengisolasi koloni mikroba pada cawan
agar sehingga didapatkan koloni terpisah dan merupakan biakan murni. Cara ini
dasarnya ialah menggoreskan suspensi bahan yang mengandung mikroba pada
permukaan medium agar yang sesuai pada cawan petri. Setelah inkubasi maka pada
bekas goresan akan tumbuh koloni-koloni terpisah yang mungkin berasal dari 1 sel
mikroba, sehingga dapat diisolasi lebih lanjut (Jutono dkk, 1980).

Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Bakteri

yang memiliki flagella seringkali membentuk koloni yang menyebar terutama bila
digunakan lempengan yang basah. Untuk mencegah hal itu harus digunakan lempengan
agar yang benar-benar kering permukaannya (Lay, 1994).

Alat dan bahan:

1. Media NA dalam cawan petri

2. Kultur murni bakteri

3. Jarum ose

4. Lampu bunsen

Cara kerja:

1. Panaskan jarum ose hingga memijar di atas bunsen, kemudian dinginkan. Gunakan
ose yang telah dingin untuk menggores pada permukaan media agar dalam cawan petri.

2. Ambil 1 ose kultur murni bakteri dan goreskan pada permukaan media agar dimulai
pada satu ujung. Perhatikan teknik penggoresan Ose disentuhkan pada permukaan
media agar dalam cawan petri, sewaktu menggores ose dibiarkan meluncur di atas
permukaan agar.

13
3. Setiap kali menggoreskan ose untuk kuadran berikutnya, pijarkan ose terlebih dahulu
dan biarkan dingin.

4. Inkubasikan secara terbalik pada suhu kamar selama 24 jam dan amati
pertumbuhannya.

2.3.3 DATA PENGAMATAN

No. Media Sampel Pengamatan I Pengamatan II Pengamatan III

1. NA Roti Pada pengamatan Pada Pengamatan Pada Pengamatan
pertama sampel Hari Kedua Hari Ketiga
disimpan pada terdapat koloni terjadinya
suhu kamar yang bulat bulat pembanyakan
selama 24 jam dan menyebar koloni dan bulat-
setelah diamati warna agak bulat kecil
terdapat jamur kekuningan berwarna putih
koloni sebanyak buram
44 Koloni besar
dan koloni kecil
tidak terlihat
2. PDA Roti Pada pengamatan Pada Pengamatan Pada Hari ketiga
pertama sampel hari kedua terdat 1 terjadi koloni
disimpan pada koloni memyebar
suhu kamar besar,koloni yang membesar dan
selama 24 jam menyebar 5, dan koloni bulat-bulat
setelah diamati koloni berwarna bertambah
terdapat jamur putih buram bulat kemudian
koloni sebanyak yang ada titik berwwarna putih
31 koloni kuning 2 di tengah susu bulat
sebanyak 7 dan 1
koloni bulat
warna orange
3. PDA Ketombe Pada pengamatan Pada hari ke 2 Pada Hari Ketiga
pertama sampel terdapat koloni Terjadi
disimpan di menyebar dan ada kontaminasi

14
 inkubaor kamar bintik granul sebanyak 19
selama 24 jam berwarna putih koloni dimana
setelah diamati buram terdapat 1 koloni
terdapat 1 Koloni buat berukuran
besar dan tidak sedang berwarna
terlihat koloni hijau, koloni
kecil merah besar
berbentuk bulat
dan 15 koloni
kecil berbentuk
bulat dan adanya
7 koloni
menyebar

No. Sampel + Media Gambar

1. Air Roti + NA

2. Air Roti + PDA

3. Air Roti + PDA

15
2.3.4 PEMBAHASAN

Nutrient Agar (NA) merupakan media yang digunakan untuk menumbuhkan

bakteri, media ini dipanaskan agar mencair, kemudian sedikit didinginkan sehingga
suhunya kira-kira 40-50°C, pendinginan ini dilakukan untuk mendapatkan suhu yang
ideal sehingga agar tidak mengeras namun tidak terlalu panas yang mengakibatkan
kematian koloni yang akan dibiakkan. Kegunaan dari Nutrient Agar adalah untuk
kultivasi dan perawatan sebagian besar dari mikroorganisme. Komposisi dari Nutrient
Agar adalah agar sebanyak 15 gram, pepton sebanyak 5 gram, NaCl sebanyak 5 gram,
ekstrak yeast sebanyak 2 gram dan ekstrak kaldu sebanyak 1 gram (Atlas 1946).

Media PDA merupakan substrat yang sangat baik untuk memisahkan campuran
mikroorganisme sehingga masing-masing jenisnya menjadi terpisah-pisah. Teknik
yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme pada
media PDAmemungkinkannya tumbuh dengan agak berjauhan dari sesamanya, juga
memungkinkan setiap selnya berhimpun membentuk koloni, sekelompok massa sel
yang dapat dilihat langsung oleh mata. Semua sel dalam koloni itu sama; dianggap
kesemuanya itu merupakan keturunan (progeni) satu mikroorganisme (Pelczar, 2006).

Teknik aseptik sangat diperlukan untuk menghindarkan mikroorganisme dari

kontaminan yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba. Teknik aseptis digunakan
sepanjang kegiatan berlangsung, baik alat, bahan, lingkungan sekitar maupun
praktikannya. Untuk alat dan bahan praktikum dapat diterapkan metode sterilitas.
Penguasaan teknik aseptik ini sangat diperlukan dalam keberhasilan laboratorium
mikrobiologi dan hal tersebut merupakan salah satu metode permulaan yang dipelajari
oleh ahli mikrobiologi (Oram, 2001)

Perlakuan aseptik ialah perlakuan yang bertujuan terbebas dari

mikroorganisme. Aseptik diimbangi dengan sterilisasi yang merupakan upaya untuk
menghilangkan kontamina mikroorganisme yang menempel pada alat atau bahan yang
akan dipergunakan untuk analisa selanjutnya Media pertumbuhan mikroorganisme
adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang
diperlukan mikroorganisme untuk pertumbuhannya. Mikroorganisme memanfaatkan
nutrisi media berupa molekul-molekul kecil yang dirakit untuk menyusun komponen

16
sel. Dengan media pertumbuhan dapat dilakukan isolat mikroorganisme menjadi kultur
murni dan juga memanipulasi komposisi media pertumbuhannya (Machmud, 2008 ).

Teknik aseptis sangat penting dalam pengerjaan mikrobiologi yang memerlukan

ketelitian dan keakuratan disamping kesterilan yang harus selalu dijaga agar terbebas
dari kontaminan yang dapat mencemari. Populasi mikroba di alam sekitar kita sangat
besar dan komplek. Udara merupakan media masuknya suatu kontaminan ke dalam
wadah kultur bakteri. Keragaman yang luas dalam hal tipe nutrisi diantara bakteri,
diimbangi oleh tersedianya berbagai macam media yang banyak macamnya untuk
kultur murni (Mahmud, 2008).

2.3.5 KESIMPULAN

Teknik aseptik dalam proses-proses pengerjaan yang berkaitan

dengan mikrobiologi, memerlukan ketelitian dan keakuratan serta kesterilan yang
harus selalu dijaga agar terbebas dari kontaminan. Penguasaan teknik aseptik sangat
diperlukan dalam keberhasilan praktikum mikrobiologi dan hal tersebut merupakan
salah satu metode permulaan yang harus dipelajari oleh seorang ahli mikrobiologi.

17
 BAB III

IDENTIFIKASI DAN DETERMINASI BAKTERI

3.1 Pembuatan Kultur Murni Mikroba

3.1.1 Tujuan : - Mengetahui prinsip kultur murni

- Mengetahui manfaat dari kultur murni

3.1.2 Dasar Teori

Bakteri atau mikroba lainnya dapat dilihat dengan mikroskop cahaya tanpa
pewarnaan/pengecatan atau dengan pewarnaan/pengecatan.Pengamatan tanpa
pengecatan lebih sukar dan tidak dapat dipakai untuk melihat bagian-bagian sel dengan
teliti karena sel bakteri atau mikroba lainnya transparan atau semi transparan.Dengan
pengecatan, dapat dilihat struktur sel mikroba lebih seksama. Fungsi pengecatan adalah
:

a). Memberi warna pada sel atau bagian-bagiannya sehingga member kontras
dan tampak lebih jelas.

b). Dapat untuk menunjukkan bagian-bagian struktur sel.

c). Membedakan mikroba satu dengan yang lain, dan

d). Menentukan pH dan potensial oksidasi reduksi ekstraseluler dan intraseluler

(Jutono dkk., 1980).

Pengecatan bakteri umumnya menggunakan lebih dari satu tingkat pengecatan.

Hasil pengecatan dipengaruhi oleh beberapa faktor, seperti : fiksasi, substrat,
dekolorisator dan sebagainya. Dalam pembuatan pulasan bakteri yang siap diwarnai,
perlu dilakukan fiksasi terlebih dahulu yang bertujuan antara lain :

a). mencegah mengkerutnya globula-globula protein sel.

b). merubah afnitas cat.

c). mencegah terjadinya otolisis sel.

d). dapat membunuh mikroba secara cepat dengan tidak menyebabkan

perubahan-perubahan bentuk atau strukturnya.

18
 e). melekatkan bakteri di atas gelas benda dan,

f). membuat sel-sel lebih kuat/keras.

Cara fiksasi yang paling banyak digunakan dalam pengecatan bakteri adalah dengan
membuat lapisan suspensi/pulasan bakteri di atas gelas benda, kemudian
dikeringanginkan dan dilalukan beberapa kali di atas nyala lampu spiritus (Jutono dkk.,
1980).

3.1.3 Pelaksanaan Praktikum

3.1.3.1 Alat dan Bahan :

1. Gelas benda.

2. Jarum ose.

3. Lampu Bunsen.

4. Label preparat.

5. Aquades steril.

6. Kultur murni bakteri.

7. Penjepit gelas benda

3.1.3.2.Cara kerja :

1. Labellah gelas benda yang kering dan bersih. Sterilkan jarum ose dengan
memijarkannya pada nyala bunsen dan dinginkan.

2. Jika kultur dalam bentuk cair (suspensi), ambillah 1 ose penuh dan letakkan di
tengah-tengah gelas benda dan ratakan seluas ± 1 cm2

3. Jika kultur dalam medium padat, ambillah dengan jarum ose satu bagian kecil kultur
dan letakkan di tengah gelas benda yang sebelumnya telah diberi aquadest steril dan
ratakan.

4. Biarkan kering dengan mengangin-anginkan gelas benda.

5. Fiksasi pulasan bakteri dengan melewatkan di atas nyala bunsen (hati-hati, jangan
sampai terlalu kering/gosong), tergantung jenis pengecatannya. 6. Pulasan bakteri siap
untuk diwarnai.

19
3.1.4 Data Pengamatan

No. Sampel Gambar

1. Roti Menyebar
(NA)

2. Ketombe
(PDA)

3. Ketombe Bulat
(PDA)

4. Roti Bulat (NA)

5. Ketombe
Menyebar

6. Ketombe Bulat

20
3.1.4 Pembahasan

ada praktikum ini sampel yang digunakan adalah ketombe dan roti dengan
media NA (Nutrient Agar) dan PDA (Potato Dextro Agar).

Pada pengamatan air ketombe pada Media PDA (Potato Dextro Agar) telah
ditumbuhi oleh jamur P.Ovale dan jamur Uniselluler, jamur ini berbentuk Ovale dan
terlihat oada mikroskop pembesaran 100x

Pityrosporum Ovale adalah jamur dari kelas: Deuteramyces, Ordo:

Cryptorococcascos. Pityrosporum adalah jamur isfofilic drari genus maise ssezia yang
dianggap sebagai flora normal kulit yang dapat berasosiasi pada keadaaan ketombe dan
dermatitis sebarik ( Jang et al.2009)

Pityrosporum ovale berbentuk oval seperti botol, berukuran 1,2x2,4 mm gram

positif dan memperbanyak diri dengan cara blastospora atau tunas sebagai Aora kulit
normal kepala. Pityrosporum Oval didapat dengan jumlah 0-2 perlapangan panan. Pada
pertumbuhan pityrosporum oval melebihi jumlah normal akan meningkat proliferasi
epidermal khususnya pada stralum korneum atau pada folikel rambut yang akan
menyebabkan ketombe (Woryganigrum,.dkk.2004)

Ada 3 faktor yang dianggap berhubungan dengan terjadinya ketombe yaitu

sekresi dari glandula sebasan metabolism mikrofroral dan kerentan individu.
(Dawson.2007)

Kepohenazol diketahui untuk pengobatan ketombe yang merupakan suatu anti

jamur turunan Imiduzol yang mempunyai sprektrum luas dan efektifitas tinggi bersifat
Fungistatik yang bekerja menghambat sintesis ergusterol yang merupakan sterol
penting untuk membrane sitoplasma jamur (Katzurg.1998)

Pada praktikum sampel media yang digunakan PDA dan NA. Tetapi karena
pengerjaan yang kurang steril maka sampel terkontaminasi oleh bakteri basillus

Pada praktikum sampel roti menggunakan media PDA dan NA. pada
pengamatan roti media NA (Nutrient Agar) ditemukan bakteri coccus gram positif dan
membentuk rantai yang disebut streptococcus, ada juga sampel roti yang
terkontaminasi oleh bakteri basillus .

21
 Bakteri coccus gram positif adalah bakteri yang berbentuk bulat dan memiliki
dinding sel. Streptococcus adalah salah satu genus dan bakteri nomofil yang
mengandung sel gram positif, berbentuk bulat, oval dan membentuk rantai pendek
,panjang ,berpasangan, bakteri ini tidak membentuk spora. (Sinell.1980)

Bakteri Basillus adalah genus bakteri tergolong dalam bakteri gram positif yang
umumnya tumbuh pada medium yang mengandung oksigen (Aerobik). Bakteri basillus
menunjukan koloni yang berbeda-beda pada medium agar, tetapi koloni bermacam-
macam umumnya tidak ada,permukaan kasar dan berlendir, bahkan ada yang
cenderung besar dan tikda berlendir, bahka ada yang cenderung besar dan tidak
mengikat. Bentk koloni dan ukurannya sangat bervariasi tergantung jenisnya,selain itu
setiap jenis juga menunjukan kemampuan dan ketahanan terhadap asam , kadar asam ,
kadar garam dan sebagainya. (Rheihhermen. 1980)

3.1.5 Kesimpulan

1. Teknik isolasi mikroorganisme adalah suatu usaha untuk menumbuhkan

mikroba diluar dari lingkungan alamiahnya, untuk memperoleh biakan murni. Biakan
murni yaitu mikroba yang sudah tidak bercampur lagi dengan mikroba lainnya.
2. Medium yang digunakan untuk biakkan murni adalah medium NA untuk
biakkan bakteri dan medium PDA untuk biakkan jamur uniselluler/yeast

22
3.2 Pembuatan Pulasan Bakteri/jamur dan Pewarnaan Gram

3.2.1 Tujuan :

Melihat bentuk sel, rangkaian sel, sifat gram (gram negatif dan gram positif)

3.2.2 Dasar Teori

Pengecatan ini dikembangkan pertama kali oleh Christian Gram (1884) dan
termasuk pengecatan differensial, karena dapat membedakan bakteri yang bersifat gram
positif dan gram negatif. Dari segi pewarnaan perbedaan antara bakteri Gram positif
dan Gram negatifdapat diamati dengan jelas. Bakteri Gram positif mengikat cat utama
(crystal violet) dengan kuat sehingga tidak dapat dilunturkan oleh cat peluntur dan tidak
diwarnai lagi oleh cat lawan (safranin), hal ini disebabkan karena sifat dinding sel dan
sitoplasmanya, yang mempunyai afinitas kuat terhadap kompleks crystal violet dan
iodine (jodium). Bakteri Gram negatif tidak mengikat cat utama secara kuat, sehingga
dapat dilunturkan oleh peluntur dan dapat diwarnai oleh cat lawan. Perbedaan sifat
bakteri Gram positif dan gram negatif tidak mutlak tegas dan spesifik, tetapi masih
tergantung pada beberapa faktor yang dapat menyebabkan variasi dalam pengecatan
Gram.

3.2.3 Pelaksanaan Praktikum :

3.2.3.1 Alat dan bahan:

1. Mikroskop cahaya.
2. Crystal violet (Gram A).
3. Larutan iodine (Gram B).
4. Alkohol 96% (Gram C)
5. Safranin (Gram D)
6. Minyak immersi
7. Isolat murni bakteri tanah (hasil percobaan Acara III)
8. Gelas benda
9. Jarum ose

23
3.2.3.2 Cara kerja:

1. Buatlah pulasan bakteri di atas objek gelas, keringkan dan fiksasi dengan api

2. Teteskan catcrystal violet (Gram A) dan diamkan 3060 detik.

3. Buanglah sisa cat dan cuci sisanya dengan air mengalir.

4. Teteskan larutan iodine (Gram B) dan diamkan selama 1-2 menit.

5. Cuci dengan air mengalir, kemudian di decolorisasi (di beri larutan peluntur) dengan
alkohol (Gram C) (kirakira 20 detik, hati-hati jangan sampai berlebihan yang
mengakibatkan kesalahan hasil).

6. Cuci dengan air mengalir, tambahkan larutan safranin (Gram D) selama 10-20 detik.

7. Cuci kembali dengan air mengalir, angin-anginkan dan amati di bawah mikroskop
dengan perbesaran kuat (1000x) menggunakan minyak immersi. 8. Gambar hasil-hasil
pengecatan bakteri dengan diberi keterangan mengenai warna sel bakteri yang
menunjukkan sifat gram dan bentuk sel.

3.2.4 Data Pengamatan

No. Sampel Hasil Pengamatan Gambar

1. Roti Menyebar Pada sampel roti NA yang
(NA) telah di amati sampel
terkontaminasi oleh bakteri
bassilus, karena mungkin
pengerjaan yang kurang steril

2. Ketombe (PDA) Pada sampel ketombe

PDA,ketombe ada sel yang
telah mati.ketombe berbentuk
jamur uniseluler/yeast

24
 3. Ketombe Bulat Pada sampel ini harusnya
(PDA) warna abu-abu yang bulat P
Ovale yang pisah, jamur
Uniselluler

4. Roti Bulat (NA) Pada roti bulat NA kontam

dengan bakteri coccus gram
positif dan dia membentuk
rantai yang disebut
streptococy

5. Ketombe Pada ketombe yang telah saya

Menyebar amati ada yang kontam
dengan bakteri basilus

6. Ketombe Bulat Pada Pengamatan ketombe

bulat diamati bahwa ada
jamur yang telah pecah

3.2.4 Pembahasan

Pewarnaan sederhana yaitu pewarnaan dengan menggunakan satumacam zat

warna dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel bakteri dan untuk mengetahui
morfologi dan susunan selnya . pewarnaan ini dapat menggunakan pewarnaan basa
pasda umumnya antara lain kristal violet , metylen blue , karbol , fuchsin , dan
safranin(lay ,1994).

25
 Pewarnaan negatif yaitu pewarnaan yang ditujukan terhadap bakteri yang sulit
diwarnai, dimana bakterinya tidak diwarnai melainkan latar belakangnya, metode
pewarnaan negatif merupakan suatu metode perwarnaan umum, dimana digunakan
larutan zat warna yang tidak meresap ke dalam sel-sel bakteri melainkan
melatar belakangi sehingga kelihatan atau nampak sebagai bentuk-bentuk kosong tak
berwarna(negatif) (Lay.1994).

Pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk mengelompokan

bakteri gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat
warna crystal violet dan akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun
bakteri gram negatif akan kehilangan zat warna crystal violet setelah dicuci dengan
alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna air fucsin atau safranin akan tampak berwarna
merah. Perbedaan zat warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi
dinding selnya. Pewarna yang digunakan dalam pewarnaan gram antara lain : crystal
violet, alkohol, safranin, dan iodine (Lay.1994).

Pewarnaan spora merupakan pewarnaan dengan menggunakan malachite green

dan safranin, yang dalam hasil pewarnaannya akan muncul warna hijau pada sporanya,
serta warna merah pada sel vegetatifnya yaitu pada Bacillus subtitulis(Lay.1994).

Prinsip pewarnaan sederhana didasarkan pada zat warna yang digunakan hanya
terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut yang merupakan suatu cara
yang cepat untuk melihat morfologi bakteri secara umum(Dwidjoseputro.1998).

Prinsip pewarnaan negatif yaitu suatu metode pewarnaan tidak langsung dimana
digunakan larutan zat warna yang tidak meresap kedalam sel bakteru melainkan ke
dalam latar belakangnya (Lay.1994)

Prinsip pewarnaan sederhana didasarkan pada zat warna yang digunakan hanya
terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut yang merupakan suatu cara
yang cepat untuk melihat morfologi bakteri secara umum(Dwidjoseputro.1998).

Prinsip pewarnaan negatif yaitu suatu metode pewarnaan tidak langsung dimana
digunakan larutan zat warna yang tidak meresap kedalam sel bakteru melainkan ke
dalam latar belakangnya (Lay.1994)

Crystal violet atau ungu gentian adalah pewarna triarylmethane. Pewarna ini
digunakan sebagai histologis noda dalam metode gram klasifikasi bakteri. Crystal

26
violet memiliki sifat sifat anti bakteri, jamur dan obat cacing, dan sebelumnya penting
sebagai antiseptik topikal (Sutedjo,1991).

Lugol’s yodium, juga dikenal sebagai solusi lugol, merupakan solusi dari
iodium dan iodida dalam air. Larutan yodium lugol digunakan sebagai antiseptik dan
desinfektan, dan untuk desinfikasi darurat air minum, dan sebagai reagen untuk deteksi
pasti di dalam laboratorium, pewarnaan dan tes medis (Dwidjoseputro.1998).

3.2.5 Kesimpulan

Dari percobaan pewarnaan yang dilakukan dapat ditarik kesimpulan :

1. Pewarnaan bakteri dipengaruhi faktor-faktor antara lain fiksasi, pelunturan warna,
substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup
2. Perbedaan pada garam negatif dan gram positif terletak pada warnanya pada gram
positif berwarna ungu kareana dapat mempertahankan zat pewarna kristal violet serta
perbadaan terjadi pada dinding selnya
3.Macam-macam pewarnaan antara lain : pewarnaan sederhana,pewarnaan
differensial,pewarnaan spora dan perwarnaan kapsul
4. Larutan zat warna yang digunakan pada percobaan perwarnaan antara lain : alkohol,
carbol fuchsin, crystal violet, nigrosin, malachite green, lugol’s iodida, dan safranin.

3.3 Uji Biokimia

27
3.3.1 Tujuan: Mengidentifikasi dan mendeterminasi bakteri berdasarkan sifat-sifat
biokimiawinya.

3.3.2 DASAR TEORI :

Mikroba tumbuh dan berkembang biak dengan menggunakan berbagai bahan

yang terdapat di lingkungannya. Nutrien yang terdapat di lingkungan sekelilingnya
terdiri dari molekul sederhana seperti H2S dan NH4+ atau molekul organik yang
kompleks seperti protein dan polisakarida. Mikroba mengoksidasikan nutrien ini untuk
memperoleh energi dan prekursor untuk sintesis dinding sel, membran dan flagella.
Penggunaan nutien tergantung aktivitas metabolisme mikroba. Percobaan-percobaan
dalam uji biokimiawi mencakup berbagai uji untuk mengetahui aktivitas metabolisme
mikroba. Pengamatan aktivitas metabolisme diketahui dari kemampuan mikroba untuk
menggunakan dan menguraikan molekul kompleks, seperti zat pati, lemak, protein dan
asam nukleat. Selain itu pengamatan juga dilakukan pada molekul yang sederhana
seperti asam amino dan sakarida. Hasil dari berbagai uji ini digunakan untuk pencirian
dan identifikasi mikroba (Lay, 1994).

Pada identifikasi bakteri mula-mula diamati morfologi sel individual secara

mikroskopik dan pertumbuhannya pada bermacammacam medium. Karena suatu
bakteri tidak dapat dideterminasi hanya berdasarkan sifat-sifat morfologinya saja, maka
perlu diteliti pula sifat-sifat biokimiawi dan faktor-faktor yang mempengaruhi
pertumbuhannya. Bakteri-bakteri yang morfologinya sama mungkin berbeda dalam
kebutuhan nutrisi dan persyaratan ekologi lainnya (temperatur, pH dsb) (Jutono dkk,
1980).

3.3.3 Pelaksanaan Praktikum :

3.3.3.1 Alat dan Bahan:

1. Isolat murni bakteri tanah (hasil percobaan Acara III) dalam NA miring dan NB

2. Reagen untuk test oksidase : tetramethyl-paraphenyldiamine

3. Reagen untuk test katalase : 10% atau 30% H2O2

4. Bahan untuk test O-F : media O-F yang mengandung 0,51% karbohidrat, paraffin
cair

28
5. Bahan untuk test sitrat : Simmons Citrate Agar yang mengandung indikator Brom
Thymol Blue-BTB

6. Bahan untuk test dekarboksilase lisin : media Lysin Iron Agar (LIA) yang
mengandung Lisin dan indikator Brom Cresol Purple-BCP, media tanpa Lisin

7. Media Nutrien Agar (NA)

8. Gelatin

9. Media TSIA (Triple Sugar Iron Agar)

10. Bahan untuk test pembentukan indol : media Tryptone Water, reagen Kovacs

11. Bahan untuk test MR-VP : media MR-VP, larutan 40% KOH, larutan 5% alpha-
naphtol

12. Bahan untuk test Urease : media Urea Broth, indikator Phenol Red

13. Buku Panduan Determinasi Bakteri : Bergey’s Manual of Determinative

Bacteriology (Holt et al., 2000)

14. Jarum ose

15. Pipet volume steril

3.3.3.2 Cara kerja:

1. Test Oksidase Letakkan 2-3 tetes larutan tetramethyl-paraphenyldiamine pada keras

saring. Ambillah suspensi isolat murni bakteri dalam nutrien cair dan inokulasikan pada
kertas saring yng telah ditetesi reagen. Amati dan laporkan hasil pengujian, reaksi
positif terjadi jika timbul warna ungu tua atau hitam setelah didiamkan selama beberapa
menit. Kadangkala perubahan warna memakan waktu lebih lama sampai 1030 menit.
Bandingkan dengan kontrol (tanpa inokulasi bakteri).

2. Test Katalase Letakkan 1-2 tetes 10 % atau 30% H2O2 pada gelas benda dan
tambahkan 1 ose atau 2-3 tetes suspensi isolat murni bakteri. Amati, katalase positif
ditandai oleh pembentukan buih seketika. Bandingkan dengan kontrol (tanpa inokulasi
bakteri).

3. Test O-F (Oksidasi-Fermentasi) Inokulasikan secara hati-hati isolat murni bakteri

ke dalam 4 tabung berisi media O-F yang mengandung 0,5-1% karbohidrat (glukosa,

29
laktosa, manitol, maltosa atau sukrosa) secara tusukan. Tabung I ditutup dengan parafin
lunak, tabung II tidak ditutup parafin, tabung III dan IV sebagai kontrol (ditutup
paraffin dan tidak ditutup paraffin tanpa inokulasi bakteri). Amati setelah 24 jam pada
suhu kamar. Bandingkan perlakuan dengan kontrol. Oksidasi (terbentuk warna kuning
pada media O-F yang tidak ditutup paraffin) terjadi pada mikroba aerobik dan
fermentasi (terbentuk warna kuning pada media O-F yang ditutup paraffin) terjadi pada
mikroba anaerob. Bandingkan dengan kontrol. Perhatikan perubahan warna media yang
terjadi dan indikator yang terkandung dalam media O-F.

4. Test Penggunaan Sitrat Isolat murni bakteri diinokulasikan secara goresan zig zag
menggunakan ose dan secara tusukan menggunakan jarum inokulasi pada media
Simmons Citrat Agar miring, kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 24 jam.
Perhatikan perubahan warna dengan melihat perubahan warna dari hijau menjadi biru.
Bandingkan dengan kontrol.

5. Test Dekarboksilase Lisin Pada medium yang mengandung lisin dan kontrol (media
tanpa lisin) diinokulasi secara tusukan dengan isolat murni bakteri, inkubasikan pada
suhu kamar selama 24 jam. Positif jika terjadi perubahan warna dari ungu menjadi
kuning dan kembali ke ungu, sementara pada kontrol (media tanpa lisin) terjadi
perubahan warna dari ungu menjadi kuning.

6. Test Hidrolisis Gelatin Dengan cara tusukan, inokulasikan isolat murni bakteri pada
media yang mengandung gelatin sedalam ¾ bagian dari lapisan permukaan.
Inkubasikan selama 24 jam pada suhu kamar. Pada saat pengamatan, masukkan tabung
perlakuan dan kontrol (media tanpa inokulasi bakteri) dalam almari es selama 30 menit.
Positif berarti terjadi pencairan.

7. Test H2S dan Fermentasi Gula-gula Dengan menggunakan media TSIA,

inokulasikan isolat murni bakteri secara goresan menggunakan jarum ose dan secara
tusukan menggunakan jarum inokulasi. Inkubasikan selama 24 jam Pembentukan H2S
ditunjukkan dengan terbentuknya endapan warna hitam. Perubahan warna media TSIA
dari merah menjadi kuning menunjukkan adanya fermentasi gula (glukosa, sukrosa,
laktosa). Amati juga apakah terbentuk gas yang ditandai dengan pecahnya media atau
terangkatnya media ke atas. Bandingkan dengan kontrol (media tanpa inokulasi
bakteri).

30
8. Test Indol Inokulasikan 1 tabung media Tryptone Water dengan 2 tetes isolat murni
bakteri dan 1 tabung media untuk kontrol (tanpa inokulasi bakteri). Inkubasikan pada
suhu kamar selama 24 jam. Setelah inkubasi, tiap-tiap tabung ditambah 10 tetes reagen
Kovacs. Terbentuknya warna merah/merah muda pada lapisan larutan reagen
menunjukkan terbentuknya indol. Bandingkan dengan kontrol.

9. Test MR (Methy Red) Inokulasikan isolat murni bakteri pada media MR-VP (media
Methyl Red-Voges Proskauer) dan inkubasikan selama 24 jam pada suhu kamar.
Tambahkan 5 tetes reagen Methyl Red ke dalam tabung berisi media MR-VP. Kocoklah
hati-hati, Hasil tes positif jika terjadi warna merah dalam waktu 30 menit setelah
penambahan reagen. Bandingkan dengan kontrol (tanpa inokulasi bakteri).

10. Test VP (Voges Proskauer) Inokulasikan isolat murni bakteri pada media MR-VP
dan inkubasikan selama 24 jam pada suhu kamar. Tambahkan 0,6 ml larutan alpha-
naphtol 5% dilanjutkan 0,2 ml KOH 40%. Kocoklah hati-hati, longgarkan tutupnya,
kocok kembali, ulangi setiap 5 menit, bacalah perubahan warnanya setelah 30 menit.
Hasil tes positif jika terjadi warna merah dalam waktu 30 menit setelah penambahan
reagen. Bandingkan dengan kontrol (tanpa inokulasi bakteri).

11. Test Urease Inokulasikan media Urea Broth yang mengandung indikator fenol
merah dengan 1 tetes kultur muni bakteri. Amatilah perubahan warna menjadi merah
(phenol red) setelah 24 jam pada suhu kamar. Bandingkan dengan kontrol.

3.4 Data Pengamatan

No. Sampel/Tes Ind Mr Vp Cit Urea Suk Lak TSIA

1. Tanah 3 + + - + - + + H2S +
Gas –
A/A
2. Susu - - - + - + + H2S +
Gas –
A/A

31
Gambar

3.5 Pembahasan

Mikrobiologi ialah telah mengenai organisme hidup yang berukuran

mikroskopis. Dunia mikroorganisme terdiri dari lima kelompok organisme
: bakteri, protozoa, virus, serta algae dan cendawan mikroskopis. Dalam bidang
mikrobiologi kita mempelajari banyak segi mengenai jasad-jasad renik ini (juga
dinamakan mikrobe atau protista); dimana ciri-cirinya, kekerabatan antara sesamanya
seperti juga dengan kelompok organisme lainnya, pengendaliannya, dan peranannya
dalam kesehatan serta kesejahteraan kita. (Volk, 1993.)

32
 Bakteria adalah organisme yang paling banyak jumlahnya dan lebih tersebar
luas dibandingkan makhluk hidup yang lain. Bakteri memiliki ratusan ribu spesies yang
hidup di darat hingga lautan dan pada tempat-tempat yang ekstrim. Bakteri ada yang
menguntungkan tetapi ada pula yang merugikan. Bakteri memiliki ciri-ciri yang
membedakannya dengan mahluk hidup yang lain. Bakteri adalah organisme uniselluler
dan prokariot serta umumnya tidak memiliki klorofil dan berukuran renik atau
mikroskopik.( Entjang,2001. )

Bakteri adalah salah satu golongan organisme prokariotik ( tidak mempunyai

selubung inti ) bakteri sebagai makhlu hidup tentu memiliki informasi genetic berupa
DNA,tapi tidak terlokaloisasi dalam tempat khusus ( Nukleus ) dan tidak ada membrane
inti.

E. coli adalah baktri coliform yang sering ditemukan pada faces manusia dan
hewan berdarah panas. Organisme ini tersebar luas di alam biasanya lazim terdapat
dalam sel pencernaan manusia dan hewan. Dalam Merchant dan Parker (1961)
disebutkan spesies E. coli tidak dapat mengurangi asam sitrat dan garam asam sitrat
sebagai sumber karbon tunggal dan tidak menghasilkan pigmen, tetapi kadang-kadang
menghasilkan pigmen berwarna kuning. ( Michael J. Pelczar, 1986, ).

Klasifikasi Escherichia coli :

Divisio : Schizomycota

Kelas : Schizomycetec

Ordo : Eubacteriaceae

Genus : Escherichia

Species : Escherichia coli

Escherichia coli umumnya merupakan bakteri pathogen yang banyak

ditemukan pada saluran pencernaan manusia sebagai flora normal. Morfologi bakteri
ini adalah kuman berbentuk batang pendek (coccobasil), gram negatif, ukuran 0,4 – 0,7
µm x 1-3 µm, sebagian besar gerak positif dan beberapa strain mempunyai kapsul.

Escherichia coli dapat tumbuh di medium nutrien sederhana, dan dapat

memfermentasikan laktosa dengan menghasilkan asam dan gas (Pelczar dan Chan,
2005:169). Kecepatan berkembangbiak bakteri ini adalah pada interval 20 menit jika

33
faktor media, derajat keasaman dan suhu tetap sesuai. Selain tersebar di banyak tempat
dan kondisi, bakteri ini tahan terhadap suhu, bahkan pada suhu ekstrim sekalipun. Suhu
yang baik untuk pertumbuhan bakteri ini adalah antara 80°C-460°C, tetapi suhu
optimumnya adalah 370C. Oleh karena itu, bakteri tersebut dapat hidup pada tubuh
manusia dan vertebrata lainnya. ( ANONIM, 2013 )

Escherichia coli adalah salah satu yang paling sering menyebabkan banyak
infeksi bakteri umum, termasuk kolesistitis ,bakteremia , kolangitis , infeksi saluran
kemih (ISK), dan traveler's diare, dan infeksi klinis lain seperti neonatal meningitis dan
pneumonia.

E.coli merupakan bakteri berbentuk batang dengan panjang sekitar 2

micrometer dan diamater 0.5 micrometer. Volume sel E. coli berkisar 0.6-0.7
micrometer kubik. Bakteri ini termasuk umumnya hidup pada rentang 20-40 derajat C,
optimum pada 37 derajat.

E.coli dapat menyebabkan infeksi saluran kemih, kantung kemih, ginjal, dan
prostat. Infeksi saluran kemih (uretritis) dan kantung kemih (sistitis) menimbulkan
gejala demam tidak tinggi, nyeri saat berkemih, sering berkemih, dan terus – menerus
merasa ingin berkemih. Infeksi pada ginjal (pyelonefritis) menyebabkan gejala nyeri
pada pinggang atau punggung bawah, demam tinggi disertai menggigil, mual, muntah,
dan nyeri kepala. Infeksi pada prostat (prostatitis) menimbulkan gejala demam tinggi
dengan menggigil, nyeri di sekitar anus dan punggung bawah; juga dapat disertai nyeri
berkemih dan sering berkemih. Pada beberapa pasien dapat ditemui nyeri otot dan nyeri
sendi. (Raynaldi, 2013 )

Enterobacter termasuk dalam family Enterobactericeae yang merupakan

kelompok gram negative berbentuk batang yang habitat umunya adalah di usus manusia
dan hewan. Enterobacter satu family dengan E.coli, Klebsiella, Salmonella, Shigella,
Proteus, dan sebagainya. Pada keadaan tertentu jika terjadi perubahan pada inang atau
bila kesempatan memasuki tubuh yang lain, banayak diantara bakteri ini yang mampu
menimbulkan penyakit ( ANONIM,2013 ).

Entherobacter merupakan genus umum gram negegatif(-), anaerob

fakultatif,berbentuk batang,tidak membentuk spora bakteri dari keluarga
Entherobactariaceae. Beberapa strain bakteri ini pathogen dan memyebabkan infeksi
opurtunisik di Immonucompromised(biasanya dirawat dirumah sakit). Host dan pada

34
mereka yang berada pada ventilsi mekanik. Kemih dan saluran pernfasan adalah situs
yang paling umum dari infeksi. Genus Entherobacter adalah anggota dan coliform
kelompok bakteri. Itu bukan milik coliform fecal (atau coliform tahan panas) kelompok
bakteri, seperti halnya bakteri Eschericia Coli, karena tidak mampu tumbuh pada suhu
44,5° C dengan adanya dua garam empedu. Dua species dari genus klinis penting ini
adalah E.Aerogene dan E.Cloaceae

Enterobacter merupakan flora normal pada sistem pencernaan manusia dan

hewan. Bakteri ini tidak akan menimbulkan penyakit jika tidak bergabung dengan jenis
bakteri lain. Ini disebabkan bakteri Enterobacter bukan penyebab tunggal munculnya
suatu penyakit. ( ANONIM, 2013 )

Klasifikasi Enterobacter :

Kingdom : Bakteri

Divisi : Proteobacteria

Class : Gammaproteobacteria

Ordo : Enterobacteriales

family : Enterobactericea

Genus : Enterobacter

Spesies : Aerogenes Enterobacter, E. amnigenus, E. asburiae, E. cancerogenus, E.

cloacae, E. cowanii, E. dissolvens, E. gergoviae, E. hormaechei, E. intermedius, E.
kobei, E. nimipressuralis; E. pyrinus , E. sakazakii,

Salah satu spesies dari Enterbacter yang menimbulkan penyakit bagi manusia
adalah Enterobactersakazaki. Enterobactersakazakii bukan merupakan
mikroorganisme normal pada saluran pencernaanhewan dan manusia. Habitat asli
bakteri Enterobacter sakazakii tidak diketahui secara pasti, sehingga disinyalir bahwa
tanah, air, sayuran, tikus, dan lalat merupakan sumber infeksi.Enterobacter
sakazakii dapat ditemukan di beberapa lingkungan industry makanan pabrik susu,
coklat, kentang, sereal, danpasta), lingkungan berair, sedimen tanah yang lembab.
Beberapa bahan makanan yang berpotensi terkontaminasi Enterobacter
sakazakii antara lain keju, sosis, daging cincang awetan, sayuran, dan susububuk. (
ANONIM,2014)

35
3.5 Kesimpulan

Berdasarkan dari hasil praktikum yang telah di dapatkan bahwa dalam uji
biokimia yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri dapat dilihat bahwa tiap jenis
bakteri dapat mengekspresikan atau menunjukkan karakternya tersendiri jika dilakukan
berbagai macam uji misalnya dalam uji Indol jika dapat membentuk cincin merah pada
permukaannya maka sudah dapat di pastikan salah satu bakterinya adalah E.Coli

BAB IV

Uji Potensi Antibiotik

36
4.1 Uji Potensi Antibiotik Secara Difusi Agar

4.1.1 Tujuan :

Mengetahui ada tidaknya potensi antibakteri dari suatu senyawa antimikroba

misalnya antibiotik, secara difusi sumuran dan difusi paper disk.

4.1.2 Dasar Teori :

Uji potensi antimikroba dapat dilakukan dengan 2 macam metode, yaitu metode
difusi dan metode dilusi. Cara pengujian potensi (daya atau kekuatan) senyawa
antimikroba ada bermacammacam, tergantung pada sifat dan bentuk sediaan senyawa
antimikroba. Pada umumnya digunakan cara pengenceran, cylinder diffusion plate
method, paper disk diffusion method dan agar dillution plate method. Prinsip kerja
metode difusi adalah terdifusinya senyawa antimikroba (misalnya antibiotik) ke dalam
media padat di mana mikroba uji (misalnya bakteri patogen) telah diinokulasikan.
Metode difusi dapat dilakukan secara paper disk dan secara sumuran.

Pada metode difusi secara paper disk, kertas disk yang mengandung antibiotik
diletakkan di atas permukaan media agar yang telah ditanam mikroba uji, setelah itu
hasilnya dibaca. Penghambatan pertumbuhan mikroba oleh antibiotik terlihat sebagai
zona jernih di sekitar pertumbuhan mikroba. Metode difusi secara sumuran dilakukan
dengan membuat sumuran dengan diameter tertentu pada media agar yang telah
ditanami mikroba uji. Sumuran dibuat tegak lurus terhadap permukaan media.
Antibiotik diinokulasikan ke dalam sumuran ini dan diinkubasikan, setelah itu hasilnya
dibaca seperti pada difusi secara paper disk. Luasnya zona jernih merupakan petunjuk
kepekaan mikroba terhadap antibiotik. Selain itu, luasnya zona jernih juga berkaitan
dengan kecepatan berdifusi antibiotik dalam media (Lay, 1994; Jawetz dkk, 1986).

4.1.3 Pelaksanaan Praktikum :

1. Uji Potensi Senyawa Antibiotik Secara Difusi Sumuran

4.1.3.1 Alat dan Bahan :

37
1. Alat gelas : Petridish steril, tabung reaksi, erlenmeyer, pipet ukur, pipet tetes, gelas
ukur

2. Mikropipet, pelobang gabus no. 4, jangka sorong/penggaris, jarum ose, spidol, kertas
label, vortex mixer, spreader

3. Senyawauji berupa antibiotik (misalnya Amoxycilllin sirup kering) dengan variasi

konsentrasi : 25; 12,5; 6,25 dan 3,125 mg/ml

4. Kultur murni bakteri ujidalam media NB umur 24 jam

5. Media nutrien agar (NA)

6. Deret larutan standar Mac Farland

7. Nutrient Broth (NB) untuk pembuatan suspensi bakteri uji

8. Aquadest steril sebagai pelarut senyawa uji i. Alkohol 70 %

4.1.3.2 Cara kerja :

1. Preparasi Senyawa Uji Preparasi senyawa uji dilakukan sesuai petunjuk dalam
kemasan, kemudian buatlah berbagai variasi konsentrasi senyawa uji. Pada praktikum
ini dibuat 4 variasi konsentrasi senyawa uji (konsentrasi 25; 12,5; 6,25 dan 3,125 mg/ml
(Perhatikan cara pembuatan konsentrasi senyawa uji!)

2. Preparasi Mikroba Uji

1) Siapkan kultur murni bakteri uji

2) Siapkan deret larutan standard Mac Farland

3) Buat sebanyak 2 tabung @10 ml suspensi bakteri ujimenggunakan media

BPW dan setarakan kekeruhannya dengan larutan standar Mac Farland II
(konsentrasi mikroba 6. 108 CFU/ml).

3. Pengujian potensi antibiotik secara difusi sumuran

1) Siapkan beberapa petri berisi 20 ml media nutrient agar (NA), 15 ml NA dan

5ml NA steril

2) Pembuatan kontrol kontaminasi media

38
 a) Buka petri berisi 20 media NA, secaraaseptis buatlah sumuran pada
petri 1) dengan pelobang gabus no. 4. Ambil bulatan NA pada sumur yang
dibuat dengan jarum ose secara hati-hati sehingga NA di sekelilingnya tidak
tergores/rusak. Masukkan bulatan NA tersebut dalam beker glass berisi alkohol.

b) Beri label pada dasar petri : kel. prakt/tgl/perlakuan

3) Pembuatan kontrol pertumbuhan bakteri uji secara double layer

1. Tuang 5 ml NA steril ke dalam cawan petri steril, biarkan memadat

sebagai base layer agar.

2. Ambil 1 ml suspensi bakteri uji, inokulasikan ke dalam 15 ml media

NA

secara pour plate, kemudian tuangkan secara merata sebagai seed layer
agar di atas base layer agar, biarkan memadat.

3. Buat 1 sumuran dengan menggunakan pelubang gabus No. 4.

Pembuatan sumuran dilakukan sampai dasar seed layer agar dan tidak
menembus base layer agar yang berfungsi sebagai dasar sumuran.

4. Beri label pada dasar petri : kel. prakt/tgl/perlakuan/nama bakteri uji

4) Pembuatan kontrol negatif dan pengujian potensi antibiotik secara difusi

sumuran

1. Buatlah media base layer agar dan seed layer agar seperti pada tahap
(3). Bagian dasar petri dibuat garis dengan spidol untuk membaginya
menjadi 4 bagian.

2. Buat sumuran pada bagian tengah ke-4 bidang petri tersebut dengan
cara yang sama dengan no. 3).

3. Dengan menggunakan mikropipet, pada masingmasing sumuran

tersebut diinokulasikan 50 µl senyawa uji dengan kontrol negatif/pelarut
dan 4 variasi konsentrasi senyawa uji.

4. Beri label pada dasar petri secara benar

5. Inkubasikan selama 24 jam.Perhatian : inkubasi tidak dilakukan

secara terbalik! Amati zona keruh dan jernih di setiap petri.
39
 6. Amati, gambar pertumbuhannya. Ukur diameter zona jernih di sekitar
sumuran dengan jangka sorong/penggaris. Hitung diameter zona hambat
yang terbentuk.

2. Uji Potensi Senyawa Antibiotik Secara Difusi Paper Disk

Alat dan Bahan :

1. Alat-alat : petridish , pinset, pipet volume steril

2. Kultur murni bakteri uji dalam media NB umur 24 jam

3. Disk antibiotik (paper disk yang mengandung antibiotik penisilin/ampisilin)

sebagai kontrol positif

4. Disk blank

5. Senyawauji berupa antibiotik (misalnya Amoxycilllin sirup kering) dengan

variasi konsentrasi : 25; 12,5; 6,25 dan 3,125 mg/ml

6. Media nutrien agar (NA)

7. Deret larutan standar Mac Farland

8. Buffered Pepton Water (BPW) untuk pembuatan suspensi bakteri uji i.

Aquadest steril sebagai pelarut senyawa uji j. Alkohol 70 %

Cara kerja :

a. Preparasi Mikroba Uji

1) Siapkan kultur murni bakteri uji.

2) Siapkan deret larutan standard Mac Farland

3) Buat 10 ml suspensi bakteri uji menggunakan media BPW dan

setarakan kekeruhannya dengan larutan standar Mac Farland II
(konsentrasi mikroba 6. 108 CFU/ml).

b. Pengujian potensi antibiotik secara difusi paper disk

1) Pembuatan kontrol kontaminasi media

a) Siapkan 20 ml media NA dan tuang secara aseptis ke dalam

petri steril, biarkan memadat

40
 b) Beri label pada dasar petri : kel. prakt/tgl/perlakuan.

2) Pembuatan kontrol pertumbuhan bakteri uji

a) Ambil 0,2 ml suspensi bakteri uji, inokulasikan ke dalam petri

berisi media NA secara spread plate (harus merata di seluruh
permukaan media) dan biarkan permukaan agar mengering.

b) Beri label pada dasar petri : kel. prakt/tgl/perlakuan/nama

bakteri uji.

3) Pengujian potensi antibiotik secara difusi paper disk

a) Siapkan petri berisi 20 ml media nutrien agar (NA)

b) Ambil 0,2 ml suspensi bakteri uji, inokulasikan ke media NA

secara merata dengan cara spread plate dan biarkan permukaan
agar mengering.

c) Secara aseptik,letakkan 1 disk antibiotik (disk yang

mengandung penisilin/ampisilin) dan 4 disk blank (yang
mengandung berbagai konsentrasi senyawa uji antibiotik
sebanyak 20 µl), serta 1 disk blank kontrol negatif (disk yang
mengandung pelarut) pada permukaan media NA.

d) Setiap paper disk diinokulasikan dengan jarak tertentu secara

teratur, agar supaya tidak terjadi overlapping zona hambat yang
terbentuk.

e) Beri label pada dasar petri secara benar

f) Inkubasikan selama 24 jam. Amati zona keruh dan jernih di

setiap petri

g) Amati, gambar pertumbuhannya dan ukur diameter zona

jernih yang terbentuk di sekitar paper disk dengan jangka
sorong/penggaris.

4.1.4 Data Pengamatan

No. Bakteri Antibiotik Diameter hambatan

41
 MC. 0,5 MC. 2
1. Stapylococcus aureus Ciprofloxacin - -
Tetrasiklin - 4,2 cm
2. Bakteri Comberan Ciprofloxacin 5,6cm -
Tetrasiklin - 4,1cm

No. Bakteri + Antibiotik Gambar

1

Staphylococcus Aureus + Tetra 0,5

Bakteri Comberan + Cifrofloxacin

0,5

Bakteri Comberan + Tetra 2

4.1.4 Pembahasan

Antimikroba adalah obat untuk membasmi mikroba,khususnya mikroba yang

merugikan manusia. Antibiotic adalah suatu zat yng dihasilkan oleh mikroba, terutama
turunan yang daoat menghambat/membasmi jenis mikroba lainnya. (Dr.Lud
Wahyu.2016).
Bahan antimikroba berfungsi sebagai mematikan, merusak, menghambat
pertumbuhan dari mikroba. Antimirkoba bekerja dengan cara merusak dinding sel atau

42
merusak protein dari mikroba sehingga mikroba tersebut mati, bahkan anti mikroba
bekerja dengan beberapa mekanisme yaitu membunuh dirinya sendiri,
mempertahankan hidupnya dan melawan bakteri lain. (Widjayanti. 1996)
Sensitivitas adalah suatu keadaan dimana mikroba sangat peka terhadap
antibiotic atau biasa disebut juga kepekaan suatu antibiotic yang masih baik untuk dapat
menunjukan posisi yang sesuai dengan daya hambt mikroba. Suatu mikroba akan
menunjukan perubahan kecil yang tidak ditemukan dengan metode kimia, sehingga
penyajian secara mikrologis dapat dilakukan. Uji sensitivitas berbagai macam
dilakukan untuk mengetahui hanya dapat membunuh mikroba atau dapat membunuh
satu jenis mikroba (Dr.Lud Wahyu .2016).
Digunakan metode pengujian difusi agar untuk mengetahui aktivitas mikroba.
Mikroba uji dicampurkan dengan media pertumbuan (Nutrient Agar) dan dituang ke
dalam cawan petri sehngga membentuk lempeng agar, setelah itu ditempelkan paper
disk dan di inokulasikan. Setelah proses inokulasi di lakukan pengukuran diameter
hambat berupa zona bening di sekitar paper disk yang menunjukan pertumbuhan
mikroba(Pelczar dan Chan .1998)
Pada praktikum ini digunakan bakteri staphylococcus aureus yang berasal dari
tanah,bahkan S.Coccus Aureus merupakan bakteri gram positif dengan tumbuh
berkelompok. Bakteri ini normal berada di kulit dan siap untuk tumbuh di jaringan yang
lebih dalam menimbulkan infeksi sapuratif, bakteri ini juga menghasilkan toksin
penghancur membran, yang mampu merusak eritrosit,lekosit,trombosit dan sel
manusia. Patologi -> menimbulkan saporatif dan akses klinik : menistetasi inflasi
S.coccus Aureus bervariasi tergantung pada latasi ( Sudarto Pringgoutomo at all.2002)
Cifrofloxacin merupakan antibiotik berspektrum luas, artinya antibiotic ini
dapat membunuh bakteri baik gram positif (+) maupun gram negative (-), cifrofloxacin
bekerja sebagai bakterisidasi dengan menghambat replikasi otot dan bakteri melalui
pada enzim DNA glirase, yaitu yang peting untuk memisahkan DNA ang berreplikasi
sehingga menyebabkan pemutusan rantai ganda pada kromosom bakteri/dengan kata
lain Cifroloxacin berfungsi untuk menghambat pembuatan sel (Kuswiyanto.2014)
Tetrasiklin memperlihatkan spectrum antibakteri yang luas (gram positif dan
negative) , golongan tetrasiklin termasuk antibiotic yang bersifat bakteriostatik dan
bekerja dengan jalan menghambat sintesis protein kuman (Kuswiyanto.2014)
Pada sampel 1 comberan yang menggunakan antibiotic cifrofloxacin terlihat
jelas zona hambaan yang terbentuk,semua tidak di tumbuhi bakteri kecuali yang kontrol
43
negative, karna tidak diberikan antibiotic, zona hambat terbesar ada di konsentrasi 25ml
dengan luas 5,6cm
Pada sampel 2 comberan yang mengunakan antibiotic tetrasiklin juga terlihat
dengan jelas zona hambat yang terbentuk, semua yang diberi antibiotic,kecuali nomor
3 dan kontrol negative, karena mungkin pada pengerjaan kami lupa meneteskan
(Human Error). Dan zona hambat terbesar pada konsentrasi 3,125cm dengan ukuran
4,1 cm
Pada sampel 3 S.coccus Aureus yang merupaka bakteri golongan gram positif
yang membedakan antara sampel ini yaitu S.coccus Aureus 0,5 menggunakan
Cifrofloxacin tidak terlihat zona hambatnya. Hal ini kemungkinan bisa terjadi karena
beberapa faktor yaitu : waktu penyebaran bakteri tidak bena, penghambatan bakteri
tidak bena, penetesan antibiotic yang tidak benar dan beberapa faktor Human Error.
Pada sampel 4 S.coccus Aureus yang merupakan bakteri gram positif,pada
sampel ini menggunakan antibiotik Tertrasiklin, disini terlihat dengan jelas zona
hambatnya semua tidak ditumbuhi bakteri kecuali kontrol negative (-). Zona hambat
terbesar ada pada konsentrasi 25 dengan ukuran 4,2cm

4.1.5 Kesimpulan
1. Dari data pengamatan dapat disimpulkan bahwa antibiotik ciprofloxacin dan
tetrasiklin cocok untuk menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus
aureus karena membentuk zona bening/zona hambat.
2. uji ini bertujuan untuk mengetahui zona hambat suatu Antibiotik
3. Antibiotik yang digunakan ciprofloxacin dan tetrasiklin.
4. Bakteri yang digunakan staphylococcus aureus dan bakteri tanah.

44
4.2 Uji Potensi Antibiotik Secara Dilusi
4.2.1. Tujuan : Menentukan Kadar Hambat Minimal (KHM) dari suatu antibiotik
secara dilusi padat.
4.2.2. DASAR TEORI :
Kadar Hambat Minimal (KHM) suatu antibiotik adalah konsentrasi antibiotik
terendah yang masih dapat menghambat pertumbuhan mikroba tertentu. Kadar Bunuh
Minimal suatu antibiotik adalah konsentrasi antibiotik terendah yang dapat membunuh
pertumbuhan mikroba tertentu. KHM dan KBM dapat ditentukan dengan prosedur
tabung dilusi. Prosedur ini digunakan untuk menentukan konsentrasi antibiotik yang
masih efektif untuk mencegah pertumbuhan patogen dan mengindikasikan dosis
antibiotik yang efektif dalam mengontrol infeksi pada pasien (Radji, 2004).
Metode dilusi disebut metode pengenceran. Pada metode ini obat (misalnya
antibiotik) dibuat dalam berbagai konsentrasi, kemudian ditambahkan pada media yang
mengandung mikroba uji. Hasil yang dibaca adalah kekeruhan. Kekeruhan
menandakan adanya potensi hambat obat pada konsentrasi tersebut. Keuntungan
metode ini dibandingkan dengan metode difusi adalah dapat menentukan Kadar
Hambat Minimum (KHM) atau MIC (Minimum Inhibitory Concentration) dari obat
tersebut. Ada 3 macam cara dalam metode dilusi yaitu metode Macro Broth Dilution,
metode Micro Broth Dilution dan metode agar dilusi (dilusi padat). Pada metode agar

45
dilusi digunakan satu seri plate agar, masing-masing mengandung konsentrasi obat
yang berbeda yang berkisar pada dosis terapeutik. Setelah inkubasi dapat dilihat
hasilnya dengan membaca kekeruhan pada masing-masing konsentrasi sehingga bisa
ditentukan MIC (Koneman et al, 1997).
Metode dilusi (dilution method) menggunakan senyawa antimikroba dengan
kadar yang menurun secara bertahap, baik dengan media cair atau padat. Pada media
yang diinokulasi mikroba uji, dilarutkan senyawa antimikroba dengan menggunakan
beberapa tingkatan konsentrasi senyawa antimikroba, dan kemudian diamati pada
konsentrasi berapakah senyawa antimikrobia tersebut bersifat menghambat atau
mematikan.Pada uji mikrodilusi cair dapat memberikan hasil kuantitatif yang
menunjukkan jumlah antimikrobia yang dibutuhkan untuk mematikan bakteri (Jawetz
dkk, 2001).Metode ini dapat digunakan untuk penentuan Kadar Hambat Minimal
(KHM) dan Kadar Bunuh Minimal (KBM).
4.2.3 Pelaksanaan Praktikum :
4.2.3.1 Alat dan Bahan :
1. Kultur murni bakteri ujidalam media NB umur 24 jam
2. Senyawauji berupa antibiotik (misalnya Amoxycilllin sirup kering). Variasi
konsentrasi ditentukan berdasarkan hasil percobaan VI. (variasi konsentrasi, 6,25;
3,125; dan 1,5625 mg/ml)
3. Alat-alat : petridish steril, pipet volume steril
4. Media nutrien agar (NA)
5. Deret larutan standar Mac Farland
6. NB untuk pembuatan suspensi bakteri uji
7. Alkohol 70 %
8. Aquades steril
4.2.3.2 Cara kerja :
1. Buatlah seri pengenceran/variasi konsentrasi larutan antibiotik dalam aquades steril.
Seri pengenceran ditentukan berdasarkan hasil percobaan acara VI
2. Siapkan media NA (siap dituang ke petri secara pour plate). Bila media dalam
keadaan memadat, cairkan terlebih dahulu dengan pemanas sampai menjadi cair dan
buat hingga suhunya sekitar 45 – 50oC sehingga siap untuk dicampur dengan bakteri
uji.
3. Buatlah suspensi bakteri uji dengan kepadatan yang setara dengan larutan standar
Mac Farland II.
46
4. Pembuatan kontrol kontaminasi media (per meja)
A. Ambil 15 ml media NA, tuang ke dalam petri streril secara pour plate.
Biarkan memadat.
B. Beri label pada dasar petri : kel. prakt/tgl/perlakuan. Inkubasi selama 24 jam.
Bandingkan dengan perlakuan.
5. Pembuatan kontrol pertumbuhan bakteri uji (per meja)
A. Ambil 15 ml media NA dalam tabung. Masukkan 1 ml suspensi bakteri uji
ke dalam tabung tersebut.
B. Tuang dalam petri steril secara pour plate. Biarkan memadat. Beri label pada
dasar petri : kel. prakt/tgl/perlakuan/nama bakteri uji. Inkubasi selama 24 jam.
Bandingkan dengan perlakuan.
6. Pembuatan kontrol negatif (pengujian potensi antibakteri pelarut) (per kelompok
kecil)
A. Ambil 15 ml media NA dalam tabung. Masukkan 1 ml suspensi bakteri uji
dan 1 ml aquades steril pelarut senyawa antibiotik ke dalam tabung tersebut.
B. Tuang dalam petri steril secara pour plate. Biarkan memadat. Beri label pada
dasar petri : kel. prakt/tgl/perlakuan/nama bakteri uji. Inkubasi selama 24 jam.
Bandingkan dengan perlakuan.
7. Pengujian potensi antibiotik secara dilusi padat (per kelompok kecil)
A. Ambil 3 tabung yang masing-masing berisi 15 ml media NA suhu 45 – 50oC,
tambahkan 1 ml suspensi bakteri uji pada masing-masing tabung tersebut.
Tambahkan pula larutan antibiotik dengan konsentrasi yang telah ditetapkan
pada langkah 1.
B. Siapkan 3 petri steril untuk menuang ketiga preparat di atas secara pour plate.
Biarkan memadat. Beri label pada dasar petri.
C. Inkubasi selama 24 jam. Amati dan bandingkan kekeruhan dari masing-
masing petri. Bandingkan antara kontrol dan perlakuan.
8. Pembacaan Hasil
A. Setelah masa inkubasi, kekeruhan media yang menunjukkan kepadatan
pertumbuhan bakteri uji diamati dan diberi penilaian menggunakan notasi (+)
untuk media yang tampak keruh dan (-) jika tidak ada kekeruhan yang berarti
tidak ada pertumbuhan bakteri uji dalam media agar tersebut.
B. Hasil pengamatan dianalisis untuk mendapatkan konsentrasi atau kadar
hambat minimal senyawa antibiotik. Kadar Hambat Minimal (KHM) adalah
47
 konsentrasi minimal senyawa antibiotik yang menunjukkan adanya
penghambatan pertumbuhan bakteri uji.
9.Penegasan Hasil
A. Dari pengamatan kekeruhan, pilih perlakuan dengan tingkat kekeruhan (-)
dan perlakuan dengan tingkat kekeruhan (+)
B. Dengan menggunakan jarum ose, ambilah 1 ose dari tabung perlakuan
tersebut dan tanamlah di atas permukaan cawan agar dengan metode goresan
sederhana.
C. Dari hasil goresan pada cawan agar, tentukan harga KHM (Kadar Hambat
Minimal) dan KBM (Kadari Bunuh Minimal). KHM : kadar antibiotik terendah
yang masih menunjukkan pertumbuhan ketika ditanam dalam cawan agar
dengan metode gores. KBM : kadar antibiotik terendah yang sama sekali tidak
menunjukkan pertumbuhan ketika ditanam dalam cawan agar dengan metode
gores. (lihat lampiran 2 : Penentuan KHM dan KBM)
4.2.4 Data Pengamatan
Konsentrasi
Nama Pengamatan ke 1 Pengamatan ke 2
No antibiotic
bakteri 1X24 jam 4X24 jam
(tetrasiklin)

Kontrol
1. -
Kontaminasi –
–
Tumbuh bakteri. Seharusnya
Tumbuh bakteri.
tidak. Dikarenakan
Seharusnya tidak.
pengerjaan yang tidak
Dikarenakan pengerjaan
aseptis
yang tidak aseptis.

2. - Kontrol +

48
 +

3. - Kontrol –

+
+

6,25

(+) KBM (+) KBM

3,125

(-) KHM
(+) KBM
4 Susu

1,5625

(-) KHM
(+) KBM

49
 6,25

(+) KBM (+) KBM

5 S.Aureus

3,125

(+) KBM
(+) KBM

1,5626

(+) KBM
(+) KBM

4.2.4 Pembahasan
Antimikroba adalah obat untuk membasmi mikroba,khususnya mikroba
yang merugikan manusia. Antibiotic adalah suatu zat yng dihasilkan oleh mikroba,
terutama turunan yang daoat menghambat/membasmi jenis mikroba lainnya. (Dr.Lud
Wahyu.2016).
Bahan antimikroba berfungsi sebagai mematikan, merusak, menghambat
pertumbuhan dari mikroba. Antimirkoba bekerja dengan cara merusak dinding sel atau
merusak protein dari mikroba sehingga mikroba tersebut mati, bahkan anti mikroba
bekerja dengan beberapa mekanisme yaitu membunuh dirinya sendiri,
mempertahankan hidupnya dan melawan bakteri lain. (Widjayanti. 1996)
Sensitivitas adalah suatu keadaan dimana mikroba sangat peka terhadap
antibiotic atau biasa disebut juga kepekaan suatu antibiotic yang masih baik untuk dapat
menunjukan posisi yang sesuai dengan daya hambt mikroba. Suatu mikroba akan
menunjukan perubahan kecil yang tidak ditemukan dengan metode kimia, sehingga
50
penyajian secara mikrologis dapat dilakukan. Uji sensitivitas berbagai macam
dilakukan untuk mengetahui hanya dapat membunuh mikroba atau dapat membunuh
satu jenis mikroba (Dr.Lud Wahyu .2016).
pada praktikum ini bertujuan untuk menentukan kadar hambar minimum
(KHM) dan kada bunuh minimum (KBM) dari satu sampel terhadap mikroba uji.
Metode yang digunakan dalam praktikum ini adalah metode dilusi padat. Kadar hambat
minimum (KHM) dan kadar bunuh minimum (KBM) adalah zat-zat kimia yang
dihasilkan oleh fungi dan bakteri, memiliki khasiat mematikan atau menghambat
pertumbuhan kuman dan toksisitasnya relative kecil bagi manusia (Pelczar.1986)
Tetrasiklin merupakan kelompok antibiotic yang dihasilkan oleh jamus
Streptomyces Aureofacens/ S.Simosum. Tetrasiklin merupakan devrivat dari senyawa
hidronaftalen dan berwarna kuning (Subranto.2001). Tertrasiklin merupakan antibiotic
berspektrum luas yang aktif terhadap bakteri gram positif (+) dan bakteri gram negative
(-) yang bekerja melintangi sintesa protein (Tan dan Raharja.2008). Golongan
tetrasiklin termasuk antibiotic yang terutama memperlihatkan spectrum antibakteri luas
yang terutama bersifat bakteriostatik dan bekerja dengan cara menghambat sintesis
protein. Efektivitasnya tinggi terhadap bakteri gram negative . Contohnya : E.Coli,
Pseudomonas Muelli, dan beberapa bakteri terutama Staphylo coccus Aureus.
Meningkat resistensi terhadap tetrasiklin ( artinya cocok dengan tetrasiklin). Resistensi
terhadap satu jenis tetrasiklin biasanya disertai resistensi terhadap sema tetrasiklin
lainnya, kecuali minosiklin pada resistensi Sthapylococcus Aureus dan doksisiklin pada
resistensi 𝛽 fragili. (Setyabudy dan Gan.1955)
Sthapylococcus Aureus merupakan bakteri gram positif (+) berbentuk bulat
biasanya tersusun dalam bentuk mengerombol yang tidak teratur seperti anggur.
Sthapylococcus Aureus, bertambah dengan cepat pada beberapa tipe media dengan aktif
melakukan metabolism, melakukan fermentasi karbohidrat dan menghasilkan
bermacam-macam pigmen dan warna putih hingga kuning gelap. Sthapylococcus cepat
menadi resistensi terhadap antimikroba (Jawetz et al.2001)
Sthapylococcus Aureus, tumbuh dengan baik pada berbagai media bakteriologi
di bawah suasana aerobic/mikroaerofillik. Tumbuh dengan cepat pada temperature 20-
35°C. koloni pada media padat berbentuk bulat, lambat dan mengkilap. Staphlococcus
Aureus mempunyai 4 karakteristik yaiu faktor Virulensi yang menyebabkan penyakit
yang berbeda pada sisi/tempat yang berbeda, faktor Resistensi bakteri pada lingkungan

51
degan manusia yang membawa gelaja karier dan faktor resistensi berbagai antibiotic
yang sebelumnya masih efektif (Spicer.200)
4.2.5 Kesimpulan
1. Pada bakteri S.Aureus tetrasiklin mempunyai daya bunuh yang baik pada
konsentrasi 1,5625; 3,125; 6,25 mg/ml. Hal ini terbukti jernihnya media
pada cawan. Setelah 1x24 jam masa inkubasi.
2. Bakteri staphloccous aureus, tetrasiklin mempunyai daya bunuh yang
cukup baik dapat dilihat pada kejernihan media.
3. Pada bakteri Susu Tetrasiklin mempunyai daya bunuh yang baik di
konsentrasi 6,25 mg/ml dan memiliki daya hambat di konsentrasi
3,123;1,5625 mg/ml

BAB V
UJI CEMARAN MIKROBA

5.1 Uji Cemaran Mikroba

5.1.1 Tujuan :
1.Menghitung jumlah mikroba aerob mesofil yang terdapat dalam sampel
2. Menguji bahwa sampel yang diuji tidak boleh mengandung mikroba melebihi
batas yang ditetapkan karena berbahaya bagi kesehatan manusia

5.1.2 DASAR TEORI :

Angka Lempeng Total (ALT) adalah pertumbuhan bakteri mesofil aerob setelah
sampel diinkubasi dalam perbenihan yang cocok selama 24-48 jam pada suhu 37°C
(SNI, 1992).
Uji ALT (Angka Lempeng Total) mengandung prinsip yaitu pertumbuhan
koloni bakteri aerob mesofil setelah cuplikan diinokulasikan pada lempeng agar dengan
cara tuang dan diinkubasi pada suhu yang sesuai. Pengujian dilakukan secara duplo.
Setelah inkubasi, dipilih cawan petri dari satu pengenceran yang menunjukkan jumlah
koloni antara 30-300 koloni. Jumlah koloni rata-rata dari kedua cawan dihitung lalu
dikalikan dengan faktor pengencerannya. Hasil dinyatakan sebagai Angka Lempeng
Total (ALT) dalam tiap gram contoh bahan (Anonim, 1992; Anonim, 2000).

52
 Angka kapang/khamir adalah jumlah koloni kapang dan khamir yang
ditumbuhkan dalam media yang sesuai selama 5 hari pada suhu 20-250 C dan
dinyatakan dalam satuan koloni /mL (Soekarto, 2008).
Uji AKK (Angka Kapang Khamir) mengandung prinsip yaitu pertumbuhan
kapang dan khamir setelah cuplikan diinokulasikan pada media yang sesuai dan
diinkubasikan pada suhu 20-25oC. Setelah inkubasi, dipilih cawan petri dari satu
pengenceran yang menunjukkan jumlah koloni antara 10-150 koloni. Jumlah koloni
rata-rata dari kedua cawan dihitung lalu dikalikan dengan faktor pengencerannya.
(Anonim, 1992; Anonim, 2002).

5.1.3 Pelaksanaan Praktikum

1. Uji Angka Lempeng Total (ALT)
Alat dan Bahan :
A. Media Plate Count Agar (PCA)
B. Buffered Pepton Water (BPW)
C. Sampel uji (jamu gendong)
D. Pipet volume
E. Colony Counter (alat hitung koloni)
Cara Kerja :
A. Penyiapan Sampel Uji
Kemasan jamu yang akan dibuka dibersihkan dengan kapas beralkohol 70% kemudian
dibuka secara aseptis di dekat nyala api spiritus.
B. Persiapan dan Homogenasi Sampel
Secara aseptis diambil sebanyak 10 ml sampel ke dalam labu ukur 100 ml, lalu d
itambahkan 90 ml BPW dan dihomogenkan hingga diperoleh pengenceran 10-1
C. Pembuatan media PCA (Plate Count Agar) (hitung dan lihat cara pembuatan
media pada kemasan)
D. Pengenceran sampel untuk uji ALT
Sebanyak 5 buah labu ukur 10 ml disiapkan, masing-masing telah diisi dengan 9 ml
pengencer BPW. Sebanyak 1 ml pengenceran 10-1 dari hasil homogenisasi pada
penyiapan sampel diambil dan dimasukkan ke dalam tabung pertama yang telah diisi 9

53
ml BPW hingga diperoleh pengenceran 10-2 (homogenisasi dengan vortex).
Selanjutnya dibuat pengenceran hingga 10-5.
E. Uji Angka Lempeng Total (ALT)
Dari tiap pengenceran dipipet 1 ml suspensi ke dalam cawan petri steril secara duplo.
Dalam setiap cawan petri dituangkan sebanyak 15 ml media PCA. Cawan petri
digoyang dengan hati-hati agar sampel tersebar merata. Dilakukan pula uji kontrol
untuk mengetahui sterilitas media dan pengencer. Uji sterilitas media dilakukan dengan
cara menuangkan media PCA dalam cawanpetri dan biarkan memadat. Uji sterilitas
pengencer dilakukan dengan cara menuangkan media PCA dan 1 ml pengencer BPW
lalu dibiarkan memadat. Seluruh cawan petri diinkubasi terbalik pada suhu 350C
selama 24 - 48 jam. Jumlah koloni yang tumbuh diamati dan dihitung. Perhitungan
Angka Lempeng total dalam 1 ml contoh dengan mengkalikan jumlah rata-rata koloni
pada cawan dengan faktor pengenceran yang digunakan.
3. Uji Angka Kapang Khamir (AKK)
Alat dan Bahan :
A. Media Potato Dextrrose Agar (PDA)
B. Larutan pengencer Pepton Dilution Fluid (PDF)
C. Sampel uji ( jamu gendong)
D. Kloramfenikol 100 mg/liter media Pembuatan larutan kloramfenikol : 1 gram
kloramfenikol dalam 100 ml air suling steril.
E. Pipet volume
F. Colony counter (alat hitung koloni)
Cara Kerja :
A. Penyiapan Sampel Uji (sama dengan uji ALT)
B. Pembuatan media PDA (Potato Dextrose Agar
C. Homogenisasi dan Pengenceran Sampel 1) Perhitungan Angka Kapang
Khamir (AKK) bertujuan untuk menghitung jumlah koloni kapang dan khamir yang
terdapat dalam bahan. Pada prinsipnya pengujian ini menggunakan metode yang sama
dengan penentuan Angka Lempeng Total (ALT). 2) Media pertumbuhan yang
digunakan adalah PDA (Potato Dextrose Agar) 3) Larutan pengencer yang digunakan
adalah Pepton Dilution Fluid (PDF)
D. Uji AKK Dari masing-masing pengenceran dipipet 1 ml ke dalam cawan
petri steril secara duplo. Media PDA yang telah dicairkan sebanyak 20 ml dituangkan

54
 ke dalam cawan petri yang sebelumnya telah ditambah dengan 1 ml larutan

PENGENCERAN
KONTROL
PENGAMATAN MEDIA
KONTAMINASI
10-1 10-2 10-3 10-4

PDA +
- - - - -
TETRASIKLIN
HARI 1
1 X 24 JAM
PCA - 27 52 28 9

PDA+
- - - - 6
TETRASIKLIN
HARI 2
2 X 24 JAM
PCA - 68 70 15 24

kloramfenikol dan digoyangkan sehingga campuran tersebut merata. Setelah agar

membeku, cawan petri dibalik dan diinkubasikan pada suhu 250C atau pada suhu kamar
selama 5 hari. Pengamatan dilakukan setiap hari sampai hari ke-5. Koloni kapang dan
khamir dihitung setelah 5 hari. Uji sterilitas media dilakukan dengan menuangkan
media PDA dalam cawan petri dan dibiarkan memadat. Uji sterilitas pengencer
dilakukan dengan cara menuangkan media PDA dan 1 ml pengencer (PDF) lalu
dibiarkan memadat.

5.1.4 Data Pengamatan

55
 Kontrol Kontaminasi Pengenceran 10-1 Pengenceran 10-2

PDA

Pengenceran 10-3 Pengenceran 10-4

Kontrol Kontaminasi Pengenceran 10-1 Pengenceran 10-2

PCA

Pengenceran 10-3 Pengenceran 10-4

5.1.4 Pembahasan

56
 Pada praktikum kali ini adalaah penentuan ALT(Angka Lempeng Total) dan
AKK (Angka Kamir Kapang). Penentuan ALT merupakan metode kuantitatif yang
digunakan untuk mengetahui jumlah mikroba yang ada pada suatu sampel. Sedangkan
AKK merupakan metode kuantitatif yang di gunakan untuk mengetahui jumlah kadar
mikroba yang ada pada suatu sampel (BPOM.2008)
Jamu adalah obat yang berasal dari bahan tumbuhan ,hewan ,mineral dan
sediaannya atau campuran bahan-bahan campuran tersebut yang digunakan dalam
upaya pengobatan berdasarkan atas pengalaman. Jamu gendong itu sendiri adalah jamu
yang diracik, dicampur, diolah, dan diedarkan sebagai obat tradisional dalam bentuk
cairan,pil,tablet/permen. Tanpa penandaan dan atau merek dagang serta dijajakan
langsung untuk dikonsumsi (Departemen Kesehatan RI.1991)
Jumlah jamu atau kapan kamir yang benar, menunjukan kemunduran dari mutu
obat tradisional yang dihasilkan. Pada beberapa kapang tertentu ada yang menghasilkan
zat racun atau toksin seperti jamur Aspergillus dapat menghasilkan Aflatoksin yang
dapat meracuni organ tubuh bahkan dapat menyebabkan kanker. Untuk obat tradisional
disyaratkan secara umum jika terhadap aflatoksin maka tidak boleh >30 biji (bagian
Pefuso) dan sediaan tersebut (Jamu). (Wasito.2011)

Semakin kecil Angka Lempeng Total dan Angka Kapang Kamir bagi setiap
produk yang dihasilkan menunjukan semakin tinggi nilai penetapan (POTB dalam
pembuatan obat tradisional tersebut) (Wajito.2011). Pertumbuhan kapang kamir pada
bahan makanan atau bahan baku obat tradisional dapat mengurangi kuantitas. Pada
beberapa kapang menghasilkan toksin yang berbahya bagi tubuh manusia
(Pratiwi.2008)

Uji AKK ini digunakan untuk menghitung jumlah kapang kamir setelah
diinkubasi pada suhu 20-25°C. Tujuan ini untuk memberikan jaminan bahwa sediaan
jamu ini tidak mengandung cemaran fungi melebihi batas yang di tetapkan karena
pengaruh terhadap stabilitas sediaan & aflatoksin yang berbahay bagi kesehatan
(DepKes I.2008). dalam uji ALT juga memungkinkan terhadap bakteri pathogen seperti
Salmonella, E.Coli, Dan Shigella yang dapat menyebabkan diare. (Radji.2011)

Uji ALT digunakan untuk menghitung banyaknya bakteri yang tumbuh dan
berkembang pada sampel, juga sebagai acuan yang dapan menentukan kualitas &
kemanan (DepKes. 1994). Pada jamu gendong tidak memerlukan ijin usaha industry

57
tetapi tetap harus aman, sehingga perlu adanya parometer keamanan. Pada pengujian
Angka Lempeng Total digunakan PCA sebagai media padatnya. Medium Plate Count
Agar (PCA) dapat berfungsi sebagai medium untuk pertumbuhan mikroba
(Partic.2008)

Pada Jamu dapat dikonsumsi jika hasil akhir CPUnya tidak melebihi dari
1x10ˉ6 karena jika melewati batas makan jamu/sampel tersebut tidak baik digunakan.
Dan yang diperoleh jamu tersebut dari data kelompok kami jamu dapat dikonsumsi
karena hasil akhirnya adalah 1,2546x10³ dan masih aman

5.1.5 Kesimpulan
1. Bakteri adalah suatu organisme prokariot yang pada umumnya
mengandungukuu g enerasi yaituran sel 0,5-1,0 μm kali 2,0-5,0 µm dan
terdiriwaktuyang dibutukan oleh seldari tiga bentuk dasar yaitu: bentuk bulat
ataukokus, bentuk batang atau basilus dan bentuk spiral
2. Kapang adalah mikroba yang memiliki lebih dari satu sel yang
mengandung benanghalus yang disebut hifa, kumpulan hifa disebut miselium,
dan berkembang biak dengan spora.
3. Khamir adalah mikroba bersel tunggal berbentuk bulat lonjong
danmemperbanyak diri dengan cara membentuk tunas (askospora),
tetapitidakmembentuk miselum.
4. ALT(Angka Lempeng Total) merupakan metode kuantitatif yang digunakan
untuk mengetahui jumlah mikroba yang ada pada suatu sampel Sedangkan
AKK(Angka Kamir Kapang) merupakan metode kuantitatif yang di gunakan
untuk mengetahui jumlah kadar mikroba yang ada pada suatu sampel.
5. Hasil dari praktikum ini menyatakan bahwa , sampel yang digunakan yaitu
jamu kunyit asam ini AMAN untuk dikonsumsi

58
 Daftar Pustaka
 Atlas,R.M.1946.Handbook Of Microbiological Media 3th Edition.CRC Press:
Amerika.
 Pelczar., Michael J. dan E. C. S. Chan, 2008. Dasar-dasar Mikroorganisme.
Universitas Indonesia Press. Jakarta
 Machmud, M. 2008. Teknik Penyimpanan dan Pemeliharaan Mikroba. Balai
Penelitian Bioteknologi Tanaman Pangan, Bogor.
 Suriawiria, Unus. 2008. Mikrobiologi Air. Bandung: PT. Alumni.
 Oram, R.F. S., Paul. J. Hummer, Jr. 2001. Biology Living System. Glencoe Division
Mc Millan Company. Waterville.
 Jang Nathan,S.K.Mondal.M.2009. AntiProliterasi; Pengaruh Madu dan Polipeptits : A
Review J Biomed Biarchrol.
 Dwidjoseputro, D.1998.Dasar-Dasar Mikrobiologi, Malang : Djambatan.
 Dawson,T.L.2007. Malassezia globasa der restrica: Terobosan Pemahaman tentang
Etiologi dan Pengobatan Ketombe dan Sebarrhoic Dermatitis melalui whole. Genome
Analis

59
 Katzurg, B.G.1998. Farmakologi dasar dan klinik Edisi III. Ahli bahas: Staff Dosen
Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Sriwijaya, Editor: H.Azwar. Jakarta:
Penerbit buku kedokteran EGC
 Lay, Bibiana.W, 1994, Analisis Mikroba di Laboratorium. Rajawali. Jakarta
 Sutedjo, Mul Mulyani.1991.Mikrobiologi Tanah.Jakarta : Rineka Cipta.
 Schlegel,H.G. dan Schmidt, K.1994. Mikrobiologi Umum. Gadjah Mada University
Press : Yogyakarta.
 Volk dan Wheeler. 1993. Mikrobiologi Dasar Jasad V. Jakarta : Erlangga.
 Anonym. 2013 Klasifikasi Morfologi dan Pathogenesis.
 Raynaldi, 2103. Bakteri Eschericia Coly.
 Waluyo, lud. 2004. Mikrobiologi Umum.Malang : UMM Press.
 Widjayanti U.1996.Obat-Obatan.Yogyakarta :Kanisius
 Sudarto Pringgo Utomo,.M,Kes. 2016. Mikrobiologi Umum. Malang.: UMN Press
 Kuswiyanto,S.Si,M,Kes. 2014. Bakteriologi 1. Jakarta : EGC
 Setya Budy.R. dan Gan.V.H.S., 1995. Farmakologi Terapi : Pengantar Antimikroba.
Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Jakarta
 BPOM.2008. Pengujian Mikrobiologi Pangan. Jakarta: Pusat Pengujian Obat dan
Makanan Badan Pengawasan Obat dan Makanan Republik Indonesia.
 Dapartemen Kesehatan Republik Indonesia.1991. Cara Pembuatan Obat Tradisional
yang baik (CPOTB) Jakarta: Departemen Kesehatan RI
 Radji.,M.,2011. Buku Ajar Mikrobiologi Panduan Mahasiswa Farmasi dan
Kedokteran. Jakarta : Buku Kedokteran EGC
 Wasito.H.2011. Obat Tradisional Kekayaan Indonesia. Yogyakarta: Graha Ilmu
 Pratiwi,S.T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta : Erlangga

60