Modul Mikrobiologi PDF

1
PENUNTUN PRAKTIKUM
MIKROBIOLOGI DASAR
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI
JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN
FAKULTAS TEKNIK
UNIVERSITAS BINA NUSANTARA
2016
Penuntun Praktikum Mikrobiologi Dasar

Food Technology – Bina Nusantara University
2
DAFTAR ISI
Bab I : Pengenalan Laboratorium Mikrobiologi ......................................... 3

Bab II : Mikroskop ...................................................................................... 14
Bab III : Persiapan Media ............................................................................. 21
Bab IV : Pengenceran dan Enumerasi .......................................................... 26
Bab V : Pengecatan Bakteri ......................................................................... 37
Bab VI : Deteksi dan Identifikasi Bakteri ...................................................... 43
Bab VII : Deteksi dan Identifikasi Jamur (Fungi) ........................................... 51

3
BAB I
PENGENALAN LABORATORIUM MIKROBIOLOGI
I. Tata Tertib Laboratorium Mikrobiologi Dasar

1. Letakkan tas dan benda-benda pribadi yang tidak diperlukan pada tempat yang
telah disediakan.
2. Dilarang makan, minum, dan merokok dalam laboratorium.
3. Kenakan jas laboratorium dengan baik dan benar selama bekerja di
laboratorium.
4. Dilarang menggunakan jas laboratorium jika tidak berada pada ruang
laboratorium.
5. Memahami dan mengenal peralatan laboratorium dengan baik sebelum
menggunakannya. Jika akan menggunakan peralatan yang belum diketahui,
tanyakan petunjuk atau cara penggunaannya kepada petugas laboratorium.
6. Bersihkan meja kerja dengan menggunakan desinfektan (Detol, alkohol 70%,
atau 200 ppm klorin) sebelum dan sesudah bekerja.
7. Cucilah tangan dengan air mengalir dan sabun sebelum dan sesudah bekerja di
laboratorium.
8. Dilarang memipet dengan mulut dan jangan sampai sampel masuk ke dalam
mulut.
9. Selama bekerja di laboratorium, jangan menyentuh (jauhkan tangan dari)
mulut, kuping, hidung, mata, ataupun muka.
10. Alat-alat yang telah terkontaminasi diletakkan pada tempat yang telah
tersedia.
11. Buanglah sampah atau sisa sampel pada tempat yang telah disediakan.
12. Dilarang membuang suspensi sel dan media ke bak pencuci.
13. Dilarang membawa keluar biakan mikroorganisme apapun dari ruang
laboratorium.
14. Usahakan agar mikroorganisme yang sedang ditangani tidak tercecer atau
tercampur dengan mikroorganisme lainnya.
15. Bila biakan yang sedang dikerjakan tercecer di meja atau lantai, tuangkan
desinfektan ke atasnya dan dibersihkan dengan kertas tissue, lalu buang ke
tempat yang telah disediakan.
16. Kembalikan alat-alat yang telah digunakan ke tempat semula.

4
II. Peralatan Laboratorium Mikrobiologi Dasar

Peralatan yang terdapat pada laboratorium Mikrobiologi Dasar meliputi peralatan
untuk preparasi, analisa, dan penyimpanan mikroba.
No. Gambar Nama alat Fungsi
1. Cawan petri Untuk membiakkan
(petri dish) mikroorganisme atau kultur sel.
2. Ose Untuk memindahkan,

(inoculating mengambil, atau
loop) menginokulasikan biakan
mikroorganisme.
3. Tabung Tempat menyimpan atau

reaksi menumbuhkan biakan
mikroorganisme.
4. Pinggan Tempat untuk mereaksikan zat

tetes dalam jumlah kecil. Pengamatan
hasil reaksi diamati secara
kualitatif, contoh : perubahan
warna, terbentuknya
gelembung.
5. Mikro pipet Untuk memipet larutan atau
dan tip suspensi biakan mikroorganisme
dengan volume yang terukur.
6. Object glass Untuk menaruh preparat yang

dan cover akan diamati melalui mikroskop.
glass
7. Mikroskop Untuk mengamati objek

cahaya berukuran renik, seperti sel
mikroorganisme, dengan
berbagai macam perbesaran
bayangan.

5
8. Mikroskop Untuk mengamati objek yang

stereo memiliki ukuran lebih besar
dibandingkan objek yang dapat
diamati oleh mikroskop cahaya.
Bayangan yang dihasilkan
bersifat tiga dimensi.
9. Bunsen Sumber panas untuk

burner memanaskan bahan, media,
(gas dan mensterilkan ose, dan membuat
spiritus) kondisi steril di sekitar tempat
bekerja.
10. Termometer Untuk mengukur suhu bahan,
media, atau lingkungan.
11. Autoklaf Untuk mensterilkan media, alat

sebelum digunakan, serta alat
yang telah digunakan. Sterilisasi
pada autoklaf bersifat sterilisasi
basah yang menggunakan uap
panas. Umunya sterilisasi
dilakukan pada suhu 121oC dan
tekanan 1 atm selama 15 menit.
12. Oven Untuk mensterilkan alat dengan
cara sterilisasi kering, serta
untuk mengeringkan alat.
13. Colony Untuk menghitung koloni

counter mikroba yang tumbuh pada
media agar cawan. Perhitungan
dilakukan dengan menggunakan
sebuah pen yang akan menunjuk
setiap koloni yang tampak. Hasil
perhitungan tersebut akan
tampak pada layar display.

6
14. Laminar air Tempat untuk melakukan

flow pekerjaan aseptik. Alat ini
dilengkapi dengan blower dan
filter yang berfungsi untuk
mengatur dan menyaring aliran
udara sehingga menjadi area
bekerja di dalam laminar steril.
Terdapat aplikasi sinar UV yang
dinyalakan beberapa jam
sebelum dan setelah digunakan.
15. Inkubator Tempat untuk menginkubasi
mikroba dengan menyediakan
kondisi suhu lingkungan yang
terkontrol untuk
mengembangbiakkan atau
mendukung pertumbuhan
mikroba. Pada bagian luar dari
alat ini dilengkapi dengan
penunjuk suhu yang dapat diatur
sesuai kebutuhan masing-masing
jenis mikroba. Bagian dalamnya
terdapat rak yang berfungsi
sebagai tempat penyimpanan
mikroorganisme yang akan
diinkubasi.
16. Laboratory Wadah untuk menyimpan media
bottle mikroba atau sampel cair.
Laboratory bottle tersedia dalam
berbagai ukuran dan dapat
disterilisasi.
17. Tabung Untuk uji kualitatif mikroba yang

Durham mengasilkan gas. Hasil positif
ditunjukkan dengan adanya
gelembung gas yang terbentuk
di dalam tabung Durham.

7
18. Stomacher Untuk menghancurkan sampel

sebelum diuji. Sampel dan
larutan pengencer ditempatkan
di dalam plastik khusus
stomacher. Terdapat dua pedal
yang bergerak bergantian untuk
menghancurkan sampel di dalam
plastik. Kecepatan gerakan pedal
dapat diatur melalui tuas control
yang terdapat pada stomacher.
III. Sterilisasi
Sterilisasi dalam mikrobiologi merupakan proses destruksi atau penghilangan
mikroba yang hidup. Objek yang sudah terbebas dari kehidupan mikroba disebut
steril. Sterilisasi merupakan salah satu cara untuk mematikan seluruh mikroba,
sehingga objek menjadi steril, sedangkan cara yang lain hanya menghambat
pertumbuhan mikroba. Mikroba yang digunakan sebagai indikator dalam proses
sterilisasi adalah mikroba yang paling tahan dengan asumsi apabila mikroba yang
paling tahan tersebut sudah terbunuh, maka mikroba lain yang kurang tahan sudah
mati. Umumnya, indikator dalam proses sterilisasi adalah endospora bakteri Bacillus
dan Clostridium. Endospora merupakan bentuk kehidupan yang paling resisten
terhadap panas, pengeringan, starvasi, degradasi enzim, bahan kimia toksik, dan
radiasi. Oleh karena itu, parameter fisik untuk prosedur sterilisasi dirancang secara
spesifik untuk membunuh seluruh endospora bakteri.
Sterilisasi merupakan hal yang penting dalam laboratorium mikrobiologi
karena pada umumnya percobaan dilakukan dengan menggunakan kultur murni yang
membutuhkan media nutrien serta tempat pertumbuhan yang steril, termasuk
peralatan yang terkait. Oleh karena itu, sebelum digunakan, alat dan media yang
digunakan harus disterilkan terlebih dahulu untuk mencegah terjadinya kontaminasi
atau tumbuhnya mikroba kontaminan yang dapat menyebabkan penyimpangan hasil
percobaan. Terdapat tiga macam sterilisasi, yaitu:
1. Sterilisasi dengan panas
a. Sterilisasi panas kering
Sterilisasi ini digunakan untuk sterilisasi alat gelas, cawan petri, dan pipet. Alat
yang akan disterilkan dibungkus dengan kertas atau dimasukkan dalam kaleng
yang tahan panas. Sterilisasi kering baik digunakan untuk alat gelas karena
tidak menyebabkan adanya kondensasi uap air dalam alat gelas tesebut. Alat
yang digunakan untuk steriliasi kering adalah oven. Waktu untuk sterilisasi
tergantung pada suhu yang digunakan.
Suhu Waktu*
170oC 1 jam
160oC 2 jam
150oC 2.5 jam
140oC 3 jam
*waktu terhitung saat suhu tercapai

8
b. Sterilisasi dengan api langsung (direct flame)

Metode ini digunakan untuk sterilisasi ose, forceps, dan mulut tabung atau
laboratory bottle reaksi saat memindahkan kultur secara aspetis. Sterilisasi
ini dilakukan dengan membakar langsung objek yang akan disterilkan
dengan nyala api.
c. Sterilisasi dengan uap panas (sterilisasi basah)
Steriliasi ini digunakan untuk mensterilisasi media, larutan, kapas, lap, dan
sebagainya. Sterilisasi ini menggunakan uap panas jenuh dengan peralatan
yang umum digunakan, yaitu autoklaf (autoclave). Autoklaf merupakan
ketel yang dipenuhi dengan uap bertekanan. Suhu atau tekanan yang
digunakan untuk sterilisasi basah adalah 15 psi atau 121oC selama 15
menit. Untuk bahan yang tidak tahan panas misalnya medium skim milk
dapat dilakukan pada suhu 110oC selama 10 menit.
2. Sterilisasi tanpa panas (filtrasi)

Metode ini digunakan untuk sterilisasi cairan yang sensitif terhadap panas,
misalnya vitamin dan antibiotik.
PENGENALAN CARA-CARA STERILISASI

Tujuan : mengetahui cara-cara sterilisasi dengan autoklaf, oven, dan penyaringan
Alat:
 Autoklaf
 Oven
 Pipet
 Cawan petri
 Pinset (forceps)
Bahan:
 Media NB
 Larutan pengencer

9
Cara kerja:
a. Sterilisasi dengan autoklaf
1. Isi autoklaf dengan air sampai dekat angsang (dasar yang berlubang tempat
meletakkan bahan yang disterilkan).
2. Masukkan bahan-bahan yang akan disterilkan (media NB ke dalam
laboratory bottle dan larutan pengencer ke dalam tabung reaksi). Media
yang disterilkan dalam erlenmeyer atau tabung reaksi tanpa tutup harus
ditutup rapat dengan kapas dan alumunium foil.
3. Tutup autoklaf dan kencangkan ulir penutupnya.
4. Tekan ON untuk menyalakan autoklaf.
5. Buka kran pengeluaran uap air.
6. Stel waktu yang diinginkan untuk sterilisasi (15 menit).
7. Tekan tombol sterilisasi untuk memulai sterilisasi.
8. Jika uap air sudah mulai keluar, tutuplah kran pengeluaran uap air.
Tekanan uap dalam autoklaf akan dan suhunya akan mencapai 121oC.
9. Jika waktu sterilisasi sudah tercapai (15 menit), tekanan dalam autoklaf
akan turun perlahan. Tunggu sampai tekanan menunjukkan angka nol atau
tunggu sampai agak dingin.
10. Buka autoklaf hati-hati dan keluarkan bahan yang telah disterilkan
tersebut. Gunakan autoclave gloves saat mengambil bahan dari dalam
autoklaf. Simpan dan pisahkan tempatnya dengan bahan-bahan yang
belum disterilkan.
b. Sterilisasi dengan oven

1. Alat-alat yang terbuat dari kaca, misalnya erlenmeyer, tabung reaksi, pipet,
dan cawan petri sebelum dipakai perlu disterilkan dengan oven.
2. Tutuplah erat-erat erlenmeyer dan tabung reaksi dengan kapas. Pipet
dikelompokkan menurut volumenya dan dimasukkan ke dalam wadah yang
tersedia atau dibungkus dengan kertas atau alumunium foil. Demikian pula
untuk cawan petri.
3. Masukkan ke dalam oven.
4. Tutup oven dengan baik.
5. Atur tombol pengatur waktu dan suhu sesuai dengan tujuan sterilisasi
(170-180oC) selama 2 jam.
6. Setelah sterilisasi, tunggu sampai suhu dalam oven mendekati suhu ruang,
kemudian bukalah oven dengan hati-hati.
7. Keluarkan alat-alat yang sudah steril dan pisahkan tempatnya dengan alat-
alat lain yang belum steril.
IV. Metode Aseptik

Selama bekerja dengan mikroba diperlukan area kerja yang terjaga
kebersihannya. Hal tersebut dapat dilakukan dengan usaha membersihkan area
kerja terlebih dahulu sebelum digunakan untuk bekerja. Larutan disinfektan atau
alkohol umumnya digunakan untuk membersihkan area kerja. Pembersihan area
kerja ini dapat mencegah kontaminasi mikroba dari lingkungan yang dapat

10
mencemari hasil pekerjaan atau biakan murni yang digunakan. Umumnya,

pekerjaan yang melibatkan mikroba dan memilki potensi bahaya biologis dilakukan
di dalam laminar air flow atau BSC (biological safety cabinet). Penggunaan nyala
api Bunsen juga digunakan saat bekerja untuk mensterilkan alat seperti ose, spatel
drygalski, dan mulut tabung , serta menciptakan area kerja yang steril.
Gambar 1. Selama bekerja dengan teknik aseptik, bunsen burner

harus tetap menyala di sekitar area kerja untuk menciptakan area
kerja yang steril
Selain kondisi area kerja, teknik bekerja secara aseptik perlu diterapkan selama
bekerja dengan mikroba. Teknik bekerja secara aseptik dapat melindungi personel
dari infeksi diri yang berasal dari pencemaran di dalam laboratorium serta dapat
mencegah tercemarnya hasil pekerjaan atau biakan murni. Teknik aseptik harus
dikuasasi dengan baik karena akan digunakan dalam sebagian besar kegiatan di
dalam laboratorium mikrobiologi.
METODE ASEPTIK
Tujuan : memindahkan sel mikroba atau kultur secara aseptik
ALAT :
 Ose loop
 Bunsen spiritus
BAHAN :
 Kultur bakteri dalam media MRSB
 Kultur bakteri dalam media agar miring MRSA
 Media MRSB

11
 Media agar miring MRSA

 Media agar cawan MRSA
CARA KERJA:
a. Memindahkan kultur dari tabung ke tabung
1. Siapkan tabung reaksi dan ose yang akan digunakan pada rak.
2. Pegang ose seperti saat memegang pensil.
3. Pijarkan ose di atas api spiritus sampai merah membara.
Gambar 2. Cara sterilisasi inoculating loop

atau ose sebelum digunakan
4. Biarkan ose dingin sebelum menyentuh kultur yang akan dipindah.

5. Buka tutup kapas pada tabung reaksi tempat kultur yang akan dipindah
dengan jari kelingking.
6. Bakar mulut tabung dengan api spiritus, kemudian masukkan ose dan ambil
satu ose kultur yang tumbuh di tabung berisi media MRSB.
7. Bakar mulut tabung sekali lagi lalu tutup, kemudian letakkan kembali ke rak
tabung reaksi.
8. Ambil tabung yang baru, buka tutupnya dan bakar mulutnya di atas api,
masukkan ose yang berisi kultur dan inokulasikan pada tabung yang berisi
media MRSB baru.
9. Lakukan juga pemindahan kultur ke dalam tabung yang berisi agar miring
MRSA dengan cara menggoreskan ose yang berisi kultur ke permukaan
agar miring MRSAdi dalam tabung dengan membentuk pola zig zag.
10. Bakar kembali mulut tabung, tutup, dan letakkan kembali.
11. Panaskan ose setelah selesai dipakai atau sebelum diletakkan kembali.

12
12. Untuk yang sudah mahir, dua tabung reaksi bisa langsung dipegang
sekaligus
13. Inkubasikan tabung reaksi yang sudah diinokulasi pada inkubator.
Gambar 3. Cara memindahkan kultur dari tabung

ke tabung
b. Memindahkan kultur dari tabung reaksi ke cawan petri

1. Pijarkan ose di atas lampu spiritus sampai merah membara.
2. Biarkan ose dingin sebelum menyentuh kultur yang akan dipindah.
3. Bakar mulut tabung dengan lampu spiritus, kemudian masukkan ose dan
ambil satu ose kultur yang tumbuh di dalam tabung yang berisi media
MRSB.
4. Bakar mulut tabung sekali lagi dan tutup, selanjutnya diletakkan kembali
pada rak.
5. Buka cawan petri yang berisi media baru berupa MRSA dengan tangan kiri.
Arahkan bukaan cawan petri menghadap nyala api spiritus.
6. Goreskan ose pada media agar dan tutup kembali cawan petri.

13
7. Inkubasikan cawan petri pada inkubator. Posisikan cawan petri dalam

keadaan terbalik selama masa inkubasi.
Gambar 4. Cara memindahkan kultur dari tabung reaksi ke

media agar pada cawan petri

14
BAB II
MIKROSKOP
Mikroskop merupakan alat utama dalam mempelajari mikrobiologi. Mikroskop

digunakan untuk melihat makhluk hidup yang sangat kecil ukurannya, yang tidak
dapat dilihat langsung dengan mata. Mekanisme kerja mikroskop berdasarkan 2
sistem yaitu sistem optikal atau system pembesaran dan sistem iluminasi .
Berdasarkan sumber cahayanya, mikroskop dibedakan menjadi mikroskop cahaya
dan mikroskop elektron. Sedangkan berdasarkan kenampakan objek yang diamati, ada
2 jenis mikroskop yaitu mikroskop dua dimensi (mikroskop cahaya) dan mikroskop tiga
dimensi (mikroskop stereo).
Mikroskop cahaya
Mikroskop cahaya dikenal juga dengan

nama “Compound light microscope” yaitu
mikroskop yang menggunakan cahaya lampu
sebagai pengganti cahaya matahari yang
biasanya digunakan pada mikroskop
konvensional. Pada mikroskop konvensional,
sumber cahayanya berasal dari sinar matahari
yang dipantulkan dengan suatu cermin datar
ataupun cekung yang terdapat di bawah
kondensor. Cermin ini akan mengarahkan
cahaya dari luar ke dalam kondensor.
Mikroskop cahaya terdiri dari 3 bagian utama
yaitu lensa objektif, lensa okuler dan
kondensor. Terdapat tempat dudukan lensa
Gambar 1. Mikroskop cahaya
objektif yang bisa dipasangi tiga jenis
perbesaran lensa atau lebih. Di bawah tabung mikroskop terdapat meja mikroskop
yang merupakan tempat preparat.
Lensa objektif adalah lensa yang terletak dekat dengan objek yang akan diamati
dan berfungsi untuk pembentukan bayangan pertama dan menentukan struktur serta
bagian renik yang akan terlihat pada bayangan akhir serta mempunyai kemampuan
untuk memperbesar bayangan objek sehingga dapat memiliki nilai “apertura”. Nilai
apertura (NA) merupakan ukuran daya pisah suatu lensa yang menunjukkan
kemampuan daya pisah lensa terhadap bayangan objek. Dengan kemampuan ini,
sebuah lensa mampu untuk menghasilkan bayangan objek yang berdekatan sebagai
dua benda yang terpisah.
Lensa okuler (eyepiece lens) berfungsi untuk memperbesar bayangan yang

dihasilkan oleh lensa objektif. Lensa ini terdapat di bagian ujung atas tabung
berdekatan dengan mata pengamat. Lensa okuler bisa berbentuk lensa tunggal

15
(monokuler) atau ganda (binokuler). Perbesaran oleh lensa okuler berkisar antara 4
hingga 25 kali.
Lensa kondensor berfungsi mendukung terciptanya pencahayaan pada objek yang

akan dilihat sehingga dengan pengaturan yang tepat maka akan diperoleh daya pisah
maksimal. Kondensor mengatur intensitas cahaya yang masuk ke dalam mikroskop.
Lensa kondensor mempunyai diafragma yang mengontrol cahaya yang masuk dan
yang meninggalkan kondensor. Diafragma juga berfungsi untuk menjamin agar sinar
yang meninggalkan kondensor memenuhi lensa objektif. Jika diafragma terlalu besar,
beberapa sinar tidak akan memenuhi seluruh lensa objektif dan menjadi tidak
berguna. Sebaliknya jika sinar terlalu terang, maka harus direduksi dengan cara
merubah posisi kondensor atau mengatur diafragma.
Pembesaran oleh mikroskop merupakan hasil dari dua sistem lensa yaitu lensa
objektif dan lensa okuler. Objek utama diperbesar oleh lensa objektif lalu bayangan
yang dihasilkan diubah pada lensa okuler sehingga terjadi pembesaran akhir yaitu
perbesaran yang dihitung melalui perkalian besarnya lensa objektif dan okuler.
Contoh:
Perbesaran objektif = 40x
Perbesaran okuler = 10x
Total perbesaran = 400x
Agar diperoleh berbagai tingkat perbesaran, setiap mikroskop biasanya dilengkapi

dengan 3 buah lensa objektif yang dipasang pada nosepiece yang dapat diputar, yaitu:
1. Lensa objektif berkekuatan rendah (low power, 16 mm), ditandai dengan angka
10x pada bagian luarnya dan mempunyai jarak kerja 5-8.3 mm
2. Lensa objektif berkekuatan tinggi (high dry, 4 mm), ditandai dengan angka 40x,
30x, 44x, atau 45x dan memmpunyai jarak kerja 0.46-0.72 mm.
3. Lensa objektif minyak imersi (immersion oil, 1.8 mm), ditandai dengan angka
95x, 97x, atau 100x dan mempunyai jarak kerja 0.13-0.14 mm.
Angka 16 mm, 4 mm dan 1.8 mm yang tertera pada masing-masing jenis lensa
objektif menunjukkan panjang fokal dari masing-masing lensa, yaitu jarak lensa
dengan titik fokal lensa (F1 dan F2). Semakin pendek jarak kerja lensa, diafragma akan
semakin terbuka. Lensa okuler yang banyak digunakan mempunyai perbesaran 10x
dan lensa objektif yang perbesarannya 10x, 40x dan 100x sehingga total perbesaran
dengan menggunakan lensa berkekuatan rendah adalah 100x, lensa berkekuatan
tinggi perbesarannya adalah 400x dan perbesaran dengan lensa minyak imersi adalah
1000x.

16
Gambar 2. Mikroskop cahaya beserta bagian-bagiannya

17
Gambar 3. Mikroskop stereo
Mikroskop Stereo
Mikroskop stereo digunakan untuk mengamati objek yang memiliki ukuran
lebih besar dibandingkan objek yang dapat diamati oleh mikroskop cahaya. Hasil
gambar yang dihasilkan bersifat tiga dimensi. Pada mikroskop stereo, cahaya tidak
dilewatkan menembus objek, namun dipantulkan kembali setelah mengenai objek
karena sumber cahaya yang terdapat pada mikroskop stereo terletak di atas objek dan
di bawah objek. Hal tersebut memungkinkan hasil bayangan tiga dimensi yang
dihasilkan dapat terlihat dengan jelas dari semua sisi objek. Mikroskop stereo memiliki
perbesaran objektif sekitar 10 kali hingga 40 kali.
Mikroskop Elektron
Terdapat dua jenis mikroskop elektron, yaitu mikroskop elektron scanning
(SEM) dan mikroskop elektron transmisi (TEM). Perbesaran mikroskop elektron
mencapai 2 juta kali. Pada mikroskop TEM, elektron dari electron gun ditembakkan
hingga menembus objek dan hasil bayangan yang diamati adalah hasil tembusan
tersebut. diperlukan sampel yang sangat tipis untuk dapat diamati pada mikroskop
electron TEM, yaitu dengan ketipisan sekitar 100 nm.
Sesuai dengan namanya, mirkoskop scanning electron (SEM) merupakan teknik
pengamatan terhadap permukaan dengan ketipisan objek sekitar 20 µm. Elektron

18
pantul yang dihasilkan dari permukaan objek ketika discan diperkuat sinyalnya. Besar
amplitude yang dihasilkan tampak sebagai gradasi gelap dan terang pada layar
monitor CRT (cathode ray tube).
Tujuan:
1. Menyebutkan nama dan fungsi bagian-bagian mikroskop

2. Menyiapkan preparat basah dan preparat kering untuk pengamatan dengan
mikroskop
3. Membedakan bakteri, jamur (fungi), dan yeast (khamir) dengan menggunakan
mikroskop cahaya
PEMBUATAN PREPARAT KERING

Alat:
 Bunsen
 Mikroskop cahaya
 Jarum ose
Bahan:
 Gelas objek  Kultur bakteri
 Gelas penutup  Kultur khamir
 Minyak imersi  Methylene blue
CARA KERJA:
1. Siapkan gelas objek.
2. Teteskan aquades steril ke permukaan gelas objek secukupnya.
3. Pijarkan ose jarum dengan menggunakan lampu spritus.
4. Ambil satu ose kultur bakteri atau khamir dengan menggunakan ose.
5. Oleskan pada gelas objek yang terdapat aquades teril di atasnya.
6. Lewatkan gelas objek di atas nyala api Bunsen untuk mengeringkan kultur agar
kultur dapat menempel pada gelas objek.
7. Teteskan pewarna methylene blue dan ratakan pada kultur pada permukaan
gelas objek. Tunggu selama 1 menit.
8. Bilas pewarna dengan cara membilasnya dengan aquades pada botol semprot.
9. Lewatkan kembali gelas objek di atas nyala api Bunsen untuk mengeringkan
bekas bilasan.
10. Nyalakan lampu mikroskop, dan aturlah sehingga jumlah sinar yang melalui
spesimen maksimal.
11. Gunakan lensa objektif berkekuatan rendah, turunkan tabung penyangga lensa
dengan menggunakan knop pengatur kasar (makrometer) sehingga jarak
antara lensa dan specimen kira-kira 0.5 cm. Spesimen dilihat melalui lubang
untuk mata (eyepiece).
12. Naikkan lensa objektif dengan hati-hati dengan menggunakan knop pengatur
kasar sehingga tepat fokus.
13. Gunakan knop pengatur halus (mikrometer) untuk menajamkan fokus.

19
14. Setelah spesimen tepat berada pada fokus, atur kaca dan diafragma iris
sehingga terlihat bayangan yang paling jelas. Jangan sekali-kali memegang
ujung lensa dengan tangan.
15. Geserlah gelas objek ke kanan atau ke kiri, ke depan atau ke belakang dengan
menggunakan knop penyangga specimen.
16. Amati preparat dengan menggunakan perbesaran lainnya (40x atau 100x).
Gunakan lensa berkekuatan tinggi (high dry) dengan cara memutar lensa
objektif.
Mengamati specimen dengan perbesaran kuat

1. Letakkan preparat pada mikroskop, berada tepat di bagian tengah di bawah
lensa mikroskop.
2. Nyalakan lampu mikroskop dan aturlah, sehingga jumlah sinar yang melalui
spesimen maksimal.
3. Putarlah lensa minyak imersi sehingga tepat di atas spesimen.
4. Teteskan minyak imersi di atas gelas penutup yang terletak di atas gelas objek
dan dengan melihat dari sisi samping, turunkan lensa perlahan-lahan sampai
menyentuh minyak namun tidak menyentuh objek.
5. Mula-mula gunakan pengatur halus (mikrometer) untuk menepatkan fokus.
Jangan menurunkan tabung penyangga lensa sewaktu melihat melalui eye
piece karena lensa dapat membentur gelas objek.
6. Gambarkan bentuk spesimen yang terlihat dan amati cara
pengelompokkannya (tunggal, berpasangan, tiga sel, empat sel, delapan sel,
rantai pendek, rantai panjang, bergerombol, dsb.).
PEMBUATAN PREPARAT BASAH

Alat:
 Bunsen
 Mikroskop cahaya
 Jarum ose
Bahan:
 Kultur jamur
 Tempe
 Lactophenol blue
CARA KERJA:
1. Teteskan larutan laktofenol di atas gelas objek.
2. Pijarkan jarum ose pada lampu spiritus kemudian ambilah pertumbuhan
kapang pada agar atau sampel tempe secara hati-hati dan letakkan di atas
gelas objek. Kapang diambil mulai dari pertumbuhan kapang di bawah agar
sampai miseliumnya. Usahakan jangan sampai ada yang rusak atau terputus-
putus.
3. Tutuplah dengan gelas penutup (cover glass). Pada waktu menutup, hindari
terbentuknya gelembung udara di antara gelas objek dan gelas penutup.

20
Bersihkan kelebihan larutan pada gelas objek dengan menghisap kelebihannya

dengan menggunakan tisu atau kertas hisap.
4. Letakkan preparat basah tersebut pada mikroskop, berada tepat di bagian
tengah di bawah lensa mikroskop.
5. Amati penampakan fungi mengunakan perbesaran 10x, 40x, dan 100x.
6. Gambarkan bentuk miselium (septet, nonseptat, bentuk cabang) dan bentuk
spora aseksual (konidia, sprorangiospora, arthospora).

21
BAB III
PERSIAPAN MEDIA
Mikroba memerlukan kondisi fisik dan kimia serta lingkungan yang sesuai untuk
pertumbuhannya. Kondisi fisik dapat berupa suhu dan struktur bahan, sedangkan
kondisi kimia pertumbuhan mikroba ditentukan oleh komponen yang menyusun
media pertumbuhannya seperti air, sumber karbon, sumber energi, sumber nitrogen,
mineral, maupun konsentrasi ion hidrogen (pH).
Terdapat 2 macam media yang digunakan untuk pertumbuhan mikroba, yaitu
media sintetik (defined media) dan media non-sintetik atau media kompleks. Media
sintetik adalah media yang dibuat dari bahan-bahan kimia dengan kemurnian yang
tinggi dan ditentukan dengan tepat serta komposisi kimianya diketahui dengan pasti,
contohnya media Plate Count Agar (PCA) dan nutrient agar (NA). Media ini dapat
diulangi pembuatannya kapan saja dan akan diperoleh hasil yang sama.
Media kompleks kaya akan nutrien yang mengandung berbagai macam nutrien dan
konsentrasinya tinggi, sedangkan media non-sintetik tidak diketahui komposisi
kimianya, contohnya adalah bahan-bahan yang terdapat dalam kaldu nutrient, seperti
ekstrak daging dan pepton. Kaldu nutrien merupakan media yang paling umum
digunakan, sehingga disebut juga sebagai media serbaguna.
Media yang mengandung zat-zat tertentu yang dapat menghambat pertumbuhan
satu kelompok bakteri atau lebih tanpa menghambat pertumbuhan organisme yang
diinginkan disebut media selektif atau media diferensial. Media ini mengandung zat
kimia tertentu yang memungkinkan pengamatan berbagai macam tipe bakteri
tertentu.
Bentuk media untuk pertumbuhan mikroba dapat berupa media cair, padat
maupun semi padat. Media cair biasanya disebut broth, berupa nutrient yang
dilarutkan dalam air. Pertumbuhan mikroba dalam media ini ditandai dengan adanya
kekeruhan. Media padat tersusun atas nutrient yang dilarutkan dalam air dan
ditambah dengan agen penjendal (gelling agent) yang dapat memadatkan media.
Mikroba diinokulasikan di permukaan media padat dan akan tumbuh membentuk
koloni. Media semi padat mirip dengan media cair hanya konsentrasi penjendalnya
lebih rendah, sehingga konsistensinya seperti jeli. Agar merupakan agen penjendal
yang paling banyak dipakai untuk membuat media pertumbuhan mikroba.
Larutan pengencer
Larutan pengencer digunakan sebagai media untuk mengencerkan contoh. Larutan
pengencer harus steril dan tidak menyebabkan hilangnya kemampuan tumbuh sel
mikroba. Larutan ini bersifat dapat menjaga keseimbangan ion mikroba. Larutan
pengencer yang umum digunakan adalah fosfat karena merupakan satu-satunya
komponen anorganik yang mempunyai sifat buffer pada kisaran pH sekitar normal,
yaitu kisaran pH yang dapat mempertahankan keseimbangan fisiologi mikroba. Fosfat

22
tidak bersifat racun dan merupakan sumber fosfor untuk pertumbuhan mikroba.
Garam fosfat yang sering digunakan sebagai buffer adalah kalium monohidrogen
fosfat (K2HPO4) atau kalium dihidrogen fosfat (KH2PO4). Larutan pengencer lainnya
yang sering digunakan adalah larutan garam fisiologi (0.85%) atau larutan Ringer dan
larutan pepton 0.1%. Larutan pengencer sebaiknya mempunyai sifat osmotik yang
sama dengan lingkungan mikroba, hal ini untuk mencegah terjadinya kerusakan sel.
Untuk mencegah terjadinya perbanyakan sel selama pelaksanaan pengenceran, dapat
digunakan larutan pengencer yang didinginkan.
Pembuatan media padat

ALAT:
 Erlenmeyer  Batang pengaduk
 Tabung reaksi  Hot plate
 Cawan petri steril  Magnetic stirrer
 Rak tabung reaksi  Autoklaf
 Pipet 5 ml  Laboratory bottle
BAHAN:
 Nutrient Broth (NB)  Potato Dextrose Agar (PDA)
 Plate Count Agar (PCA)  Kapas
CARA KERJA:
a. Pembuatan agar miring
1. Timbang sejumlah media (NB, PCA, atau PDA) sesuai dengan yang tertera pada
kemasan untuk volume agar yang akan dibuat.
2. Larutkan dengan menambahkan aquades sebanyak volume agar yang akan
dibuat.
3. Panaskan pada hot plate sambil diaduk dengan batang gelas atu magnetic
stirrer sampai semua agar larut dan tampak lebih bening (selama pemanasan
dijaga agar bagian bawah erlenmeyer atau gelas beaker tidak hangus).
4. Masukkan 5 ml media agar yang masih panas ke dalam tabung reaksi dengan
menggunakan pipet. Bilas pipet dengan air panas (>45oC) segera setelah
digunakan agar sisa media tidak menjendal di dalam pipet.
5. Sumbat tabung reaksi dengan kapas atau tutup dengan penutupnya.
6. Sterilkan tabung-tabung tersebut dalam autoklaf pada suhu 121oC selama 15
menit.
7. Setelah sterilisasi selesai, keluarkan tabung reaksi dari autoklaf dan letakkan
dalam posisi miring, dan biarkan sampai media agar menjadi padat.

23
b. Pembuatan agar tegak

1. Masukkan 10 ml media agar yang masih panas ke dalam tabung reaksi dengan
pipet.Bilas pipet dengan air panas (>45oC) segera setelah digunakan agar sisa
media tidak menjendal di dalam pipet.
2. Sumbat tabung reaksi dengan kapas.
3. Sterilkan tabung-tabung tersebut dalam autoklaf pada suhu 121oC selama 15
menit.
4. Dinginkan tabung reaksi dengan posisi tegak pada rak tabung.
Gambar 1. Media cair, agar miring, dan agar tegak

di dalam tabung reaksi
c. Pembuatan media agar dalam cawan petri

1. Timbang sejumlah media sesuai dengan yang tertera pada kemasan untuk
volume agar yang akan dibuat.
2. Larutkan dengan menambahkan aquades sebanyak volume agar yang akan
dibuat.
3. Panaskan pada hot plate sambil diaduk dengan batang gelas atu magnetic
stirrer sampai semua agar larut (selama pemanasan dijaga agar bagian bawah
erlenmeyer atau gelas beaker tidak hangus).
4. Setelah semua agar larut, sumbat erlenmeyer dengan kapas
5. Sterilisasi Erlenmeyer atau laboratory bottle yang berisi media tersebut dalam
autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit.
6. Keluarkan Erlenmeyer atau laboratory bottle dari autoklaf dan goyang-
goyangkan sedikit agar isinya tercampur dengan baik.
7. Tuang media agar dengan suhu sekitar 40-45oC ke dalam cawan petri secara
aseptik, yaitu:
a. Pegang leher Erlenmeyer atau laboratory bottle dengan tangan kanan.
b. Cabutlah kapas penyumbat dan sterilkan bibir Erlenmeyer dengan nyala
api Bunsen.
c. Bukalah tutup cawan petri steril dengan tangan kiri dan tuangkan
media ke dalamnya sampai dua pertiga tinggi dasar cawan petri

24
tertutup media. Peganglah tutup cawan petri sehingga menutup

sebagian cawan yang sedang diisi. Hal ini untuk menhindari jatuhunya
partikel debu ke dalam cawan dan mengurangi kontaminasi media yang
sudah steril.
d. Tutuplah cawan petri dengan segera.
e. Sterilkan bibir cawan petri dengan nyala api Bunsen.
f. Ratakan dengan menggoyang cawan pada meja membentuk pola angka
‘8’.
g. Sterilkan kembali bibir Erlenmeyer dengan nyala api bunsen dan
tuangkan medium ke dalam cawan petri yang lain.
8. Cawan-cawan yang telah berisi media dibiarkan hingga media menjadi padat.
9. Simpan cawan-cawan petri tersebut dalam keadaan terbalik.
Gambar 2. Pembuatan media agar dalam cawan petri
Pembuatan larutan pengencer

ALAT:
 Gelas beaker 250 ml  Tabung reaksi bertutup ulir
 Labu takar 100 ml  Laboratory bottle
 Labu takar 1000 ml  Autoklaf
 Dispensette  Timbangan
BAHAN:
 Kapas
 KH2PO4
 NaOH 1 N

25
CARA KERJA:
1. Timbang 3.4 g KH2PO4 pada gelas beaker 250 ml dan tambahkan 60 ml
aquades. Aduk sampai homogen.
2. Atur pH larutan tersebut dengan NaOH 1 N sampai mencapai 7.2. Masukkan
dalam labu ukur 100 ml dan tepatkan sampai volumenya 100 ml dengan
menggunakan aquades.
3. Kocok sampai homogen. Larutan ini disebut larutan stok.
4. Ambil 1.25 ml larutan stok, masukkan dalam labu takar 1000 ml kemudian
encerkan sampai volumenya 1000 ml.
5. Masukkan masing-masing 9 ml larutan stok ke dalam tabung reaksi
menggunakan dispensette dan 90 ml larutan ke dalam laboratory bottle 150
ml.
6. Sterilisasi pada suhu 121oC selama 15 menit.

26
BAB IV
PENGENCERAN DAN ENUMERASI
Metode hitungan cawan (total plate count) merupakan salah satu metode yang
umum digunakan untuk menentukan jumlah mikroba dalam bahan pangan. Di
samping itu, penentuan jumlah mikroba dalam bahan pangan dapat juga dilakukan
dengan metode kekeruhan (turbidimetri) dengan menggunakan spektrofotometer.
Prinsip dari metode hitungan cawan (TPC) adalah menumbuhkan sel mikroba yang
masih hidup ke dalam medium agar, sehingga sel tersebut berkembang biak dan
membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dengan mata tanpa menggunakan
mikroskop.
Metode ini merupakan metode yang paling sensitif untuk menentukan jumlah
mikroba karena hanya sel hidup yang terhitung. Selain itu, metode hitungan ini
memungkinkan beberapa jenis mikroba dapat dihitung sekaligus dan dapat digunakan
untuk isolasi serta identifikasi mikroba karena koloni yang terbentuk mempunyai
penampakan pertumbuhan yang spesifik.
Adapun kelemahan metode ini, yaitu hasil perhitungan tidak menujukkan jumlah
yang sebenarnya karena adanya beberapa sel yang letaknya berdekatan dan
membentuk koloni, medium dan kondisi yang berbeda dapat memberikan hasil yang
berbeda, mikroba yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat dan
membentuk koloni yang kompak dan jelas serta tidak menyebar, perlu persiapan dan
waktu inkubasi yang lama sehingga pertumbuhan koloni dapat dihitung.
PENGENCERAN
Sebelum mikroba ditumbuhkan pada media agar pada cawan petri, maka sampel
yang diperkirakan mengandung mikroba lebih dari 250 sel per gram atau per cm2
harus diencerkan dahulu, agar setelah inkubasi akan terbentuk koloni yang jumlahnya
dapat dihitung, yaitu jumlahnya berada di antara 25-250 koloni.
Pengenceran umumnya dilakukan secara desimal yaitu 1:10, 1:100, 1:1000 dan
seterusnya atau 1:100, 1:10.000, 1:1.000.000 dan seterusnya. Pengambilan contoh
harus dilakukan secara aseptik dan pada setiap pengenceran dilakukan pengocokan
untuk memisahkan sel-sel mikroba yang bergabung menjadi satu. Pengenceran secara
desimal memudahkan dalam penghitungan koloni, sedangkan pengenceran yang
bukan desimal seperti 1:5, 1:25 dan seterusnya jarang dilakukan karena kurang praktis
dalam perhitungannya. Teknik pengenceran ini harus dikuasai agar dapat
menghasilkan perhitungan koloni yang dapat menunjukkan jumlah mikroba di dalam
suatu sampel.

27
Gambar 1. Pengenceran sampel menggunakan serial dilution
Pengambilan contoh untuk mengetahui jumlah mikroba pada permukaan bahan

pangan, misalnya daging sapi, ikan, ayam, dapat dilakukan dengan metode usap
(swab). Larutan yang digunakan untuk pengenceran dapat berupa larutan buffer
fosfat, larutan garam fisiologis 0.85%, atau larutan Ringer.
PEMUPUKAN
Pemupukan dilakukan setelah sampel diencerkan hingga tingkat pengenceran
tertentu. Masing-masing tingkat pengenceran dipupukan di dalam media agar cawan.
Oleh karena itu, tahap pemupukan disebut juga sebagai plating. Jenis medium yang
digunakan harus sesuai dengan jenis mikroba yang akan ditumbuhkan pada media
agar cawan untuk dihitung, misalnya untuk menghitung jumlah bakteri asam laktat
digunakan media MRSA (de Mann Rogosa agar), sedangkan untuk menghitung semua
jenis mikroba yang terdapat pada sampel secara umum, digunakan media PCA (plate
count agar). Selain itu, untuk menumbuhkan jenis mikroba tertentu dapat digunakan
penambahan bahan penghambat atau antibiotik untuk membentuk kondisi lingkungan
yang bersifat selektif, seperti media APDA (acidified potato dextrose agar). Media ini
merupakan media PDA (potato dextrose agar) yang diberi penambahan asam tartarat
untuk meciptakan suasana asam dan menghambat pertumbuhan sebagian besar
bakteri, sehingga koloni yang tumbuh hanyalah koloni khamir atau fungi.
Gambar 2. Hasil pemupukan beberapa tingkat pengenceran sampel

28
ENUMERASI
Terdapat dua macam metode enumerasi atau perhitungan mikroba, yaitu :
1. Enumerasi secara langsung atau mikroskopik (Direct Microscopic Count)
2. Enumerasi dengan menghitung koloni (Standard Plate Count)
Enumerasi Secara Langsung (Mikroskopik)

Enumerasi secara langsung dilakukan dengan cara menghitung jumlah sel yang
tampak pada pengamatan dengan menggunakan mikroskop. Teknik ini banyak
digunakan karena dapat dilakukan dengan cepat dan murah dengan menggunakan
alat yang disebut counting chamber. Keuntungan lainnya adalah dapat diperoleh
informasi tambahan mengenai ukuran dan morfologi mikroba yang sedang dihitung.
Jumlah sel yang diperoleh dengan cara ini meliputi sel yang hidup dan sel yang mati.
Counting chamber berupa lempeng gelas dengan permukaan yang dibuat petak-
petak sangat kecil berbentuk bujur sangkar dengan luas dan kedalaman tertentu
(misalnya luas petak 1/400 mm2 dan kedalaman 0.05 mm). Contoh alat ini adalah:
Hawksley counting chamber, Petroff-Hauser counting chamber, haemocytometer.
Gambar 3. Haemacytometer
Suspensi mikroba yang akan dihitung jumlahnya diteteskan pada permukaan

lempeng tepat pada petak-petaknya, kemudian ditutup dengan gelas penutup
kemudian diamati dengan mikroskop yang perbesarannya tergantung dari ukuran
mikroba yang diamati. Jumlah sel mikroba tiap ml atau gram bahan dapat ditentukan
dengan menghitung jumlah sel mikroba dalam setiap petak atau beberapa petak.

29
Teknik ini memiliki kelemahan apabila dilakukan dengan tidak cermat yang
mengakibatkan terjadinya kesalahan. Beberapa hal yang dapat menimbulkan
kesalahan, yaitu :
 Kelelahan pada mata, sehingga tidak akurat ketika menghitung sel yang
tampak pada mikroskop.
 Reprodusibilitas ketebalan cairan pengisi di antara dasar petak dan gelas
penutup akibat cara pengisian dan penutupan petak.
 Adsorpsi bakteri pada permukaan alat-alat gelas yang digunakan seperti pipet,
tabung reaksi, dan lain-lain.
 Adanya pertumbuhan, motilitas, dan agregasi sel-sel mikroba.
Enumerasi Dengan Menghitung Koloni

Cara ini dipakai untuk menentukan jumlah
mikroba yang hidup. Mikroba dikatakan hidup
apabila dari satu sel mikroba mampu membentuk
koloni pada media padat. Dasar enumerasi ini
adalah dengan membuat suatu seri pengenceran
bahan dengan kelipatan 10. Dari masing-masing
pengenceran diambil sampel sebanyak 0.1 ml atau
1 ml dan kemudian diinokulasikan dalam cawan
petri dengan media agar yang sesuai. Setelah
diinkubasi, dihitung jumlah koloni pada setiap
cawan petri dari masing-masing pengenceran.
Dari jumlah koloni tiap cawan petri dapat
ditentukan jumlah mikroba tiap ml atau gram Gambar 4. Colony counter
bahan setelah dikalikan dengan faktor
pengencernya.
Terdapat beberapa variasi pada enumerasi dengan menghitung koloni, yaitu:
1. Pour plates
Sampel yang telah diencerkan dipipet kemudian ditaruh dalam cawan petri
kosong yang steril. Setelah itu, tuang media agar yang masih mencair (suhu
40-45oC), kemudian digoyang-goyangkan secara hati-hati, sehingga sampel dan
media tercampur merata, lalu dibiarkan memadat.
Gambar 5. Cara menuang media pada metode

pour plate

30
2. Spread plates
Sebanyak 0.1 ml sampel yang telah diencerkan, dipipet, dan ditaruh pada
permukaan media agar yang sudah memadat dalam cawan petri. Setelah itu,
sampel diratakan di atas permukaan media dengan bantuan alat perata
(spreader) yang dikenal dengan nama driglaski.
Gambar 6. Metode pour plate dan spread plate

(sumber : John Wiley & Sons, Inc. , 2012)
3. Thin layer plates

Sejumlah sampel dimasukkan ke dalam tabung berisi medium agar yang
mencair (jumlah medium 2.5-3.5 ml dengan kadar agar 0.6-0.7%), setelah itu
digojog sampai homogen lalu dituang ke dalam cawan petri yang sudah berisi
media agar yang memadat, lalu dibiarkan sampai memadat.
4. Layered plates
Metodenya sama dengan thin layer plates, namun pada cara ini ditambahkan
lagi satu lapis untuk mencegah kontak mikroba dengan oksigen di udara.
Masing-masing teknik di atas mempunyai kegunaan, kelebihan dan kekurangan

yang berbeda-beda. Beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam enumerasi dengan
penghitungan koloni untuk mengurangi kesalahan-kesalahan, yaitu :
1. Larutan pengencer.
Larutan pengencer yang digunakan harus steril dan tidak menyebabkan
hilangnya kemampuan tumbuh sel-sel mikroba. Larutan pengencer sebaiknya
mempunyai sifat osmotik yang sama dengan lingkungan mikroba yang akan
dihitung jumlahnya. Larutan pengencer dapat berupa aquades, larutan garam
(misalnya larutan Ringer), media cair yang didinginkan, atau 0.1% pepton-air.
Agar tidak terjadi perbanyakan sel selama pelaksanaan pengenceran, dapat
digunakan larutan pengencer yang sesuai.

31
2. Jumlah koloni.
Jumlah koloni yang tumbuh pada setiap cawan petri yang memenuhi syarat
untuk perhitungan adalah antara 25-250 koloni.
3. Suhu media agar.
Media agar yang digunakan untuk plating dicairkan dahulu sebelum dituang
atau dicampur dengan suspensi sel mikroba. Pencairan dapat dilakukan
dengan memanaskannya dalam waterbath atau oven microwave. Sebelum
medium cair digunakan maka suhunya perlu diturunkan dahulu sampai antara
40-45oC (media agar membeku pada suhu + 40oC). Penggunaan media yang
suhunya lebih tinggi dari suhu tersebut (>45oC) akan menyebabkan kematian
atau kerusakan sel mikroba yang tidak tahan suhu tinggi, selain itu
menyebabkan kondensasi yang berlebihan pada cawan petri setelah media
agar memadat atau dingin.
Cara menghitung koloni

Koloni yang muncul pada cawan petri untuk masing-masing tingkat pengenceran
yang dipupukan akan memiliki jumlah yang berbeda sesuai dengan tingkat
pengenceran yang dilakukan. Jumlah koloni terbanyak akan tampak pada tingkat
pengenceran terendah yang dipupukan dan umumnya tidak dapat dihitung karena
jumlahnya yang melebihi batas jumlah mikroba yang terhitung (>250), oleh karena itu
hasil perhitungan ini disebut TBUD (terlalu banyak untuk dihitung, sedangkan jumlah
koloni yang memiliki jumlah yang lebih sedikit dari batas bawah jumlah mikroba yang
terhitung (<25), disebut TSUD (terlalu sedikit untuk dihitung).
Gambar 7. Cara perhitungan koloni hasil pemupukan

(sumber : Pearson Education)
Pengenceran 1 ml sampel ke dalam 9 ml larutan pengencer maka dihitung sebagai

pengeceran 1:10 (10-1). Semakin tinggi jumlah mikroba yang terdapat dalam suatu
sampel maka semakin tinggi pengenceran yang harus dilakukan. Misalnya, setelah

32
inkubasi diperoleh 32 koloni pada cawan dengan tingkat pengenceran 10-4, maka
jumlah koloni per ml adalah
Untuk melaporkan penghitungan jumlah mikroba digunakan suatu standar yang

disebut Standard Plate Count (SPC). Standar ini berisi penjelasan mengenai cara
menghitung koloni pada cawan serta memilih data yang dapat digunakan untuk
menghitung jumlah koloni dalam suatu contoh.
Berikut cara menghitung koloni yang muncul :
1. Cawan yang dipilih adalah cawan yang mempunyai koloni dengan jumlah
antara 25-250.
2. Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan suatu kumpulan
koloni yang besar dan jumlah koloninya diragukan, maka dapat dihitung
sebagai satu koloni.
3. Suatu deretan (rantai) koloni yang terlihat sebagai garis tebal dihitung sebagai
satu koloni.
Bila perhitungan menggunakan pedoman bahwa jumlah koloni ada di antara 25-
250 maka data yang disajikan harus mengikuti pedoman, berupa hasil yang dilaporkan
hanya terdiri dari dua angka yaitu angka pertama dan angka kedua. Jika angka yang
ketiga sama dengan atau lebih besar dari 5, maka harus dibulatkan satu angka lebih
tinggi pada angka yang kedua dengan cara perhitungan:
( )
n1 = jumlah cawan pada pengenceran pertama
n2 = jumlah cawan pada pengenceran kedua
d = pengenceran pada cawan pertama
Contoh : Berikut adalah data hasil analisis sampel sari buah (dengan satu kali
pengulangan)
Jumlah koloni per pengenceran TPC
Sampel -2 -3 -4
10 10 10 (CFU/ml)
A*) 234 220 28 26 1 2 2.3 x 104
B*) 350 343 200 197 130 102 3.0 x 105
C 22 20 15 13 0 2 <2.5 x 103
D TBUD TBUD TBUD TBUD 300 302 >2.5 x 105

33
*) Contoh perhitungan sampel A :
( ( ))
*) Contoh perhitungan sampel B :
(( ( ))
TUJUAN:
Mempelajari cara sampling sampel bahan pangan dan menghitung jumlah
mikroba yang terdapat pada sampel bahan pangan dengan metode total plate
count.
METODE TUANG (POUR PLATE)
ALAT:
 Cawan petri steril
 Mikropippet 1 ml
 Inkubator 30oC
 Laboratory bottle
 Tip pipet 1 ml
BAHAN:
 Air minum dalam kemasan  Larutan pengencer @ 9 ml
 Air sayur asin  PCA (Plate Count Agar)
 Air rendaman tahu  Larutan pengencer @ 90 ml
 Air sumur
Kelompok Bahan Pengenceran Pemupukan

I Air minum dalam kemasan 10-1 – 10-3 10-1 – 10-3 ml
II Air minum isi ulang 10-2 – 10-5 10-3 – 10-5 ml
III Air rendaman tahu 10-2 – 10-8 10-6 – 10-8 ml
IV Air sumur 10-2 – 10-9 10-7 – 10-9 ml
CARA KERJA:
1. Siapkan dan beri label larutan pengencer dan cawan petri sesuai dengan
pengenceran dan pemupukan yang ditetapkan. Gunakan 2 cawan (duplo)
untuk setiap pengenceran. Kemudian buatlah pengenceran sampel seperti
contoh pada gambar dibawah ini dengan jumlah pengenceran yang ditetapkan.
Untuk pengenceran yang dimulai dari 10-1, pengenceran dimulai dengan
memipet 1 ml sampel dan dimasukkan ke dalam 9 ml larutan pengencer,

34
sedangkan untuk pengenceran yang dimulai dari 10-2, lakukan pengenceran

awal dengan memipet sebanyak 1 ml sampel dan masukkan ke dalam larutan
pengencer 99 ml, sehingga didapatkan faktor pengenceran sebesar 10-2.
Gambar 8. Cara pengenceran sampel
2. Pipet 1 ml sampel yang telah diencerkan masing-masing ke dalam 2 cawan

petri sebagai pengulangan (duplo) dimulai dari pengenceran terendah yang
ditetapkan untuk pemupukan. Untuk menghemat penggunaan larutan
pengencer dan pipet, sampel yang akan dimasukkan ke dalam cawan petri
yang terakhir (pengenceran tertinggi) dapat diambil dengan cara memipet
sebanyak 0.1 ml dari pengenceran satu desimal di bawahnya. Penghematan
pipet juga dapat dilakukan dengan menggunakan pipet yang sama untuk
pengenceran dan pemipetan ke dalam cawan dengan syarat berasal dari
pengenceran yang sama.
3. Tuangkan ±10 ml PCA cair ke dalam cawan secara aseptik dan goyangkan
secara mendatar di atas meja membentuk pola angka 8 supaya sampel
menyebar rata. Setelah agar membeku, inkubasikan dengan posisi terbalik
pada suhu 30oC selama 2 hari.
Koloni di bawah Koloni di

permukaan permukaan
inkubasi
Sampel dipipet dengan Tambahkan medium steril Kekhasan hasil

menggunakan pipet dan goyangkan agar contoh pour-plate
steril menyebar rata
Gambar 9 . Metode pour-plate

35
METODE PERMUKAAN (SPREAD PLATE)

ALAT:
 Cawan petri steril
 Pipet 1 ml steril
 Inkubator 30oC
 100 ml etanol 95% dalam gelas piala
BAHAN:
Kelompok Bahan Pengenceran Pemupukan
I Jus mangga pedagang minuman 10-2 – 10-9 10-7 – 10-9 ml
II Es teh pedagang minuman 10-2 – 10-9 10-7 – 10-9 ml
III Sari buah kemasan 10-1 – 10-4 10-2 – 10-4 ml
IV Susu UHT kemasan 10-1 – 10-4 10-2 – 10-4 ml
CARA KERJA:
1. Siapkan dan beri label larutan pengencer dan cawan petri sesuai dengan
pengenceran dan pemupukan yang ditetapkan. Gunakan 2 cawan (duplo)
untuk setiap pengenceran. Kemudian buatlah pengenceran sampel seperti
contoh pada gambar dibawah ini dengan jumlah pengenceran yang ditetapkan.
2. Buatlah agar cawan PCA, yaitu ±10 ml PCA cair dituangkan ke dalam cawan
petri steril. Tutup dan biarkan hingga agar membeku.
3. Pipet 0.1 ml sampel pada tingkat pengenceran yang telah ditentukan masing-
masing ke dalam 2 cawan agar. Dimulai dari pengenceran terendah yang
ditetapkan untuk pemupukan.
4. Celupkan ujung batang gelas drigalski ke dalam etanol lalu pijarkan beberapa
saat hingga nyala api di batang gelas padam.
Gambar 9. Cara penggunaan batang gelas drigalski

(sumber : The Mc-Graw Hill Companies, Inc.)
5. Setelah dingin, gunakan batang gelas (driglaski) untuk meratakan contoh di

atas cawan, lalu inkubasikan dengan posisi terbalik pada suhu 30 oC selama 2
hari.

36
6. Hitung jumlah koloni yang tumbuh. Harus diingat bahwa jumlah contoh yang
ditumbuhkan adalah 0.1 ml sehingga harus dimasukkan dalam perhitungan
total count sesuai dengan standar yang telah ditetapkan.
Koloni di
inkubasi permukaan
Sampel diteteskan di Sampel diratakan di sekeliling permukaan Kekhasan hasil

atas permukaan agar agar dengan menggunakan batang gelas spread-plate
pada cawan petri (driglaski) steril
Gambar 11. Metode spread plate

37
BAB V
PENGECATAN BAKTERI
Pada umumnya sel-sel mikroba tidak mempunyai warna. Sel-sel mikroba

mempunyai pigmen yang sangat sedikit, sehingga sulit dilihat pada mikroskop.
Pengamatan terhadap sel mikroba maupun bagian-bagiannya memerlukan usaha
pewarnaan sel terlebih dahulu karena sel mikroba transparan dan perbedaan warna
antara sel dengan latar belakangnya (biasanya dipakai air) sangat sedikit. Pewarnaan
(pengecatan) sel dapat meningkatkan perbedaan warna antara sel mikroba dengan
latar belakangnya.
Larutan pewarna tidak dapat langsung masuk ke dalam sel hidup. Oleh karena itu,
mikroba harus dimatikan terlebih dahulu sebelum diperlakukan dengan pewarnaan.
Sel mati dapat menyerap dan mempertahankan warna. Setelah sel menyerap warna,
terjadi reaksi kimia antara pewarna dan komponen-komponen sel sehingga warna
akan tetap tinggal meskipun sel dicuci dengan air.
Cara umum yang dilakukan untuk mematikan sel adalah dengan fiksasi panas.
Mula-mula sel dioleskan pada gelas preparat sehingga diperoleh lapisan tipis, setelah
itu dikering-anginkan. Kemudian preparat dipanaskan perlahan-lahan untuk
membunuh sel. Fiksasi panas akan membunuh sel sehingga pewarna dapat masuk ke
dalam sel, selain itu juga dapat menguatkan sel pada gelas preparat sehingga tidak
tercuci selama pengecatan.
Cat pewarna (dye) yang digunakan untuk pengecatan bakteri adalah garam-garam
yang mengandung ion organik dan ion anorganik yang terdiri dari ion-ion positif
(kation) dan ion-ion negatif (anion). Misalnya, bubuk pewarna biru metilen dan violet
kristal merupakan garam biru-metilen klorida dan violet kristal klorida. Pewarna ini
akan mengalami disosiasi di dalam larutan menjadi ion organik bermuatan positif dan
ion organik bermuatan negatif. Warna yang timbul dihasilkan oleh kation organik
bermuatan positif. Kation-kation ini merupakan senyawa organik yang mengandung
lebih dari satu cincin tertutup yang merupakan karakteristik dari pewarna.
Ion organik merupakan bagian berwarna dari pewarna (dye) dan disebut pewarna
dasar. Pewarna dasar dapat berikatan dengan anion atau kation untuk membentuk
garamnya. Pewarna basa adalah pewarna dasar yang bermuatan positif, misalnya biru
metilen dan violet Kristal, sedangkan pewarna asam (acidic dye) adalah pewarna dasar
yang bermuatan negatif.
Pewarna basa yang bermuatan positif akan menarik muatan negatif pada
permukaan sel dan sebagian akan berikatan dengan komponen-komponen pada
permukaannya. Pewarna basa akan masuk kedalam sel dan berikatan dengan bagian
dalam sel yang bermuatan negatif. Sel yang telah mati akan berikatan dengan
pewarna pada permukaan dan juga dengan senyawa-senyawa di dalamnya sehingga
nampak berwarna. Ikatan ionik antara pewarna basa dengan bagian sel cukup kuat,
sehingga tidak mudah dihilangkan saat pencucian. Pewarna basa biasa digunakan
untuk pengecatan sederhana, pengecatan diferensial, dan pengecatan struktural.

38
Gambar 2. Tahap pewarnaan Gram
Pewarna asam memiliki molekul dasar yang bermuatan negatif sehingga tidak
dapat berikatan dengan permukaan sel dan tidak dapat masuk ke dalam sel. Sel
bermuatan negatif tidak dapat dicat oleh pewarna yang bermuatan negatif. Akibatnya,
sel akan tampak sebagai warna putih dikelilingi latar belakang yang berwarna.
Pewarna negatif disebut juga sebagai pengecatan negatif.
Dalam pengecatan mikroba, diperlukan penyiapan preparat yang baik. Sel dari
kultur diletakkan pada gelas preparat sehingga diperoleh lapisan tipis pada area yang
kecil. Preparat dikeringkan dan dikuatkan dengan fiksasi panas atau fiksasi kimia agar
sel melekat pada gelas preparat.
Preparat yang baik adalah:
1. Cukup tebal untuk melihat masing-masing sel, namun tidak saling menumpuk.
2. Tetap melekat pada gelas preparat selama pencucian berulang-ulang.
3. Sel tetap pada morfologi asalnya setelah fiksasi dan pengecatan.
Pengecatan bakteri dapat dibedakan menjadi tiga yaitu pengecatan sederhana,
pengecatan diferensial, dan pengecatan struktural.
PENGECATAN SEDERHANA
Pengecatan sederhana adalah pengecatan sel mikroba dengan satu pewarna dan
satu tahap pengecatan saja. Pengecatan sederhana dapat mewarnai sel atau latar
belakangnya sehingga memungkinkan untuk mengamati bentuk sel (batang lurus,
bengkok, atau bulat) dan susunannya (berpasangan atau kluster). Pengecatan
sederhana tidak dapat digunakan untuk membedakan antara berbagai tipe sel bentuk
batang atau bulat. Pengecatan sederhana meliputi pengecatan basa dan pengecatan
asam. Pewarna yang paling banyak digunakan adalah pewarna kation atau basa,
seperti biru metilen, basic fuchsin, dan violet kristal.

39
TUJUAN
Mempelajari tahapan cara pewarnaan sel mikroba untuk mengetahui morfologi sel
mikroba dengan pengecatan sederhana.
ALAT:
 Mikroskop
 Object glass (gelas objek) dan cover glass (gelas penutup)
BAHAN:
 Biakan murni: Bacillus, Streptococcus, Lactobacillus
 Biru metilen
CARA KERJA:
1. Bersihkan gelas benda dan gelas penutup dengan alkohol sampai bebas lemak
dan debu.
2. Beri label pada ujung gelas benda dengan nama atau insial mikroba yang akan
diwarnai. Di bawah gelas benda digambarkan bulatan berdiameter 1 cm
dengan spidol. Daerah bulatan tersebut digunakan sebagai daerah untuk
pengecatan mikroba. Balikkan gelas, benda sehingga gambar bulatan ada di
bagian sebaliknya.
3. Letakkan satu tetes aquades pada permukaan gelas benda di dalam daerah
yang sudah digambar. Ambil sedikit biakan bakteri dengan ose bermata secara
aseptik dan campur dengan aquades yang ada pada gelas benda.
4. Ratakan suspensi ini pada seluruh bulatan area. Lakukan hal yang sama untuk
bakteri yang lain. Apabila bakteri berasal dari kultur cairan, pindahkan
beberapa ose ke permukaan gela benda tanpa dicampur dengan aquades.
Ratakan selnya pada seluruh permukaan bulatan.
5. Kering-anginkan (dengan kipas angin) hingga membentuk noda.
6. Lakukan fiksasi dengan cara melewatkan gelas benda pada nyala api beberapa
kali. Jangan biarkan gelas benda secara langsung terkena nyala api sehingga
menjadi terlalu panas. Untuk mengetes suhu fiksasi, tempelkan gelas benda
pada pergelangan tangan selama 1-2 detik. Fiksasi yang baik adalah apabila
terasa hangat bukan terasa panas.
7. Warnai noda bakteri dengan cat biru metilen Leoffer dengan cara meletakkan
beberapa tetes cat pada permukaan gelas benda. Biarkan selama 1 menit.
8. Buang cairan biru metilen dan cucilah permukaan preparat dengan air
beberapa kali, kemudian kering-anginkan. Tutup permukaan preparat dengan
cover glass.
9. Amati preparat dengan mikroskop perbesaran kuat (dengan minyak imersi). Sel
bakteri akan tampak berwarna biru muda. Beberapa struktur dalam sel
kemungkinan dapat terlihat, terutama untuk sel yang ukurannya besar.
10. Amati bentuk sel dan ukuruan relatif tiap-tiap bakteri. Buatlah gambar sel dan
lengkapi dengan keterangan yang diperlukan (nama bakteri, bentuk dan
ukuran sel, serta perbesaran yang dipakai).

40
Gambar 2 . Tahap pembuatan preparat
PENGECATAN DIFERENSIAL (PENGECATAN GRAM)

Pengecatan diferensial merupakan pengecatan yang menggunakan berbagai
kombinasi pewarna berdasarkan perbedaan kimia antar sel. Pengecatan ini akan
mewarnai seluruh sel dari bakteri tipe tertentu. Yang termasuk pengecatan diferensial
dalah pengecatan Gram dan pengecatan acid-fast.
Pengecatan Gram dikembangkan pertama kali oleh Christian Gram, seorang dokter
Denmark pada tahun 1883. Pengecatan Gram termasuk pengecatan diferensial karena
dapat digunakan untuk membedakan bakteri dalam dua kelompok besar, yaitu
mikroba Gram negatif dan mikroba Gram positif. Bakteri Gram positif adalah bakteri
yang mengikat kuat cat utama dan tidak dapat dilunturkan oleh bahan peluntur. Pada
akhir pengecatan Gram, bakteri Gram positif akan menunjukkan sel yang berwarna
ungu. Sebaliknya, bakteri Gram negatif akan kehilangan cat utama setelah tahap
dekolorisasi dan setelah pemberian cat penutup safranin akan tampak sel yang warna
merah muda. Bila bakteri Gram positif tidak diberi mordan atau iodin setelah
pengecatan cat utama, maka pada tahap dekolorisasi cat utama akan luntur dan akan
tampak sebagai bakteri Gram negatif. Terdapat 4 jenis reagen yang digunakan dalam
pengecatan Gram:
1. Cat utama, berupa larutan violet kristal
2. Mordan atau iodine
3. Bahan peluntur, berupa alkohol
4. Cat penutup, berupa safranin
Gambar 3. Warna yang timbul selama proses pengecatan Gram

41
Tujuan : menentukan golongan Gram (Gram positif atau Gram negatif) bakteri yang
diuji.
BAHAN:
 Biakan murni : Lactobacillu bulgaricus dan E. coli
 Larutan cat : violet kristal Hucker, Iodin, etanol 95% (larutan pencuci) dan
safranin
 Aquades
ALAT:
 Gelas benda dan gelas penutup
CARA KERJA:
1. Bersihkan gelas benda dan gelas penutup dengan alkohol sampai bebas lemak
dan debu.
2. Beri label pada ujung gelas benda dengan nama atau insial mikroba yang akan
diwarnai. Di bawah gelas benda digambarkan bulatan berdiameter 1 cm
dengan spidol. Daerah bulatan tersebut digunakan sebagai daerah untuk
pengecatan mikroba. Balikkan gelas benda sehingga gambar bulatan ada di
bagian sebaliknya.
3. Letakkan satu tetes aquades pada permukaan gelas benda di dalam daerah
yang sudah digambar. Ambil sedikit biakan bakteri dengan ose bermata secara
aseptik dan campur dengan aquades yang ada pada gelas benda.
4. Ratakan suspensi ini pada seluruh bulatan area. Lakukan hal yang sama untuk
bakteri yang lain. Apabila bakteri berasal dari kultur cairan, pindahkan
beberapa ose ke permukaan gela benda, tanpa dicampur dengan aquades.
Ratakan selnya pada seluruh permukaan bulatan.
6. Lakukan fiksasi dengan cara melewatkan gelas benda pada nyala api beberapa
kali. Jangan biarkan gelas benda secara langsung terkena nyala api, sehingga
menjadi terlalu panas. Untuk mengetes suhu fiksasi, tempelkan gelas benda
pada pergelangan tangan selama 1-2 detik. Fiksasi yang baik adalah apabila
terasa hangat bukan terasa panas.
7. Bubuhkan cairan utama violet krital 2-3 tetes dan diamkan selama 1 menit.
8. Cuci dengan air mengalir, kemudian kering-anginkan (dengan kipas angin).
9. Tetesi dengan beberapa tetes larutan Iodin dan biarkan selama 1 menit.
10. Cuci sisa Iodin dengan air mengalir dan kering-anginkan.
11. Miringkan gelas benda, cuci dengan larutan etanol dengan cara meneteskan
etanol pada permukaan noda bakteri sampai etanol bekas cucian tidak
berwarna, selama kurang lebih 30 detik.
12. Cuci dengan air mengalir secara singkat dan kering-anginkan kembali.

42
13. Bubuhkan beberapa tetes cat penutup safranin dan diamkan selama 2 menit.
14. Cuci secara cepat dengan air mengalir dan kering anginkan. Tutup permukaan
dengan gelas penutup.
15. Amati preparat dengan mikroskop perbesaran kuat (dengan minyak imersi). Sel
akan berwarna merah muda/pink (Gram negatif) atau biru ungu (Gram positif).
16. Catat hasil pengecatan Gram (positif atau negative), ukuran bakteri dan ciri-ciri
yang lain (dalam bentuk berikatan, berkelompok, dan sebagainya) untuk setiap
preparat. Gambar beberapa sel yang mewakili dan tuliskan perbesaran yang
dipakai.
Gambar 3. Hasil pengecatan Gram

43
BAB VI
DETEKSI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI
Tahap deteksi dan identifikasi mikroba digunakan untuk mengetahui jenis mikroba
yang diamati sampai ke tingkat spesies bahkan lebih spesifik, namun mikroba di
lingkungan pada umumnya terdapat dalam keadaan campuran. Oleh karena itu, harus
dipastikan sebelumnya bahwa kultur yang akan dideteksi dan diidentifikaksi
merupakan kultur atau biakan yang telah melalui tahap isolasi, sehingga dapat
dipastikan bahwa hanya ada satu jenis mikroba yang terdapat di dalam kultur
tersebut.
ISOLASI
Agar dapat mengidentifikasi suatu spesies mikroba tertentu, sebelumnya spesies
tersebut harus dipisahkan dari organisme lain yang umum dijumpai dalam habitatnya
kemudian ditumbuhkan menjadi biakan murni. Biakan murni adalah biakan yang sel-
selnya berasal dari pembelahan sebuah sel tunggal. Ada beberapa metode yang dapat
digunakan untuk memperoleh biakan murni dari sutu biakan campuran. Metode
goresan dan metode kultivasi langsung merupakan metode yang paling umum
digunakan. Metode goresan cocok digunakan untuk isolasi bakteri dan yeast,
sedangkan cara pengenceran atau kultivasi langsung digunakan untuk isolasi jamur.
Demikian juga untuk sampel biji-bijian akan lebih baik jika mengggunakan metode
kultivasi langsung.
Setiap mikroba dengan sifat genetik yang berbeda akan membentuk koloni dengan
karakter yang berbeda pula, baik ukuran, bentuk maupun warna koloninya, sehingga
sifat ini dapat digunakan untuk mengidentifikasi jenis mikroba. Berikut adalah
beberapa penampakan mikroba yang umum dijumpai :
Tekstur Bentuk Penampakan Koloni Elevasi Permukaan
Kering Bulat Datar

Halus
(mudah dipisahkan)
Tidak beraturan
Keras Cembung
Kasar
(sukar dipisahkan)
Rhizoid Pulvinate
Seperti mentega Berkerut
Filamentous
Umbonate
Seperti lendir

44
METODE GORESAN
Prinsip metode isolasi ini adalah dengan membuat suspensi bahan sebagai sumber
mikroba kemudian diambil satu ose steril dari suspensi tersebut untuk digoreskan
pada media padat yang sebelumnya sudah disediakan terlebih dahulu. Goresan
diawali dari tepi cawan petri dengan gerakan kontinu sampai kira-kira seluas ¼ dari
luas media padat. Ose dipijarkan kemudian menyentuh bekas goresan akhir dari
goresan pertama (ose tidak boleh mengambil suspensi sel) lalu digoreskan pada sisi
yang berbeda di media. Goresan selanjutnya dilakukan dengan cara yang sama sampai
terbentuk empat sisi goresan pada media. Hasil goresan yang baik adalah dapat
menghasilkan koloni-koloni yang terpisah dengan jarak lebih dari 2 mm sehingga
mudah diambil dan dipisahkan (diisolasi dan diidentifikasi). Goresan yang dibuat
umumnya mengikuti pola.
Gambar 1. Isolasi dengan cara goresan
Goresan yang dibuat umumnya mengikuti pola. Setiap kali akan berpindah pola
goresan, ose dipijarkan terkebih dahulu dan kemudian didinginkan, agar didapatkan
hasil goresan yang baik, yaitu koloni yang terpisah.
Goresan T Goresan Kuadran Goresan Radian Goresan Sinambung
Gambar 2. Macam-macam tipe goresan

45
Keuntungan metode goresan adalah menghemat bahan dan waktu, namun cara ini
memerlukan keterampilan yang tinggi, agar diperoleh hasil yang baik. Goresan yang
baik akan menghasilkan terisolasinya mikroorganisme seperti yang diinginkan. Sel-sel
tunggal yang terpisahkan disebut sel induk. Saat diinkubasi, sel ini akan membelah diri
sehingga jumlahnya menjadi eksponensial. Hal ini disebut dengan pertumbuhan
mikroorganisme yaitu pertambahan jumlah sel mikroorganisme, bukan ukurannya.
Setelah inkubasi, koloni-koloni akan tampak terpisahkan sehingga diperoleh kultur
murni.
Koloni yang terpisah
Gambar 3. Hasil goresan pada agar cawan setelah diinkubasi selama 24-48 jam.
Kesalahan yang umum dilakukan pada metode ini adalah:

1. Permukaan media agar untuk digoreskan tidak dimanfaatkan dengan baik
sehingga pengenceran mikroorganisme menjadi kurang lanjut.
2. Menggunakan terlalu banyak inokulum sehingga menyulitkan pemisahan sel-
sel yang digoreskan.
Tujuan : melakukan isolasi dari suspensi sel secara goresan.

BAHAN:
 Suspensi sel bakteri
 Media MRSA CaCO3 dalam cawan petri (disiapkan sehari sebelumnya untuk
meyakinkan tidak ada kontaminasi)
ALAT:
 Ose bermata
CARA KERJA:
1. Buat pembagian sektor dibagian belakang cawan petri, seperti pada gambar
berikut:

46
0
II III
Gambar 4. Pembagian sektor untuk metode cawan gores
2. Pijarkan ose bermata dan tunggu sampai dingin.

3. Ambil 1 ose suspensi sel.
4. Sel mikroba yang sudah menempel pada ose ini selanjutnya digoreskan pada
permukaan media MRSA CaCO3 dimulai dari bagian pinggir cawan. Secara
kontinu ose digerakkan ke kiri dan ke kanan sampai seluas 1/5-1/4 luasan
media.
5. Pijarkan kembali oseyang telah digunakan dan tunggu sampai dingin. Posisi
cawan petri diputar sedikit ke arah kiri. Goreskan ose steril tersebut dengan
goresan awal mengenal bagian akhir dari goresan pertama. Ini berarti arah
goresan kedua menyilang dengan goresan pertama. Demikian seterusnya
untuk goresan ketiga dan keempat. Ose harus dipijarkan setiap akan digunakan
untuk menggores (untuk mengurangi terjadinya kontaminasi, selama
melakukan goresan tutup cawan dibuka secukupnya saja).
6. Inkubasi pada suhu sesuai selama 24-48 jam.
7. Amati koloni-koloni yang tampak pada cawan hasil isolasi yang telah
diinkubasi.
8. Amati ciri-ciri koloni yang tampak. Fokuskan pengamatan terhadap koloni yang
terpisah (sektor III).
9. Catat ciri-ciri koloni yang tampak (bentuk koloni, bentuk pinggiran koloni,
bentuk elevasi koloni, adanya zonna bening di sekitar koloni).
10. Pilih dari masing-masing tipe koloni satu koloni saja. Ambil secara aseptik dan
pindahkan ke dalam media MRSA miring untuk tujuan pengamatan sifat-
sifatnya secara lanjut.
11. Inkubasi selama 24-48 jam. Biakan ini disebut sebagai isolat.
DETEKSI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI

Tujuan : mempelajari cara melakukan tahap deteksi dan identifikasi awal pada bakteri.
ALAT :
 Ose
 Mikroskop
 Object glass
 Cover glass

47
 Pewarna Gram
 Tabung reaksi
 Inkubator
BAHAN :
 H2O2 3%
 Isolat pada agar miring hasil isolasi yang telah diinkubasi pada percobaan
isolasi
 Nutrien Agar (NA)
 Nutrien Broth (NB)
CARA KERJA :
Lakukan tahap identifikasi untuk masing-masing isolat dengan tahap identifikasi
sebagai berikut :
a. Pewarnaan Gram
1. Bersihkan gelas benda dan gelas penutup dengan alkohol sampai bebas
lemak dan debu.
2. Beri label pada ujung gelas benda dengan nama atau insial mikroba
yang akan diwarnai. Di bawah gelas benda digambarkan bulatan
berdiameter 1 cm dengan spidol. Daerah bulatan tersebut digunakan
sebagai daerah untuk pengecatan mikroba. Balikkan gelas benda
sehingga gambar bulatan ada di bagian sebaliknya.
3. Letakkan satu tetes aquades pada permukaan gelas benda di dalam
daerah yang sudah digambar. Ambil sedikit isolat bakteri dari agar
miring dengan ose bermata secara aseptik dan campur dengan aquades
yang ada pada gelas benda.
4. Ratakan suspensi ini pada seluruh bulatan area. Lakukan hal yang sama
untuk bakteri yang lain. Ratakan selnya pada seluruh permukaan
bulatan.
6. Lakukan fiksasi dengan cara melewatkan gelas benda pada nyala api
beberapa kali. Jangan biarkan gelas benda secara langsung terkena
nyala api, sehingga menjadi terlalu panas. Untuk mengetes suhu fiksasi,
tempelkan gelas benda pada pergelangan tangan selama 1-2 detik.
Fiksasi yang baik adalah apabila terasa hangat bukan terasa panas.
7. Bubuhkan cairan utama violet krital 2-3 tetes dan diamkan selama 1
menit.
8. Cuci dengan air mengalir, kemudian kering-anginkan (dengan kipas
angin).
9. Tetesi dengan beberapa tetes larutan Iodin dan biarkan selama 1
menit.
10. Cuci sisa Iodin dengan air mengalir dan kering-anginkan.

48
11. Miringkan gelas benda, cuci dengan larutan etanol dengan cara
meneteskan etanol pada permukaan noda bakteri sampai etanol bekas
cucian tidak berwarna, selama kurang lebih 30 detik.
12. Cuci dengan air mengalir secara singkat dan kering-anginkan kembali.
13. Bubuhkan beberapa tetes cat penutup safranin dan diamkan selama 2
menit.
14. Cuci secara cepat dengan air mengalir dan kering anginkan. Tutup
permukaan dengan gelas penutup.
15. Amati preparat dengan mikroskop perbesaran kuat (dengan minyak
imersi). Sel akan berwarna merah muda/pink (Gram negatif) atau biru
ungu (Gram positif).
16. Catat hasil pengecatan Gram (positif atau negatif), ukuran bakteri dan
ciri-ciri yang lain (bentuk sel, dalam bentuk berikatan, berkelompok,
dan sebagainya) untuk setiap preparat. Gambar beberapa sel yang
diamati dan tuliskan perbesaran yang dipakai.
Gambar 5. Bentuk-bentuk sel bakteri
b. Uji Katalase
1. Siapkan gelas objek yang sudah dibersihkan.
2. Teteskan sebanyak 3 tetes H2O2 3% ke atas gelas objek.
3. Ambil sedikit koloni isolat pada agar miring menggunakan ose secara
aseptik.

49
4. Campurkan dengan H2O2 3% pada gelas objek.

5. Amati terbentuknya gelembung gas dari hasil pencampuran tersebut.
Katalase - Katalase +
Gambar 5. Hasil uji katalase
6. Catat hasil untuk kemudian diidentifikasi jenis bakterinya.
c. Uji motilitas
1. Siapkan media padat NA pada tabung reaksi yang steri.
2. Inokulasikan satu ose kultur bakteri yang sudah dibuat ke dalam tabung
secara aseptis.
3. Inkubasikan tabung reaksi pada suhu 37oC selama 1x24 jam.
4. Amati pergerakan bakteri pada agar tersebut.
5. Tentukan sifat bakteri tersebut berdasarkan pergerakannya.
d. Uji sifat respirasi bakteri

1. Siapkan media cair NB dalam tabung reaksi yang steril.
2. Inokulasikan satu ose biakan murni bakteri yang sudah dibuat ke dalam
media secara aseptis. Ratakan suspensi inokulum tersebut dengan cara
memutar atau memilin tabung kultur di antara kedua telapak tangan.
3. Inkubasikan pada suhu kamar selama 1x24 jam
4. Amati akumulasi pertumbuhan bakteri tersebut kemudian tentukan
kelompok bakteri yang diamati tersebut berdasarkan sifat respirasinya
(lihat gambar 6).
Gambar 6. Pertumbuhan bakteri berdasarkan mekanisme respirasinya

Harley Prescott (Companies, 2002)

50
e. Identifikasi
1. Gabungkan hasil pengamatan berupa bentuk koloni, pewarnaan Gram,
bentuk sel, cara hidup berkelompok, dan hasil uji katalase.
2. Cocokkan hasil yang didapat dengan literature atau kunci taksonomi
(Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 8th. Ed., 1974).
3. Tulis jenis bakteri yang diketahui dari hasil pengamatan tersebut.

51
BAB VII
DETEKSI DAN IDENTIFIKASI JAMUR
Fungi merupakan makhluk hidup eukariotik,

bersel satu atau banyak, dan tidak memiliki
klorofil. Oleh kaerna itu, keberadaannya dalam
sistem klasifikasi makhluk hidup memiliki kingdom
tersendiri, yaitu kingdom fungi. Fungi bersifat
heterotrof saprofit yang mendapatkan
makanannya dengan cara menghasilkan enzim
untuk mencerna atau mengurai makananya di luar
tubuh yang kemudian hasilnya akan diserap
oleh bagian tubuh fungi. Terdapat empat bagian Gambar 1. Kapang yang ditemui
besar dalam kingdom fungi, yaitu pada buah-buahan yang
Chytridiomycota, Zygomycota, Basidiomycota, membusuk
dan Ascomycota.
Jenis fungi yang paling umum ditemui dalam kehidupan sehari-hari, yaitu kapang
(mold) dan khamir (yeast). Kapang termasuk ke dalam jenis fungi Zygomycota yang
terdiri dari banyak sel, sedangkan khamir merupakan jenis fungi bersel satu. Keduanya
memiliki ukuran yang mikroskopik, sehingga untuk melihatnya dengan jelas
dibutuhkan mikroskop. Tubuh kapang terbentuk atas benang-benang hifa. Hifa
merupakan benang-benang halus yang membentuk miselium. Hifa ada yang bersekat
(septat) dan tidak bersekat (aseptat).
Pengamatan morfologi kapang dengan mikroskop perlu memperhatikan beberapa hal,
yaitu :
1. Hifa
Ada tidaknya septa, transparan atau keruh, berwaran atau tidak, jika
berwarna, tentukan warnanya.
2. Spora
 Seksual : oospora, askospora, basidiospora, atau bentuk yang lain.
 Aseksual : sporangiospora, konidiospora, arthrospora, dan lainnya.
3. Badan buah
 Sporangium : bentuk, ukuran, warna, dan letak.
4. Konidia : tipe, ukuran dan letak metula, fialida, uniseriate, biseriate, atau
monovertisilata, bivertisilita, terversilata atau quarterversilata.
5. Dasar badan buah : kolumela atau vesikula.
Perlu diamatai bentuk dan ukurannya.
6. Pendukung badan buah : tunggal atau dalam bentuk berkas, bercabang atau
tidak
7. Bentuk-bentuk khusus : stolon, rhizoid, sel kaki, apofisa, khlamidospora atau
bentuk khusus lainnya

52
Gambar 2. Morfologi kapang
Pengamatan morfologi jamur dengan slide kultur

Tujuan : mengetahui cara pembuatan slide culture dan mempelajari morfologi jamur
ALAT:
 Object glass
 Cover glass
 Ose bermata
 Ose jarum
 Vaselin
 Lilin
BAHAN:
 Biakan murni jamur pada PDA dalam tabung reaksi umur 4-5 hari: Aspergillus
sp., Penicillium sp., Neurospora sp., Mucor sp., Rhizopus sp. dan Fusarium sp.
 Medium PDA
CARA KERJA:
1. Bersihkan cover glass dengan alkohol dan keringkan dengan api bunsen.
Oleskan lilin yang masih panas (meleleh) pada kedua tepi yang berlawanan
selebar kurang lebih 2 mm dan tebal kurang lebih 1 mm.
2. Bersihkan object glass dengan alkohol dan panaskan di atas api bunsen sampai
agak panas.
3. Letakkan cover glass yang telah diolesi lilin tersebut di atas object glass
sehingga menempel dengan baik.
4. Cairkan medium PDA, biarkan sampai suhu 45oC, kemudian diinokulasi dengan
spora jamur yang disediakan.
5. Ambil medium tersebut secara aseptik dengan pipet steril dan teteskan pada
tepi gelas penutup sampai medium mengisi separuh bagian gelas penutup.

53
6. Untuk mencegah penguapan, olesi bagian gelas penutup yang masih terbuka
dengan lilin yang sedang mencair.
7. Inkubasikan pada suhu kamar selama 2-4 hari.
8. Amati dengan mikroskop pada perbesaran lemah dan sedang.
9. Gambar dan beri keterangan yang lengkap.
Pengamatan morfologi jamur dengan mounting medium laktofenol

Tujuan : membuat preparat jamur dengan mounting medium laktofenol
ALAT:
 Jarum preparat
 Object glass
 Cover glass
BAHAN:
 Biakan murni jamur pada media PDA untuk spesies Aspergillus, Penicillium,
Rhizopus, dan Mucor.
 Larutan mounting medium laktofenol
CARA KERJA:
1. Bersihkan gelas benda dengan alkohol sampai bebas lemak dan debu
kemudian tetesi dengan larutan laktofenol di bagian tengahnya.
2. Ambil sedikit biakan jamur dengan jarum preparat, kemudian diletakkan di
atas gelas benda yang telah diberi larutan laktofenol.
3. Jika miselia mengumpul, pisahkan dengan menggunakan dua buah jarum
preparat.
4. Tutup dengan gelas penutup dan usakan agar tidak terdapat gelembung udara
dalam preparat.
5. Amati dengan perbesaran lemah terlebih dahulu. Untuk jamur yang ukurannya
kecil, lanjutkan dengan perbesaran sedang. Jika diperlukan, amati bagian-
bagian yang diinginkan dengan perbesaran kuat menggunakan minyak imersi,
khususnya untuk pengamatan bentuk dan struktur spora atau konidia.
6. Gambar dan beri keterangan-keterangan yang lengkap.
Gambar 3. Penampakan Aspergillus

54
DAFTAR PUSTAKA
Hadioetomo, R.S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek: Teknik dan Prosedur Dasar
Laboratorium. PT. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.
Kusumaningrum, H.D., dkk. 2010. Penuntun Praktikkum Mikrobiologi Pangan.

Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut
Pertanian Bogor.
Staf Pengajar Laboratorium Bioteknologi. 1994. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi

Umum. Fakultas Teknologi Pertanian Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
Tim Penyusun. 2014. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi. Jurusan BIologi Fakultas Sains
dan Teknologi Universitas Islam Negri Maulana Malik Ibrahim, Malang


Modul Mikrobiologi PDF

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Modul Mikrobiologi PDF

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

1

Penuntun Praktikum Mikrobiologi Dasar

Bab I : Pengenalan Laboratorium Mikrobiologi ......................................... 3

Penuntun Praktikum Mikrobiologi Dasar

I. Tata Tertib Laboratorium Mikrobiologi Dasar

Penuntun Praktikum Mikrobiologi Dasar

II. Peralatan Laboratorium Mikrobiologi Dasar

2. Ose Untuk memindahkan,

3. Tabung Tempat menyimpan atau

4. Pinggan Tempat untuk mereaksikan zat

6. Object glass Untuk menaruh preparat yang

7. Mikroskop Untuk mengamati objek

Penuntun Praktikum Mikrobiologi Dasar

8. Mikroskop Untuk mengamati objek yang

9. Bunsen Sumber panas untuk

11. Autoklaf Untuk mensterilkan media, alat

13. Colony Untuk menghitung koloni

Penuntun Praktikum Mikrobiologi Dasar

14. Laminar air Tempat untuk melakukan

17. Tabung Untuk uji kualitatif mikroba yang

Penuntun Praktikum Mikrobiologi Dasar

18. Stomacher Untuk menghancurkan sampel

Penuntun Praktikum Mikrobiologi Dasar

b. Sterilisasi dengan api langsung (direct flame)

2. Sterilisasi tanpa panas (filtrasi)

PENGENALAN CARA-CARA STERILISASI

Penuntun Praktikum Mikrobiologi Dasar

b. Sterilisasi dengan oven

IV. Metode Aseptik

Penuntun Praktikum Mikrobiologi Dasar

mencemari hasil pekerjaan atau biakan murni yang digunakan. Umumnya,

Gambar 1. Selama bekerja dengan teknik aseptik, bunsen burner

Penuntun Praktikum Mikrobiologi Dasar

 Media agar miring MRSA

Gambar 2. Cara sterilisasi inoculating loop

4. Biarkan ose dingin sebelum menyentuh kultur yang akan dipindah.

Penuntun Praktikum Mikrobiologi Dasar

Gambar 3. Cara memindahkan kultur dari tabung

b. Memindahkan kultur dari tabung reaksi ke cawan petri

Penuntun Praktikum Mikrobiologi Dasar

7. Inkubasikan cawan petri pada inkubator. Posisikan cawan petri dalam

Gambar 4. Cara memindahkan kultur dari tabung reaksi ke

Penuntun Praktikum Mikrobiologi Dasar

Mikroskop merupakan alat utama dalam mempelajari mikrobiologi. Mikroskop

Mikroskop cahaya dikenal juga dengan

Lensa okuler (eyepiece lens) berfungsi untuk memperbesar bayangan yang

Penuntun Praktikum Mikrobiologi Dasar

Lensa kondensor berfungsi mendukung terciptanya pencahayaan pada objek yang

Agar diperoleh berbagai tingkat perbesaran, setiap mikroskop biasanya dilengkapi

Penuntun Praktikum Mikrobiologi Dasar

Gambar 2. Mikroskop cahaya beserta bagian-bagiannya

Penuntun Praktikum Mikrobiologi Dasar

Gambar 3. Mikroskop stereo

Penuntun Praktikum Mikrobiologi Dasar

1. Menyebutkan nama dan fungsi bagian-bagian mikroskop

PEMBUATAN PREPARAT KERING

Penuntun Praktikum Mikrobiologi Dasar

Mengamati specimen dengan perbesaran kuat

PEMBUATAN PREPARAT BASAH

Penuntun Praktikum Mikrobiologi Dasar

Bersihkan kelebihan larutan pada gelas objek dengan menghisap kelebihannya

Penuntun Praktikum Mikrobiologi Dasar

Penuntun Praktikum Mikrobiologi Dasar