LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI FARMASI

PRAKTIKUM 2
ISOLASI PLASMID

Islamic Technopreneur University

Nama : Pramudia Putra Muhawandi

NIM : 200106143
Kelompok : 4 Farmasi D

Hari/Tanggal Praktikum : Jumat, 23 Desember 2022

Dosen Pengampu : apt. Anis Puji Rahayu, M.Si.

PROGRAM STUDI FARMASI

UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH BANDUNG

2022
I. Tujuan
Mengidentifikasi sifat dan struktur DNA plasmid melalui proses isolasi terhadap
DNA plasmid.

II. Prinsip
Isolasi plasmid berdasarkan pemisahan komponen sel dan DNA genom dengan
DNA plasmid berdasarkan berat molekulnya, kontamin dapat dihilangkan dengan cara
melarutkan plasmid dalam etanol dengan sentrifugasi (Dash, 2015).
Netralisasi berdasarkan dengan penambahan asam atau basa agar Kembali
kedalam suasana netral, proses netralisasi dilakukan untuk menghasilkan kondisi
pengikatan DNA (Mujayana dkk, 2015).
Resuspensi dilarutkannya dengan melarutkan kembali sel setelah proses
sentrifugasi sehingga suatu proses terlepas kembali partikel-partikel dari larutann yang
dapat melarutkan kembali zat-zat pencemar yang terakomulasi dalam larutan (Van et
al, 2012).
Elusi yaitu melepaskan ikatan DNA berdasarkan elusi menggunakan elution
buffer. Proses pemisahan fragmen DNA target dari campuran fragmen-fragmen DNA
pengotornya (Sunden, 2012).
Lisis yaitu pecahnya suatu membran sel akibat beberapa faktor, membran sel
dirusak oleh suatu cairan zat dirusak dengan gelombang frekuensi tinggi saat didalam
fase istirahat (Ma’at, 2019).

III. Alat dan Bahan

3.1. Alat

No Nama Alat Gambar Kegunaan

1. Bio Safety Tempat perlindungan

Cabinet bagi pengguna,
(BSC) menjaga lingkungan
agar terbebas dari
mikroba

2. Conical Tube Menampung bahan

yang akan diendapkan
dalam mesin
sentrifugate
3. Inkubator Untuk mengingkubasi
suatu bakteri agar
dapat hidup pada suatu
media atau subtrat

4.. Kolom PD Digunakan sebagai

tempat menyimpan
sampel

5. Loop Digunakan untuk

menginokulasikan
bakteri

6. Mikro Pipet Untuk memindahkan

larutan atau cairan dari
satu tempat ke tempat
lainnya,tetapi untuk
volume yang sangat
 keci (dibawah 1,0 ml)

7. Mikro Tube Digunakan sebagai

tempat menyimpan
sampel

8. Sentrifuga Untuk memisahkan

pelet dengan substansi
dari sampel cair,seperti
cairan immiscible

9. Tip Digunakan untuk

mengambil campuran
atau larutan

10. Tabung Penampung Digunakan sebagai

tempat untuk
mengkultur bakteri

3.2. Bahan

No Nama Bahan Precaution Kegunaan

1. Antibiotik Mengiritasi Digunakan sebagai

antibiotik selektif

2. Elution Buffer Mengiritasi Digunakan untuk

menyeimbangkan pH

3. Etanol Absolut Mudah menyala, dan Digunakan sebagai

dapat mengiritasi mata bahan tambahan
washing buffer
 4. PD 1 Buffer Mengiritasi Digunakan untuk
menyeimbangkan pH

5. PD 2 Buffer Mengiritasi Digunakan untuk

menyeimbangkan pH

6. PD 3 Buffer Mengiritasi Digunakan untuk

menyeimbangkan pH

7. RNAse A Mengiritasi mata dan Digunakan sebagai

kulit enzim untuk
mengkatals degradasi
RNA

8. Wash Buffer Mengiritasi Digunakan untuk

menyeimbangkan pH

9. Media LB - Digunakan sebagai

media kultur

IV. Prosedur (Paragraf, Bagan Alir, perhitungan)

4.1. Kultur

Dipilih suatu koloni dari cawan selektif yang baru digores, kemudian
diinokulasi kultur starter dengan 2-5 ml media LB yang mengandung antibiotik
selektif yang sesuai. Dan diinkubasi selama kurang lebih 12-16 jam pada suhu 37oC
dengan pengocokan yang kuat (kurang lebih 300 rpm). Digunakan tabung atau labu
dengan volume minimal 4 kali volume kultur.

4.2. Isolasi Plasmid

4.2.1. Penyiapan PD 1 Buffer

Ditambahkan RNase A ke PD 1 buffer, kemudian campur dengan cara

diguncang selama beberapa detik. Kemudian centang kotak dibotol, dan simpan
campuran PD 1 dan RNase A pada 2-80 C hingga 6 bulan.
4.2.2. Penyiapan Wash Buffer

Etanol absolut ditambahkan ke dalam wah buffer sebelum penggunaan

pertama.

4.2.3. Panen Sel

1,5 ml kultur sel ditransfer ke dalam mikrotube. Mikro tube berisi

kultur sel disentrifugasi pada 14-16.000 xg selama 1 menit. Supernatan yang
dihasilkan dari sentrifugasi kemudian dibuang.

4.2.4. Resuspensi

200 mikro liter PD1 buffer ditambahkan ke dalam tabung. Pelet sel
yang telah ditambahkan PD2 buffer diresuspensi menggunakan vortex mixer.

4.2.5. Lisis

200 mikro liter PD2 buffer ditambahkan lalu dicampur dengan cara
membalik tabung sebanyak 10 kali. Campuran didiamkan pada suhu ruang
selama kurang lebih 2 menit (tidak boleh lebih dari 5 menit).

4.2.6. Netralisasi

Ditambahkan 300 mikro liter PD3 buffer lalu diaduk segera dengan
membalik tabung sebanyak 10 kali. Setelah itu campuran disentrifuga pada 14-
16.000 xg selama 3 menit.

4.2.7. DNA-Binding

Kolom PD diltakkan pada wadah penampung, lalu supernatan dari

langkah sebelumnya ditambahkan pada kolom PD tersebut dan disentrifugasi
14-16.00 xg selama 30 detik. Supernatan pada wadah penampung dibuang,
lalu kolom PD dimasukkan kembali ke dalam tabung penampung.

4.2.8. Pencucian

600 mikro liter wash buffer ke dalam kolom PD lalu disentrifugasi

pada 14-16.000 xg selama 30 detik. Supernatan yang terbentuk dibuang lalu
kolom PD diletakkan kembali pada wadah penampung.
 4.2.9. Pengeringan

Endapan pellet di sentrifugasi pada 14-16.000 xg selama 3 menit untuk

mengeringkan plasmid kolom. Tabung penampung dibuang, lalu kolom PD
dimasukkan ke dalam mikro tube 1,5 ml yang baru.

4.2.10. Elusi

Ditambahkan 50 mikro liter elution buffer pada bagian tengah matriks

kolom PD. Lalu didiamkan selama minimal 2 menit lalu disentrifugasi pada
14-16.000 xg selama 2 menit.

V. Hasil Pengamatan
5.1. Hasil Isolasi Plasmid dengan Elektroforesis

Gambar 1. Hasil isolasi plasmid dengan

elektroforesis

5.2. Kurva Sentrifugasi

 Gambar 2. Kurva Sentrifugasi

VI. Diskusi dan Pembahasan

6.1. Diskusi
6.1.1 Apa tujuan dari isolasi plasmid
Jawab : Untuk mengisolasi DNA plasmid dan untuk mengetahui cara
isolasi DNA dengan benar dan efisien
6.1.2 Jelaskan tahapan secara umum dari isolasi plasmid
Jawab : Secara umum, tahapannya meliputi pemanenan sel dengan
sentrifugasi, resuspensi sel dengan buffer TE dan buffer lisis I, lisis sel
dengan buffer lisis II, netralisasi dengan buffer lisis III dan pemisahan
DNA plasmid dengan DNA genom dan komponen sel menggunakan
sentrifugasi. Berikutnya DNA plasmid dipisahkan dengan kontaminan
protein dan dicuci dengan etanol 70% (v /v) dingin, kemudian DNA
plasmid disimpan dalam larutan buffer TE.
6.1.3 Jelaskan fungsi masing masing reagen dan kandungannya
Jawab :
a. PD 1 : Reagen yang digunakan pada langkah pertama isolasi
plasmid Komposisi : 50 glukose, 25 MM tris. Cl pH 8 dan mM EDTA
 Glukose berfungsi untuk menjaga osmolaritas dan menjaga buffer untuk
memecahkan sel bakteri
EDTA berfungi untuk menjaga pH selama penumbuhan reagen lain
b. PD 2 :
Komposisi : 200 mM NaOH dan sodium Dodesil sulfat (sds) 1% b/v
NaOH digunakan untuk memisahkan DNA genom dan berfungsi untuk
mengikat protein-protein sel.
c. PD 3
Komposisi : Potasium asetat dan asam asetat glasial
Potasium asetat berfungsi untuk mengendapkan DNA genom dan
komponen selular bakteri. Selain itu, potasium asetat juga dapat mengikat
SDS menjadi potasium dodesil sulfat sehingga kontaminan protein dapat
lebih mudah dibuang.
Asam asetat dapat menetralkan medium sehingga DNA plasmid dapat
terdenaturasi
d. Wash Buffer : Untuk mencuci DNA dari pengotor
Komposisi : NaCl, kalium, KCl hingga tween 20 larutan ini tercampur dan
mengalami proses deionisasi. Deionisasi merupakan metode pemurnian air
untuk mencuci DNA dari pengotor
e. Elution buffer : untuk memberikan protein yang tidak terikat pada
awalnya dan pada konsentrasi yang lebih besar melepaskan protein yang
diinginkan ligan
f. Rnase : untuk mengikat RNA yang termasuk dalam pengotor

6.1.4 Jelaskan maksud dari 14-16000 xg dan mengapa harus diatur dengan
kecepatan tersebut?
Jawab : dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 14-16000 xg agar larutan
menjadi homogen dan DNA tidak rusak
6.1.5 Jelaskan metode apa saja yang dapat digunakan untuk isolasi plasmid (
alkaline, boiling, lithium )
Jawab :
 Metode Alkaline lysis
 Metode lisis alkali merupakan metode yang sangat umum untuk
isolasi plasmid karena mudah dilakukan, relatif murah, dan
resprodusibilitas. Metode ini dapat dilakukan dalam 50 menit sampai 1 jam

 Metode Boiling lysis

Kelemahan metode lisis pemanasan adalah beberapa E.coli seperti

HB101t selnya tidak dapat dilisis dengan pemanasan

 Metode lithium lysis

Metode ini menggunakan sesium klorida yang sangat mahal,

korosif, toksis, dan memerlukan waktu yang sangat lama sehingga metode
ini jarang digunakan

 Metode kit

Kit ini menggunakan kolom kromatografi sekali pakai untuk

mengabsorpsi plasmid. Matriks yang digunakan beragam antara lain gelas
resin anion. Isolasi plasmid menggunakan kit relatif lebih mudah tetapi
mahal jika dilakukan secara rutin (Sato et. al., 2012)

6.1.6 Bagaimana cara penyimpanan plasmid hasil isolasi?

Jawab : Pada penyimpanan isolasi plasmid terdapat berbagai cara,
diantaranya adalah sub kultur dan teknik kriopresevasi. Sub kultur
dilakukan dengan memindahkan bakteri secara berkala pada media baru.
Teknik kriopresevasi dilakukan dengan penyimpanan pada suhu yang
sangat rendah (-1960C).

6.1.7 Jelaskan perbedaan prosedur isolasi plasmid dengan low copy number
dan high copy number?
Jawab : Perbedaan dari keduanya ialah berbeda dari jumlh plasmid yang
dihasilkan. pada low copy number plasmid memiliki kemampuan replikasi
rendah sehingga dalam suatu sel hanya mengandung satu atau beberapa
plasmid yang sama. sedangkan high copy number plasmid memiliki
kemampuan replikasi tinggi sehingga dalam sutu sel mengandung banyak
plasmid yang sama, bahkan hingga mencapai ribuan
 6.1.8 Jelaskan perbedaan isolasi plasmid kromosom
Jawab : Pada high copy plasmid, plasmid mampu bereplikasi sekitar 700
molekul plasmid per sel inang, sedangkan pada low copy plasmid, plasmid
hanya mampu bereplikasi sampai satu molekul plasmid per sel inang

6.2. Pembahasan

Pada percobaan kali ini yaitu dilakukan percobaan isolasi plasmid, tujuan
dilakukannya percobaan kali ini yaitu dapat memahami cara dan prinsip isolasi materi
genetik. Plasmid adalah molekul DNA ekstrachromosomal yang dapat mereplikasi
diri dan ditemukan di hampir semua spesies bakteri. Terdapat variasi plasmid
berdasarkan struktur, ukuran, cara replikasi, jumlah salinan per sel bakteri, dan
transferabilitas antar spesies bakteri. Isolasi plasmid dilakukan berdasarkan pemisahan
komponen sel dan DNA genom dengan DNA plasmid berdasarkan berat molekulnya.
Kontaminan dapat dihilangkan dengan cara melarutkan plasmid dalam etanol dan
diendapkan dengan sentrifugasi. Plasmid dapat dipuripikasi lebih lanjut menggunakan
filtrasi gel. ( Das dan Dash, 2015 )

Langkah pertama yakni kultur sel, Dipilih satu koloni dari cawan selektif yang
baru digores dan diinokulasi kultur starter dengan 2–5 ml media LB yang
mengandung antibiotik selektif yang sesuai. Kemudian diinkubasi selama kurang
lebih 12-16 jam pada suhu 37 ° C dengan pengocokan yang kuat (kurang lebih 300
rpm). Lalu digunakan tabung atau labu dengan volume minimal 4 kali volume kultur.
Ditambahkan RNase A ke PD1 Buffer kemudian dicampur dengan cara diguncang
selama beberapa detik. Dicentang kotak di botol. Lalu disimpan campuran PD1 dan
RNase A pada 2- 8ºC hingga 6 bulan. Ditambahkan etanol absolut ke Wash Buffer
sebelum penggunaan pertama. Langkah selanjutnya yakni panen sel, ditransfer 1,5 ml
kultur sel ke mikrotube. Di sentrifuga tabung pada 14-16.000 xg selama 1 menit
kemudian dibuang supernatan. Jika menggunakan lebih dari 1,5 ml kultur sel bakteri,
diulangi tahapan panen sel.

Kemudian dilakukan resuspensi dengan PD1 Buffer yang mengandung Tris pH

8, agen pengkelat EDTA, glukosa RNAse A. RNAse merupakan suatu enzim untuk
memotong RNA. Kemudian suspensi dari PD1 Buffer ini dilisis menggunakan PD2
Buffer yang mengandung alkali. Alkalinya adalah NaOH dan SDS (Sodium Dodecyl
Sulfat) pada pH 12. Kemudian dilakukan homogenasi dengan cara membolak balikan
tabung sebanyak 10 kali, karena akan mengisolasi plasmid berbentuk DNA maka jika
divortex DNA akan hancur. Kemudian didiamkan selama 2 menit pada suhu kamar,
tujuannya agar PD2 Buffer bekerja. Didiamkan hingga lisat jernih. Lisat jernih
menunjukan lisis sel yang berjalan dengan sempurna. Setelah itu dilakukan netralisasi
karena pH tinggi, dilakukan netralisasi dengan menggunakan larutan PD3 Buffer. PD3
Buffer mengandung Asam asetat dengan pH 5,4 dihomogenkan kembali dengan
dibolak-balik sebanyak 10 kali. Pada tahap ini akan terbentuk dua lapisan terpisah,
lapisan ini harus dipisah. Untuk mengoptimalkan bagian lapisan terlarut dan tidak
terlarut dilakukan sentrifugasi selama 3 menit. Kemudian dilakukan sentrifugasi
sampai kondisi pemisahan berlangsung sempurna antara bagian terlarut dan tidak
terlarut.

Selanjutnya dilakukan pengikatan DNA, disediakan tabung penampung.

Supernatant dari hasil netralisasi yang mengandung DNA plasmid di transfer ke
kolom PD. Kolom PD diletakkan pada tabung penampung. Kolom PD berfungsi
untuk mengikat DNA/ untuk menyaring. Disentrifugasi dan DNA plasmid akan terikat
pada kolom PD lalu cairan pada tabung penampung dibuang. Kemudian dilakukan
pencucian pengotor yang tidak terikat kuat pada kolom dengan menggunakan Wash
Buffer. Wash buffer mengandung etanol absolut yakni etanol 99,96%. Setelah dicuci,
dikeringkan kolom dengan sentrifugasi kembali. Lalu dielusi DNA plasmid yang
sudah terikat pada kolom PD dengan menggunakan 50 μl Elution Buffer. Ditempatkan
pada bagian tengah matriks kolom PD, kemudian didiamkan selama 2 menit agar
terabsorbsi sempurna pada matriks kolom. Jika tidak didiamkan dulu nanti tidak akan
terelusi semua DNA yang terikat pada kolom.

Terakhir dielusi dengan disentrifugasi, tabung penampung diganti dengan

mikrotube 1,5 mL. Dan didapatkan lah hasil isolate plasmid yang sudah murni.
Metode penyimpanan plasmid hasil isolasi adalah dengan menggunakan freezer yang
dapat digunakan untuk amplifikasi DNA. Perlakuan penyimpanan freezer memiliki
smear (kotoran) paling sedikit pada visualisasi pita DNA menggunakan BDA (Bio
Doc Analysis). Metode penyimpanan sampel untuk pemeriksaan DNA, yakni
menggunakan wadah tabung yang perlu disimpan dalam freezer dengan suhu -20°C
untuk mempertahankan kualitas dari DNA (Faatih, 2016)
 Pada hasil studi kasus yang diberikan didapatkan hasil pada sampel :

1 = Predominantly dimer of the plasmid

2 = Monomer linear

3 = Plasmid isolation result

4 = Monomer of the plasmid

5 = 1kb ladder.

Pada hasil elektroforesis tersebut, hasil isolasi plasmid ditunjukkan pada

jalur 3 yaitu plasmid isolation result. Dikarenkan terdapat 2 noda pada hasil
elektroforesis tersebut.

Hasil isolasi plasmid yang diperoleh dipisahkan menggunakan

elektroforesis terdapat 4 sampel hasil isolasi dari plasmid yang sama yaitu linear,
open circular, supercoiled,monomer dimer dan tetramer. Linear merupakan DNA
yang memiliki ujung bebas. Bisa jadi karena kedua strand telah dipotong atau
karena DNA linear in-vivo. Supercoiled ini dimana DNA memiliki kedua strand
yang tidak terpotong, samas, skali dengan pilihan yang terintegrasi yang
menghasilkan bentuk yang kompak. Open circular merupakan DNA yang
memiliki satu strand yang dipotong. Monomer dimer yang memiliki bentuk
seperti super coiled namun memiliki area yang tidak berpasangan yang
membuatnya menjadi kurang kompak. Tetramer merupakan DNA yang memiliki
bentuk sirkular tidak terpotong, sama sekali strandnya. Adapun faktor yang
mempengaruhi jumlah dan kualitas plasmid hasil isolasi/ keberhasilan
transformasi dengan konsentrasi DNA, konsentrasi antibiotic, dan kompetensi sel.
Konsentrasi DNA yang rendah memungkinkan koloni tidak dapat tumbuh.
Konsentrasi DNA dipertahankan pada tingkat 1-10μg. Konsentrasi antibiotik yang
sesuai dengan jenis vektor memungkinkan koloni dapat tumbuh pada media. Sel
dibuat kompeten dengan menambahkan larutan CaCl2 (Kalsium Klorida) yang
berfungsi mengganggu keseimbangan kalsium dalam membran sehingga
membran berhasil terbuka.
VII. Kesimpulan
7.1. Berdasarkan hasil dari percobaan kali ini, isolasi plasmid dapat dilakukan
dengan berbagai cara, metode yang dapat digunakan untuk isolasi plasmid
DNA ada tiga yaitu penghancuran (lisis), ekstraksi atai pemisahan DNA dari
bahan padat seperti selulosa dan protein serta pemurnian DNA.
7.2. Prinsip isolasi DNA pada berbagai jenis sel atau jaringan pada berbagai
organisme pada dasarnya sama namun memiliki modifikasi dalam hal teknik
dan bahan yang digunakan. Bahkan beberapa teknik menjadi lebih mudah
dengan menggunakan kit. Kit isolasi plasmid yang digunakan pada praktikum
ini adalah GeneAid High-Speed Plasmid Mini Kit. Isolasi plasmid dilakukan
dengan menggunakan metode alkaline lysis yang secara garis besar terbagi ke
dalam enam tahap, yakni tahap kultivasi bakteri dan pemanenan sel, tahap
resuspensi sel, tahap lisis sel dan denaturasi DNA, tahap netralisasi, tahap
purifikasi, dan tahap pemekatan DNA.
 Daftar Pustaka

Das, S. Dan Dash, H. 2015. Microbial Biotechnology – a Laboratory Manual For Bacterial
Systems. Springer : New Delhi. Hal 12 – 72

Ma`at S. 2019. Teknik Dasar Kultur Sel. Pusat Penerbitan Dan Percetakan Unair (AUP)

Mujayana Dan Nurjanna. 2015. Teknik Isolasi DNA Plasmid Dari Bakteri Terkonstruksi Gen
Antivirus PmAV. Bul,. Tek. Cit. Akuakultur Vol 13 (1) : 67 -71

Sato M, Akasaka E, Saitoh I, Ohtsuka M, Nakamura S, Sukarai T, Watanabe S (2012). A

simplified protocol for the semilarge scale recovery of plasmids from
Escherichia coli grown on agar plates. J Biomed Sci Eng 5 : 406-408

Sinden, R.R 2012. DNA Structure and Function. Academic Press, California.
Halaman : 95 – 133

Van De Craen B, Declerck Pj, Gils A 2012. The Biochemistry, Physiology And Pathologeical
Roles Of PAI -1 And The Requirements For PA1 Inhibition In Vivo.
Thrombosis Research. Dol : 10.1016