BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

1.2 Tujuan Praktikum

Adapun tujuan dari praktikum ini adalah untuk :
Memahami persiapan dan pelaksanaan pengenceran suspensi bakteri
sebelum melakukan kegiatan isolasi bakteri
Mengenal dan memahami teknik-teknik isolasi bakteri
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Tinjauan Umum Isolasi Bakteri

Isolasi adalah mengambil mikroorganisme yang terdapat di alam dan
menumbuhkannya dalam suatu medium buatan. Prinsip dari isolasi mikroba
adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lainnya yang berasal
dari campuran bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan
menumbuhkannya dalam media padat atau media cair, sel-sel mikroba akan
membentuk suatu koloni sel yang tetap pada tempatnya (Sutedjo,1996). Bila
sel-sel itu dipisahkan dengan cara pengenceran, kemudian ditumbuhkan
dalam media padat dan dibiarkan membentuk koloni, maka sel-sel tersebut
selanjutnya dapat diisolasi dalam tabung-tabung reaksi atau cawan petri-
cawan petri yang terpisah (Sutedjo, 1996). Berdasarkan (Dwidjoseputro,
1998) beberapa faktor yang perlu diperhatikan dalam mengisolasi
mikroorganisme adalah sifat dan jenis mikroorganisme, habitat
mikroorganisme, medium pertumbuhan, cara menginokulasi dan inkubasi,
cara mengidentifikas, serta cara pemeliharaannya.
Isolasi bakteri atau biakan yang terdiri dari satu jenis mikroorganisme
(bakteri) dikenal sebagai biakan murni atau biakan aksenik. Biakan yang
berisi lebih dari satu macam mikroorganisme (bakteri) dikenal sebagai biakan
campuran. Jika hanya terdiri dari dua jenis mikroorganisme, yang dengan
sengaja dipelihara satu sama lain dalam asosiasi, dikenal sebagai biakan dua
jenis.

2.2 Tinjauan Umum Kultivasi dan Inokulasi Bakteri

Kultivasi adalah proses pemeliharaan mikroba. Melakukan kultivasi
adalah menumbuhkan bakteri dalam biakan murni. Untuk berhasilnya
kultivasi berbagai tipe bakteri diperlukan suatu kombinasi nutrien serta
lingkungan fisik yang sesuai. Kondisi fisik yang dibutuhkan untuk
pertumbuhan meliputi : suhu, atmosfer gas, dan keasaman atau kebasaan.
 Metode kultivasi merupakan metode untuk melipatgandakan jumlah mikroba
dengan membiarkan mereka berkembang biak dalam media biakan yang telah
disiapkan dibawah kondisi laboratorium terkendali. Metode ini biasa
digunakan untuk mengidentifikasi jenis mikroba dan peran yang
ditimbulkannya. Penanaman bakteri atau biasa disebut juga inokulasi adalah
pekerjaan memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium yang
baru dengan tingkat ketelitian yang sangat tinggi. Untuk melakukan
penanaman bakteri (inokulasi) terlebih dahulu diusahakan agar semua alat
yang ada dalam hubungannya dengan medium agar tetap steril, hal ini agar
menghindari terjadinya kontaminasi (Dwijoseputro, 1998). Teknik inokulasi
ada menggunakan metode gores, metode tebar, metode tuang dan metode
tusuk.

2.3 Tinjauan Umum Medium Pembiakkan Mikroba

Medium pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri
atas campuran nutrisi (nutrient) yang digunakan oleh suatu mikroorganisme
untuk tumbuh dan berkembangbiak pada media tersebut. Mikroorganisme
memanfaatkan nutrisi pada media berupa molekul-molekul kecil yang dirakit
untuk menyusun komponen sel-nya. Medium berfungsi untuk menumbuhkan
mikroba, isolasi, memperbanyak jumlah, menguji sifat-sifat fisiologi dan
perhitungan jumlah mikroba, dimana dalam proses pembuatannya harus
disterilisasi dan menerapkan metode aseptis untuk menghindari kontaminasi
pada media.

2.3.1 Medium Padat (Nutrient Agar)

Nutrien Agar (NA) adalah medium umum untuk uji air dan produk
dairy. NA juga digunakan untuk pertumbuhan mayoritas dari
mikroorganisme yang tidak selektif (mikroorganisme heterotrof). NA
merupakan salah satu media yang umum digunakan dalam prosedur
bakteriologi seperti uji biasa dari air, produk pangan, untuk membawa
 stok kultur, untuk pertumbuhan sampel pada uji bakteri, dan untuk
mengisolasi organisme dalam kultur murni.

2.3.2 Medium Cair (Nutrient Broth)

Nutrient Broth (NB) adalah medium yang berbentuk cair dengan
bahan dasar adalah ekstrak beef dan peptone. Medium Nutrient Broth
(NB) merupakan medium yang berwarna coklat yang memiliki
konsistensi yang cair dimana medium ini berasal dari sintetik dan
memiliki kegunaan sebagai medium untuk menumbuhkan bakteri sama
seperti medium NA.

2.4 Tinjauan Umum Sumber Isolat Mikroba

2.4.1 Sedimen Danau

2.4.2 Air Laut

2.5 Macam-Macam Teknik Kultivasi dan Inokulasi Bakteri

Untuk berhasilnya kultivasi mikroba diperlukan suatu kombinasi nutrisi
serta lingkungan fisik yang sesuai. Ada 5 parameter lingkungan yang utama
yang perlu diperhatikan dalam menumbuhkan mikroba yaitu temperatur,
kelembaban (RH), kadar oksigen, pH dan osmosis.
Mikroba yang hidup di alam terdapat sebagai populasi campuran dari
bebagai jenis mikrobia yang berbeda prinsip dari isolasi mikrobia dalam
memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lainnya dari lingkungannya
dialam dan ditumbuhkan dalam medium buatan. Pertumbuhan mikroba dapat
dilakukan dalam medium padat, karena dalam medium padat sel-sel mikroba
akan terbentuk suatu koloni sel yang tetap pada tempatnya, ada beberapa
teknik isolasi mikroba yakni (Wati, 2013):
Teknik Penggoresan (Streak Plate)
 Gambar . Jenis-Jenis Goresan Teknik Streak Plate
(Sumber : )

Teknik Penanaman dengan teknik goresan (streak) bertujuan untuk

mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau meremajakan kultur
ke dalam medium baru. Ada beberapa teknik goresan yang biasa dipakai
yaitu goresan sinambung, goresan T, dan goresan kuadran (streak
quadrant).
Teknik Taburan (Pour Plate)

Gambar . Teknik Pour Plate

(Sumber : )

Teknik ini memerlukan agar yang belum padat (>45oC) untuk

dituang bersama suspensi bakteri ke dalam cawan petri lalu kemudian
dihomogenkan dan dibiarkan memadat. Hal ini akan menyebarkan sel-sel
bakteri tidak hanya pada permukaan agar saja melainkan sel terendam agar
(di dalam agar) sehingga terdapat sel yang tumbuh dipermukaan agar yang
kaya O2 dan ada yang tumbuh di dalam agar yang tidak banyak begitu
banyak mengandung oksigen. Pada teknik pour plate diteteskan bakteri
sebanyak 1 ml membutuhkan ruang yang lebih luas untuk penyebarannya
sehingga diberikan lebih banyak dari pada spread plate.
Teknik Sebar (Spread Plate)
 Gambar . Teknik Spread Plate
(Sumber : )
Spread plate adalah teknik menanam dengan menyebarkan
suspensi bakteri di permukaan agar diperoleh kultur murni. Pada teknik
spread plate hanya diteteskan bakteri sebanyak 0,1 ml, karena spread plate
ditujukan untuk menumbuhkan dipermukaanya saja.
Teknik Pengenceran (Dilution Method)
Suatu sampel dari suatu suspensi yang berupa campuran
bermacam- macam spesies diencerkan dalam suatu tabung yang tersendiri.
Dari hasil pengenceran ini kemudian di ambil kira- kira 1 mL untuk
diencerkan lebih lanjut. Jika dari pengenceran yang ketiga ini diambil 0,1
mL untuk disebarkan pada suatu medium padat, kemungkinan besar kita
akan mendapatkan beberapa koloni yang akan tumbuh dalam mdium
tersebut.
Teknik Micromanipulator
Mengambil satu bakteri dengan mikropipet yang ditempatkan
dalam mikro manupulator, kemudian ditempatkan dalam
mikromanupulator. Kemudian ditempatkan dalam medium encer untuk
dibiakkan.
 BAB III
METODOLOGI PRAKTIKUM

3.1 Waktu dan Tempat Pelaksanaan Praktikum

Praktikum Mikrobiologi Laut ini dilaksanakan hari Jumat tanggal 11
November pada pukul 08.00 sampai 10.00. Bertempat di Laboratorium
Bioteknologi Kelautan, Lantai 3, Gedung 4, UNPAD.

3.2 Alat dan Bahan

Dalam pelaksanaan praktikum ini digunakan alat dan bahan sebagai
berikut :
3.2.1 Teknik Pengenceran Suspensi Bakteri
No. Nama Alat Fungsi
Mortar
Untuk menggerus atau menghaluskan
1 Keramik dan
suatu zat.
Penumbuk
Sebagai wadah untuk mereaksikan dua
Tabung
2 atau lebih larutan, sebagai wadah
Reaksi
pengembanagan mikroba.
Rak Tabung
3 Sebagai tempat menyimpan tabung reaksi.
Reaksi
 Pipet Untuk memindahkan larutan dengan
4
Volumetrik volume tertentu secara teliti.
Untuk mengaduk senyawa kimia yang ada
5 Vortex
dalam tabung reaksi atau wadah.
Untuk memanaskan medium, mensterilkan
jarum inokulasi dan alat-alat yang terbuat
6 Bunsen
dari platina dan nikrom seperti jarum
platina dan ose.
Untuk mensterilkan alat dan bahan dengan
7 Autoclave menggunakan uap air panas bertekanan
tinggi.
Tabel 1. Alat Alat Praktikum Teknik Pengenceran Suspensi Bakteri

No. Nama Bahan Fungsi

Sumber
Berperan sebagai bakteri yang ingin
1 Isolat/Sampel
dibiakkan.
Lingkungan
NaCl
2 Fisiologis/Air Sebagai larutan untuk pengenceran.
Laut
3 Spiritus Sebagai bahan bakar bunsen.
4 Kapas Untuk menutup lubang pada tabung reaksi.
5 Kasa Untuk menutup lubang pada tabung reaksi.
6 Tissue Untuk membersihkan alat.
Plastik Tahan Untuk membungkus alat dan bahan yang
7
Panas akan disterilisasi dengan autoclave.
8 Karet Gelang Untuk mengikat bahan setelah dipakai.
9 Kertas Label Untuk memberi tanda pada wadah sampel.
Tabel 2. Bahan-Bahan Praktikum Teknik Pengenceran Suspensi
Bakteri
3.2.2 Isolasi Bakteri (Solid and Liquid Medium)
No. Nama Alat Fungsi
Cawan Petri Sebagai wadah penyimpanan dan
1
Steril pembuatan kultur media.
Untuk menampung larutan, untuk kultivasi
Erlenmeyer
2 mikroba dalam bentuk cair, untuk
Steril
menghomogenkan bahan kompoisi media.
Untuk memindahkan atau mengambil
3 Jarum Ose koloni suatu mikrobia ke media yang akan
digunakan kembali.
Pipet Untuk memindhakan larutan dengan
4
Volumetrik volume tertentu secara teliti.
Untuk menyebarkan cairan di permukaan
5 L-Glass media agar bakteri yang tersuspensi dalam
cairan tersebut dengan merata.
Untuk memanaskan medium, mensterilkan
jarum inokulasi dan alat-alat yang terbuat
6 Bunsen
dari platina dan nikrom seperti jarum
platina dan ose.
Untuk mengaduk senyawa kimia yang ada
7 Vortex
dalam tabung reaksi atau wadah.
Untuk mengikubasi mikroba pada suhu
8 Inkubator
yang terkontrol
Untuk mengocok suatu campuran bahan
Shaking kimia yang memerlukan temperatur dan
9
Inkubator kecepatan konstan (dalam proses maserasi
dan inkubasi mikroba)
Untuk mensterilkan alat dan bahan dengan
10 Autoclave menggunakan uap air panas bertekanan
tinggi.
 Tabel 3. Alat Alat Praktikum Isolasi Bakteri (Solid and Liquid
Medium)

No. Nama Bahan Fungsi

Medium
Nutrient Agar
1 (NA) [+Bahan Sebagai tempat mikroba tumbuh.
tambahan}
Steril
Medium
Nutrient Broth
2 (NB) [+Bahan Sebagai tempat mikroba tumbuh.
tambahan}
Steril
Seri
3 Pengenceran Untuk mengurangi kepadatan bakteri.
10-6
4 Tissue Untuk membersihkan alat.
5 Plastik Wrap Untuk membungkus cawan petri.
Tabel 4. Bahan-Bahan Praktikum Isolasi Bakteri (Solid and Liquid
Medium)

3.3 Prosedur Kerja

3.3.1 Teknik Pengenceran Suspensi Bakteri

Dimasukkan NaCl Fisiologis/Air Laut ke dalam masing-masing

tabung reaksi dengan ketentuan sebagai berikut : satu tabung
pertama diisi dengan 10 mL NaCl Fisiologis/Air Laut dan enam
tabung berikutnya masing-masing diisi dengan 9 mL NaCl
Fisiologis/Air Laut
 Disterilisasi seri tabung pengenceran di atas beserta mortar
keramik dan penumbuknya serta pipet volumetrik ke dalam
autoclave

Digerus sumber isolat/sampel lingkungan dengan bantuan

NaCl Fisiologis/ Air laut steril di atas mortar keramik steril.

Ditimbang 1 (satu) gram sampel (di atas alumunium foil),

kemudian masukkan ke dalam tabung I, vortex sebentar agar
suspense homogen

Diambil sebanyak 1 mL suspensi dari tabung I dengan pipet

volumetrik steril, kemudian dimasukkan ke dalam tabung II,
divortex sebentar agar suspense homogen.

Dilakukan langkah no. 5 untuk tabung III, IV, V, VI, dan VII.

3.3.2 Isolasi Bakteri L-Glass Spread (Solid Medium)

Dituangkan medium Nutrient Agar (NA) yang telah mencair

(dipanaskan/dicairkan terlebih dahulu di atas hot plate) sebanyak 20
mL ke dalam cawan petri steril, diratakan.
 Didiamkan dan dibiarkan memadat di dekat bunsen.

Dituangkan sebanyak 500 L suspense dari tabung

pengenceran ke VII ke atas plate agar yang sudah padat,
diratakan dengan L-Glass di dekat bunsen.

Diseal cawan petri dengn plastik wrap.

Diinkubasi dengan posisi terbalik di dalam

inkubator (10/25/60 0C) selama 24 48 jam.

Diamati dan dihitung koloni yang tumbuh

3.3.3 Isolasi Bakteri Ose-Wire Streake (Solid Medium)

Dibuatlah peta kuadran di balik cawan petri dengan spidol

marker.

Dituangkan medium Nutrient Agar (NA) yang telah

mencair (dipanaskan/dicairkan terlebih dahulu di atas hot
plate) sebanyak 20 mL ke dalam cawan petri steril,
diratakan.
 Didiamkan dan dibiarkan memadat di dekat bunsen

Dengan jarum ose, diambil 1 loop suspense dari tabung

pengenceran ke VII, digoreskan ke atas Agar Plate di daerah
sektor 0

Dipijarkan jarum ose dan biarkan dingin. Digoreskan jarum

ose pada sektor 0 disusul gerakan ke tepi luar sektor 1 lalu
kembali ke sektor 0. Dilakukan bolak-balik sebanyak 3 kali.
Kemudian diselesaikan penggoresan di sektor I tanpa
disentuh sektor 0 kembali hingga seluruh permukaan sektor I
penuh goresan yang tidak bertumpang tindih.

Diputar cawan petri hingga sektor I berada di

sebelah kiri anda. Diulangi kegiatan 5 untuk
sektor II dan III. (jangan lupa jarum ose
dipijarkan kembali setiap akan berpindah sektor).

Diseal cawan petri dengn plastik wrap.

Diinkubasi dengan posisi terbalik di dalam inkubator

(10/25/60 0C) selama 24 48 jam.
 Diamati dan dihitung koloni yang tumbuh

3.3.4 Isolasi Bakteri Kultur Cair ( Liquid Medium)

Diambil sebanyak 1 mL suspense bakteri dari tabung

pengenceran ke VII dengan menggunakan pipet volumetrik steril,
dituangkan ke dalam 100 mL medium NB (Cair).

Digoyangkan secara perlahan agar suspense bercampur

Diinkubasi pada inkubator (10/25/60 0C) dengan shaking 150 rpm

selama 24 48 jam.

Diamati kekeruhan medium (sebagai indikator tumbuhnya bakteri)

dan dihitung densitasnya dengan spektofotometri pada panjang
gelombang 600 nm.
 DAFTAR PUSTAKA

Anonim.2014.Media Mikrobiologi.Diakses dari

http://www.kimia.clas.web.id/2014/11/materi-praktikum-mikrobiologi-
media.html pada tanggal 5 November 2016 pukul 20.30 WIB.
Bestria Ruth.2013.Praktikum Mikrobiologi Laut Teknik Isolasi Bakteri. Diakses
dari
https://www.academia.edu/8740785/PRAKTIKUM_MIKROBIOLO
GI_LAUT-_Teknik_Isolasi_Bakteri pada tanggal 5 November 2016
pukul 21.15 WIB.
Dwijoseputro, D. 1994. Dasar-dasar Mikrobiologi. Djambatan, Jakarta.
Hadioetomo, R.1993.Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium
Mikrobiologi.Gramedia, Jakarta.
Suriawiria, U. 2005.Mikrobiologi Dasar.Papas Sinar Sinanti, Jakarta.