LAPORAN PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI FARMASI
ISOLASI, IDENTIFIKASI, KONTRA INDIKASI
DAN PEWARNAAN GRAM

Disusun Oleh:

Kelompok 4B
Yunita Suleman (180106072)
Jum’at,03 Januari 2020

DOSEN PENGAMPU :
Anis Puji Rahayu, S.Farm., M.Si., Apt.

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH BANDUNG
2019
I. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang

Identifikasi dan determinasi suatu biakan murni bakteri yang diperoleh dari hasil isolasi
dapat dilakukan dengan cara pengamatan sifat morfologi koloni, morfologi sel bakteri, pengujian
sifat-sifat fisiologi dan biokimianya. Pertumbuhan bakteri di alam dipengaruhi oleh beberapa
faktor luar seperti susbtrat, pertumbuhan , pH, temperatur, dan bahan kimia. Bakteri yang nampak
dapat memiliki morfologi yang sama, namun keperluan nutrisi dan persyaratan ekologinya
berbeda.

Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis mikrobadengan mikroba lainnya
yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba. Hal inidapat dilakukan dengan
menumbuhkannya dalam media padat sel-sel mikroba akanmembentuk suatu koloni sel yang tetap
pada tempatnya .

Pentingnya mengisolasi suatu mikroba dari lingkungan kita seperti pada diri kita sendiri
karena banyaknya mikroba / bakteri yang sulit untuk diamati atau dibedakan secara langsung oleh
panca indera. Sehingga dengan isolasi akan mempermudah kita untuk melihat dan mengamati
bentuk-bentuk pertumbuhan mikroba pada beberapa medium yang berbeda-beda serta melihat
morfologi dari mikroba.

Infeksi saluran kemih adalah salah satu penyakit saluran kemih yang dilalui urin. Infeksi
saluran kemih merupakan penyakit nomor dua paling banyak yang menyerang manusia tiap
tahunnya. Saat urin akan melewati saluran kemih maka jalur yang dilaluinya berurutan
sebagaimana posisi dari atas ke bawah, yaitu ginjal, ureter, vesika urinaria (kantung kemih) serta
uretra. Infeksi saluran kemih diakibatkan oleh bakteri atau kuman yang masuk ke dalam saluran
kencing yang dapat masuk dari luar, misalnya dari air ketika membersihkan sehabis buang
air. (Budiarti, T. 2007 )

Bakteri mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas. Bakteri merupakan
mikroorganisme yang berukuran mikroskopik. Selain mikroskopik, bakteri juga hampir tidak
berwarna atau transparan dan kontras dengan air. Sehingga melihat dan mengamati bakteri dalam
kedaan hidup sangat sulit. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik
 pewarnaan sel bakteri. Ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-
penelitian mikrobiologi. Hal itu untuk mempermudah proses identifikasi bakteri.

Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram
tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negatif ditandai dengan
pewarnaan ungu sedangkan yang positif berwarna merah. Hal ini bertujuan untuk memberikan
warna pada bakteri pada akhirnya dapat diidentifikasi dengan mudah. Selain itu, ada endospore
yang bisa diwarnai. Endospora adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena
kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi
menjadi baik (Rudi, 2010).

Pada praktikum proses pewarnaan gram olesan bakteri yang terfiksasi dikenai larutan-
larutan berikut dalam urutannya yaitu ungu kristal, larutan yodium, alkohol (bahan pengecat), dan
safranin atau beberapa pewarna tandingan lain yang sesuai. Bakteri yang diwarnai dengan metode
gram ini dibagi menjadi dua kelompok. Salah satu di antaranya, bakteri gram positif,
mempertahankan zat pewarna ungu kristal. Di gunakan untuk pengecatan differensial,
menggunakan beberapa jenis zat, di gunakan untuk mengelompokkan bakteri, seperti pengecatan
gram atau pengecatan acid-fast, bakteri gram negatif, kehilangan ungu kristal ketika dicuci dengan
alkohol, dan sewaktu diberi pewarna tandingan dengan warna merah safranin, tampak berwarna
merah(Pelczar dan Chan, 1986).

1.2 Tujuan

1. Menentukan tatacara mengisolasi bakteri sehingga dapat mendapatkan biakan mumi.

2. Menentukan metode isolasi, indentifikasi, dan konfirmasi mikroba.
3. Menentukan ciri-ciri koloni mikroba yang tumbuh.
4. Menetukan langkah-langkah pembuatan preparat oles dan teknik pewarnaan pada
bakteri.
5. Menentukan perbedaan bakteri gram negatif dan bankteri gram positif.

II. TINJAUAN PUSTAKA

Isolasi mikroba ialah memisahkan mikrobia tersebut dari lingkungannya di alam dan
menumbuhkannya sebagai biakan murni dalam medium buatan. Isolasi harus diketahui cara-cara
menanam dan menumbuhkan mikrobia pada medium biakan serta syarat-syarat lain untuk
pertumbuhannya. Memindahkan bakteri dari medium lama kedalam medium yang baru diperlukan
ketelitian dan pengsterilan alat-alat yang digunakan, supaya dapat dihindari terjadinya
kontaminasi. Pada pemindahan bakteri dicawan petri setelah agar baru, maka cawan petri tersebut
harus dibalik, hal ini berfungsi untuk menghindari adanya tetesan air yang mungkin melekat pada
dinding tutup cawan petri (Lay,1994).

Umumnya prinsip dari isolasi bakteri adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan
mikroba lain yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan
dengan menumbuhkannya dalam media padat, sel-sel mikroba akan membentuk koloni sel yang
tetap pada tempatnya. Dikenal beberapa cara atau metode untuk memperoleh biakan murni dari
suatu biakan campuran. Dua diantaranya yang paling sering digunakan adalah metode cawan gores
dan metode cawan tuang. Yang didasarkan pada prinsip pengenceran dengan maksud untuk
memperoleh spesies individu. Dengan anggapan bahwa setiap koloni dapat terpisah dari satu jenis
sel yang dapat diamati. Biakan murni diperlukan dalam berbagai metode mikrobiologis, antara lain
digunakan dalam mengidentifikasi mikroba. Untuk mengamati ciri-ciri kultural morfologi,
fisiologi dan serologi dibutuhkan mikroba yang berasal dari satu spesies ( Lay,1994 ).

ada dua metode yang dilakukan untuk memperoleh biakan murni yaitu ( Dwidjiseputro,1990) :

1. Metode cawan gore

Metode ini mempunyai dua keuntungan, yaitu menghemat bahan dan waktu. Metode
cawan gores yang dilaksanakan dengan baik kebanyakan akan menyebabkan terisolasinya
mikroorganisme yang diinginkan. Namun untuk memperoleh hasil yang baik pada metode
ini diperlukan keterampilan yang lumayan yang biasanya diperoleh dari pengalaman. Metode
cawan gores yang dilaksanakan dengan baik kebanyakan akan menyebabkan terisolasinya
mikroorganisme seperti yang diinginkan.
2. Metode cawan tuang

Cara lain untuk memperoleh koloni murni dari populasi campuran mikroorganisme
adalah dengan mengencerkan spesimen dalam medium agar yang telah dicairkan dan
didinginkan ( ±50℃) yang kemudian dicawankan. Karena konsentrasi sel-sel mikroba di
dalam spesimen pada umunya tidak diketahui sebelumnya, maka pengenceran perlu dilakukan
 beberapa tahap sehingga sekurang-kurangnya satu di antara cawan tersebut mengandung
koloni terpisah di atas permukaan ataupun di dalam agar. Metode ini memboroskan bahan dan
waktu namun tidak memerlukan keterampilan yang tinggi.

sifat-sifat koloni yang tumbuh pada agar-agar lempengan, pada agar-agar miring dan pada
tusukan gelatin adalah sebagai berikut(Ratnasari,1990) :

1. Sifat-sifat koloni pada agar-agar lempengan mengenai bentuk, permukaan dan tepi. Bentuk
koloni dilukiskan sebagai titik-titik, bulat berbenang, tak teratur, serupa akar, serum
kumparan. Permukaan koloni dapat datar, timbul mendatar, timbul melengkung, timbul
mencembung, timbul membukit dan timbul berkawah. Tepi koloni ada yang utuh, ada yang
berombak, ada yang berbelah-belah, ada yang bergerigi, ada yang berbenang-benang dan
ada yang keriting.
2. Sifat-sifat koloni pada agar-agar miring. Sifat ini berkisar pada bentuk dan tepi koloni dan
sifat itu dinyatakan dengan kata-kata seperti : serupa pedang, serupa duri, serupa tasbih,
serupa titik-titik, serupa batang dan serupa akar.
3. Sifat koloni tusukan dalam gelatin. Ada bakteri yang dapat mengencerkan gelatin. Karena
itu, maka bentuk-bentuk koloninya juga berbeda-beda. Lagipula bentuk koloni yang tidak
dapat mengencerkan gelatin. Bila dilihat dari samping koloni yang tidak mengencerkan
gelatin dapat serupa pedang, tasbih, bertonjol-tonjol dan berjonjot. Jika bakteri mampu
mengencerkan gelatin, maka bentuk koloninya dapat serupa kawah, serupa mangkuk,
serupa corong, pundi-pundi dan berlapis.

Dialam populasi mikroba tidak terpisah sendiri menurut jenisnya, tetapi terdiri dari
campuran berbagai macam sel. Di dalam laboratorium populasi bakteri ini dapat diisolasi menjadi
kultur murni yang terdiri dari satu jenis yang dapat dipelajari morfologinya, sifat dan kemampuan
biokimiawinya. Dalam mempelajari mikroba tidak bias dilakukan secara kasat mata. Sedangkan
dalam suatu lokasi yang menurut manusia sudah cukup kecil, disanan masih terdapat bakteri dalam
jumlah besar dan juga bermacam–macam jenisnya. Selain itu, di alam mikrobia pada umumnya
tidak hidup tersendiri sebagai individu tunggal dan terlepas dari spesies yang lain, Mikroba lebih
sering ditemukan dalam bentuk koloni dan bersama-sama dengan mikroba yang lain
(Pelczar,1986).s
 Mikroorganisme terdapat dimana-mana didalam lingkungan kita mereka ada pada tubuh
kita, didalam tubuh kita, dan disekeliling kita. Mereka merupakan komponen penting dalam
ekosistem. Dihabitat alamiahnya, mereka hidup dalam suatu komunitas yang terdiri dari berbagai
jenis mokroorganisme, bersama spesies-spesies biologi lainnya. Didalam komunitas ini, satu
spesies mikroba dapat mempengaruhi spesies lain dengan berbagai cara-cara beberapa bersifat
menguntungkan beberapa merugikan. Oeh karena itu, dalam mempelajarinya, bakteri harus
diambil dari alam lalu diisolasikan dalam suatu biakan murni. Biakan murni adalah biakan yang
hanya berisi 1 jenis bakteri ( Hadioetomo,1993).

Untuk memastikan mikrobia yang diisolasi telah berupa biakan murni dan sesuai dengan
yang dimakudkan maka diperlukan pengujian. Uji yang bisa digunakan adalah dengan cara
pengecatan gram. Apabila bakteri tidak berubah maka bakteri yang diisolasi sudah merupakan
biakan murni dan bila di dalam uji pengecatan gram berubah bakteri gramnya maka isolasi tidak
berhail karena belum berubah menjadi biakan murni.Hal ini mungkin disebabkan karena adanya
kontaminan di dalam isolasi bakteri (Subandi, 2009).

Pada saat isolasi, mikroba perlu dilakukan inokulasi mikroba.Sebelum dan sesudah
menginokulasikan mikroba jarum ose yang digunakan harus dipanaskan terlebih dahulu.Hal ini
bertujuan agar jarum ose yang digunakan bersifat steril dan bebas kontaminasi dari
mikroorganisme yang tidak diinginkan.Sedangkan pada cawan petri, setelah sampel dimasukan ke
dalam cawan petri setiap membuka dan menutup cawan petri harus terlebih dahulu dipanaskan
untuk meminimalkan terkontaminasinya sampel.Wadah media yang menggunakan cawan petri,
pada saat inkubasi mikroba pada cawan petri selalu dalam posisi terbalik.Hal ini dimaksudkan
untuk mencegah mikroba terkena uap air yang dihasilkan pada saat inkubasi, sehingga kualitas
mikroba tidak rusak atau mengalami gangguan(Waluyo, 2005).

Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak mengadsorpsi

ataupun membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk
mewarnai mikroorganisme ataupun latar belakangnya. Zat warna mengadsorpsi dan membiaskan
cahaya sehingga kontras mikroorganisme disekelilingya ditingkatkan. Penggunaan zat warna
memungkinkan pengamatan struktur sel seperti spora dan bahan infeksi yang mengandung zat pati
dan granula fosfat. Pewarnaan yang digunakan untuk melihat salah satu struktur sel disebut
pewarnaan khusus. Sedangkan pewarnaan yang digunakan untuk memilahkan mikroorganisme
disebut pewarnaan diferensial yang memilahkan bakteri menjadi kelompok gram positif dan gram
negatif. Pewarnaan diferensial lainnya ialah pewarnaan ziehl neelsen yang memilihkan bakterinya
menjadi kelompok-kelompok tahan asam dan tidak tahan asam (Dwidjoseputro.1998).

Pengenalan bentuk mikroba (morfologi), kecuali mikroalgae harus dilakukan pewarnaan

terlebih dahulu agar dapat diamati dengan jelas. Pada umumnya bakteri bersifat tembus cahaya,
hal ini disebabkan karena banyak bakteri yang tidak mempunyai zat warna (Waluyo, 2004).

Tujuan dari pewarnaan adalah untuk mempermudah pengamatan bentuk sel bakteri,
memperluas ukuran jazad, mengamati struktur dalam dan luar sel bakteri, dan melihat reaksi jazad
terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik atau kimia jazad dapat diketahui (Hadiutomo.
1990).

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan
spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat
kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya,
ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada
tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae (Aditia,
2010).

Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu
pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu
gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan
Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat
semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna
untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel
mereka.

a. Bakteri Gram Negatif

Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu
pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap
setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak.
 b. Bakteri Gram Positif

Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu
proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop,
sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua
jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Aditya,2010).

Metode-metode dalam pewarnaan gram :

Prosedur pewarnaan gram dimulai dengan pemberian pewarna basa, Kristal violet. Larutan
iodine kemudian ditambahkan, semua bakteri akan diwarnai biru pada fase ini. Sel kemudian diberi
alcohol. Sel gram positif akan tetap mengikat senyawa Kristal violet-iodine, tetap berwarna biru,
sel warna negatifwarna hilang oleh alcohol. Sebgai langkah terakhir, countersain (Mis.safranin
pewarna merah) ditambahkan, sehinnga sel gram negative yang tidak berwarna, akan mengambil
warna kontras, sedangkan sel gram positif terlihat dalam warna biru. Dasar perbedaan reaksi gram
adalah struktur dinding sel.

Pewarnaan gram memberikan hasil yang baik, bila digunakan biakan segar yang berumur 24-
48 jam. Bila digunakan biakan tua, ada kemungkinan penyimpangan hasil pewarnaan gram. Pada
biakan tua, banyak sel mengalami kerusakan pada dinding selnya. Kerusakan pada dinding sel ini
menyebabkan zat warna dapat keluar sewaktu dicuci dengan larutan pemucat. Ini berarti bahwa
bakteri gram positif dengan dinding yang rusak tidak lagi dapat mempertahankan kompleks warna
Kristal violet-iodine sehingga terlihat sebagai bakteri gram negative (Lay,1994).

III. METODE KERJA

3.1. Alat dan Bahan
3.1.1. Alat yang digunakan

No. Nama Alat No. Nama Alat

1 Almuniumfoil 8. Kertas werb
2. Bunsen 9. Mikroskop
3. Inkubator 37℃ 10. Pinset
4. Jarum ose bundar 11. Pipet tetes
5. Jarum ose lurus 12. Rak tabung reaksi
 6. Kertas lensa 13. Tabung reaksi
7. Kertas tissue

3.1.2. Bahan yang digunakan

No. Nama Bahan No. Nama Alat
1. Aquadest 8. Media TISA ( triple sugar iron agar)
2. Biakan agae miring bakteri 9. Oli imersi
3. CETA (Cetrimide agar) 10. Pereaksi indol
4. Escherichia coli (E. Coli) 11. Pereaksi metil merah
5. Metil merah 12. Pereaksi pewarnaan gram
Media IMVIC (indol, metil merah, 13. Pereaksi voges praskauer
6.
Voges proskauer, simmons sitrat
7. Media MCA (mac conkey agar)

3.1. Prosedur percobaan

3.2.1. Isolasi, identifikasi, dan konfirmasi mikroba
Sebelum dilakukan isolasi, identifikasi, dan konfirmasi mikroba alat–alat yang akan
digunakan distrelisasi dicuci bersih dan dikeringkan terlebih dahulu. Kemudian dinyalakan api
bunsen sehingga diperoleh nyala api biru untuk memperoleh daerah yang steril, nyala api
bunsen dinyalakan selama 10 menit. Disiapkan dan letakan tabung reaksi pada rak tabung reaksi
dan cawan petri steril diantara nyala dua api Bunsen. Pada saat dilakukan inokulasi suspense
pada media MCA, VJA, CETA, XLDA diinkubasi pada inkubator 37℃ selama 1 minggu dan
diamati pertumbuhan dan warna koloni yang terjadi pada setiap media.Dilakukan juga inokulasi
pada media IMVIC + TSIA, indol, metil merah, dan voges proskuer dalam media cair, sedang
pada simons sitrat merbentuk agar miting. Sedangkan TSIA merupakan kombinasi antara agar
miring dan agar tegak diinkubasi pada incubator 37℃ selama 1 minggu dan diamati
pertumbuhan dan warna koloni yang terjadi pada setiap media. Pada biakan usia 24 jam
ditambahkan 3-4 tetes pereaksi kovacs kemudian dikocok dan diamati perubahan warna yang
terjadi. Pada biakan usia 48 jam ditetskan 1-2 tetesan pereaksi metil merah kemudian dikocok
dan diamati perubahan warna yang terjadi. Dan pada biakan yang usia 48 jam juga ditambahkan
 0,5 mL larutan alfa naftol dan 1 mL larytan KOH 16% kemudian dikocok kuat dan dibiarkan
selama 10 menit pada suhu kamar kemudian diamati perubahan warna yang terjadi.

3.2.2. Pewarnaan gram

Dibersihkan kaca objek yang akan digunakan dengan mengunakan alkohol hingga bebas
lemak, kemudian diflambir tiga kali dengan cara melewatkan kaca objek pada nyala api bunsen,
berikan label pada bagian bawah kaca objek. Dibuat preparat dari biakan bakteri diwarnai
diletakan satu tetes akuades diatas kaca objek, suspensekan satu ose biakan bakteri kedalam
akuades tersebut, dan disebarkan setipis mungkin hingga membentuk lingkaran dengan
diameter kurang lebih 1 cm. Dibiarkan preparat hingga mongering diudara atau dengan cara
dihangatkan diatas nyala api bunsen, preparat yang telah kering siap digunakan untuk
pewarnaan. Diwarnai preparat atau ditetesi dengan kristal violet selama 1 menit, Dibuang warna
zat kemudian dituang kan lugol untuk membuang sisa kristal violet (Kkistal violet yang dibilas
oleh lugol), kemudian preparat ditutup dengan menggunakan larutan lugol lalu dibiarkan
selama 30 detik. Dibuang larutan lugol, preparat dibilas dengan menggunakan alcohol 96%
tetes demi tetes hingga jernih sampai tetsan terakhir alcohol. Dicuci preparat dengan
menggunakan akuades dan diwarnai dengan zat warna fukhsin selama 30 detik. Biakan kering
dibilas dengan menggunkan akuades, lalu diamati dibawah mikroskop dengan pembesaran
lensa objektif 100x dengan memakai oli imersi, kemudian dicatat warna, susunan dan bentuk
bakteri yang didapat.

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil pengamatan

Pengamatan pada Hari ke-

Media Kesimpulan
1 2 3
Mac Conkey Agar
(MCA) merupakan
suatu jenis media
MCA yang digunakan
untuk identifikasi
mikroorganisme,
Belum ada Belum ada
Belum ada pertumbuhan pertumbuhan yang merupakan
pertumbuhan bakteri pada media bakteri pada media medium kultur yang
 bakteri pada media MCA yang MCA yang dirancang untuk
MCA yang berwarna pink berwarna pink tumbuhnya bakteri
berwarna pink pudar pudar gram negative dan
pudar
noda mereka untuk
fermentasi laktosa,
serta menghambat
4 5 6 pertumbuhan
mikroorganisme
gram positif. Mac
Conkey Agar
(MAC) juga
termasuk dalam
media selektif
diferensial bagi
mikroba.
Belum ada Belum ada Belum ada
pertumbuhan pertumbuhan pertumbuhan
bakteri pada media bakteri pada media bakteri pada media
MCA yang MCA yang MCA yang
berwarnapink berwarna pink berwarna pink
pudar pudar pudar

Vlogel Johnson
1 2 3 Agar (VJA)
digunakan untuk
mendeteksi bakteri
staphylococcus
aureus, dengan
mengidentifikasi
koagulase positif
VJA dan fermentasi
manitol strain.
Belum ada
pertumbuhan Medium yang sangat
Belum ada
bakteri pada media Belum ada baik untuk
pertumbuhan
bakteri pada media VJA tetapi terjadi pertumbuhan mendeteksi
VJA yang perubahan warna bakteri pada media staphylococci
berwarna orange dari warna orange VJA yang staphylococcus
agak pucat agak pucat menjadi berwarna kuning pembawa serta studi
warna kuning yang
kepedulian sanitasi.
berwarna kuning
S. aureus
 4 5 6 mengurangi tellurite
kalium ke tellurium
logam dan
menghasilkan
pertumbuhan koloni
hitam . Fermentasi
manitol ini
ditunjukkan dengan
zona kuning
disekitar koloni
hitam dan mengubah
Belum ada Belum ada Belum ada warna merah
pertumbuhan pertumbuhan pertumbuhan menjadi kuning.
bakteri pada media bakteri pada media bakteri pada media
VJA yang VJA yang VJA yang
berwarna kuning berwarna kuning berwarna kuning

Cetrimide Agar
1 2 3 (CETA) digunakan
sebagai media
selektif untuk
isolasi Pseudomonas
aeruginosa dari
nanah, dahak dan
saluran
air. Pseudomonasae
CETA ruginosa menghasilk
an sejumlah
chelators besi yang
Belum ada Belum ada Belum ada larut dalam air,
pertumbuhan pertumbuhan pertumbuhan termask pyoverdin fl
bakteri pada media bakteri pada media bakteri pada media
uorescent kuning-
CETA yang CETA yang CETA yang
berwarna bening hijau atau kuning.
berwarna bening berwarna bening
Cetrimide agen
selektif dan
menghambat
sebagian besar
 bakteri dengan
4 5 6
bertindak sebagai
deterjen
(Cetyltrimethylamm
onium bromide,
amonium kuaterner,
deterjen kationik).

Belum ada Belum ada Belum ada

pertumbuhan pertumbuhan pertumbuhan
bakteri pada media bakteri pada media bakteri pada media
CETA yang CETA yang CETA yang
berwarna bening berwarna bening berwarna bening

Xylose
1 2 3
Lysine Deoxychollat
e (XLD) merupakan
median pertumbuhan
selektif yang
digunakan dalam
isolasi
spesies salmonella dan
shigella dari sampel
klinis dan dari
Belum ada Belum ada makanan. xylose
pertumbuhan pertumbuhan Belum ada
pertumbuhan lysine deoxychollate
bakteri pada media bakteri pada media
bakteri pada media memiliki pH sekitar
XLDA XLDA yang XLDA tetpi terjadi
XLDA yang 7,4 meninggalkannya
berwarna orange perubahan warna
berwarna merah dengan warna merah
dari warna orange
muda cerah atau
menjadi merah
merah karena
4 5 6 indikator fenol
merah. Fermentasi
gula menurunkan pH
dan indikator fenol
merah mencatat ini
dengan mengubah
menjadi
Belum ada Belum ada Belum ada kuning. Kebanyakan
pertumbuhan pertumbuhan pertumbuhan bakteri usus,
bakteri pada media bakteri pada media bakteri pada media termasuk Salmonella,
 XLDA yang XLDA yang XLDA yang dapat memfermentasi
berwarna merah berwarna merah berwarna merah gula xylose untuk
menghasilkan asam
koloni shigella tidak
dapat melakukan ini
dan karena itu tetap
merah.
1 2 3

Belum ada Belum ada Belum ada

pertumbuhan pertumbuhan pertumbuhan
bakteri warna bakteri warna bakteri warna
larutan jernih larutan jernih larutan jernih
berubah menjadi Tidak terjadi
agak kecoklatan pertumbuhan bakteri
Metil tetapi terjadi
perubahan warna
Merah
bening atau jerni
4 5 6
menjadi warna agak
kecoklatan.

Belum ada Belum ada Belum ada

pertumbuhan pertumbuhan pertumbuhan
bakteri warna bakteri warna bakteri warna
larutan agak larutan agak larutan agak
kecoklatan kecoklatan kecoklatan
 1 2 3

Belum ada Belum ada Belum ada

pertumbuhan pertumbuhan pertumbuhan
bakteri warna bakteri warna bakteri warna
larutan jernih larutan jernih larutan jernih
Tidak terjadi
Voges pertumbuhan bakteri
dan warna larutan
Proskauer 4 5 6
tetap jernih atau
bening.

Belum ada Belum ada Belum ada

pertumbuhan pertumbuhan pertumbuhan
bakteri warna bakteri warna bakteri warna
larutan jernih larutan jernih larutan jernih

1 2 3

Tidak terjadi
pertumbuhan bakteri
Indol tetapi terjadi
perubahan warna
bening atau jerni
Belum ada menjadi warna hijau.
Belum ada Beluma da
pertumbuhan pertumbuhan pertumbuhan
bakteri warna bakteri warna bakteri tetapi
 larutan berwarna larutan berwarna terjadi perubahan
bening bening warna dari bening
menjadi hijau

4 5 6

Belum ada Belum ada

Belum ada
pertumbuhan pertumbuhan
pertumbuhan
bakteri larutan bakteri larutan
bakteri larutan
berwarna hijau berwarna hijau
berwarna hijau
1 2 3

Belum ada Belum ada Belum ada

pertumbuhan pertumbuhan pertumbuhan Tidak terjadi
bakteri plat agar bakteri plat agar bakteri plat agar
Agar pertumbuhan bakteri
miting berwarna miting berwarna miting berwarna
hijau tua dan warna media
Miring hijau tua hijau tua
agar tegak tetap
hijau.
4 5 6

Belum ada
pertumbuhan Belum ada Belum ada
bakteri plat agar pertumbuhan pertumbuhan
 miting berwarna bakteri plat agar bakteri plat agar
hijau tua miting berwarna miting berwarna
hijau tua kehitaman hijau tua kehitaman

1 2 3

Sudah ada
Belum ada pertumbuhan
pertumbuhan Sudah ada bakteri dan pada
bakteri dan pada pertumbuhan plat agar tegak
bakteri dan pada Terjadi pertumbuhan
plat agar tegak terjadi perubahan
berwarna merah plat agar tegak warna merah bakteri dan terjadi
berwarna merah menjadi warna perubahan warna
Agar kunig
4 5 6 pada media dari
Tegak
warna merah
menjadi wana
kuning.

Sudah ada
Sudah ada Sudah ada pertumbuhan
pertumbuhan pertumbuhan bakteri dan pada
bakteri dan pada bakteri dan pada plat agar tegak
plat agar tegak plat agar tegak tetapi terjadi
berwarna kunig berwarna kunig perubahan warna
kunig menjadi agak
kecoklatan
 4.2. Hasil pengamatan pewarnaan gram

Gambar
bakteri

Bakteri percobaan 1 Bakteri percobaan 2

Warna Bakteri : Pink Warna Bakteri: Ungu

Deskripsi Susunan : Terdiri dari dinding sel, Susunan : Terdiri dari dinding sel,
bakteri membrane sel, ribosom, dan bagan membrane sel, ribosom, dan
genetik bagan genetik
Bentuk : Bulat seperti sekumpulan Bentuk : Bulat seperti sekumpulan
anggur anggur
Gram : Bakteri gram positif Gram : Bakteri gram positif

4.3. Pembahasan
Pada praktikm yang dilakukan kali ini yaitu isolasi, identifikasi, konfirmasi mikroba, dan
pewarnaan gram. Isolasi mikroba merupakan upaya pembiakkan suatu jenis mikroba tertentu yang
diperoleh dari suatu sampel di dalam suatu media yang spesifik, sehingga selanjutnya dapat
dilakukan identifikasi dan konfirmasi. Setiap mikroba memiliki kebutuhan akan zat pertumbuhan
yang spesifik sehingga hal ini dapat dijadikan acuan dalam pemilihan media untuk isolasi,
identifikasi dan konfirmasi. Media spesifik yaitu media yang digunakan unutk mendiagnosis atau
menganalisis metabolisme suatu mikroba. Contohnya koser’s citrate medium, yang digunakan
untuk menguji kemampuan menggunakan asam sitrat sebagai sumber karbon. Identifikasi mikroba
yaitu Untuk mengetahui sifat-sifat morfologi bakteri, maka bakteri dapat diperiksa dalam keadaan
hidup atau mati. Pemeriksaan morfologi bakteri ini perlu, untuk mengenal nama bakteri.
Disamping itu juga perlu pengenalan sifat-sifat fisiologisnya bahkan sifat-sifat fisiologis ini
kebanyakan merupakan faktor terentu dalam mengenal nama spesies suatu bakteri. Sedangkan
konfirmasi mikroba yaitu untuk mengetahui jenis bakteri dan koloninya. Konfirmasi jenis bakteri
dapat menggunakan berbagai pewarnaan, reaksi ensimatis atau reaksi biokimia, terutama jika
identifikasi menggunakan media masih meragukan atau belum memuaskan.
Pada umumnya media yang digunakan untuk membiakkan mikroba mengandung air,
sumber energi (protein dan karbohidrat), zat hara (sumber karbon, nitrogen, sulfur, fosfat, oksigen
dan hidrogen), serta faktor penunjang pertumbuhan (seperti asam amino, vitamin). Suatu media
yang memenuhi kebutuhan mikroba untuk bertahan hidup dan melakukan aktivitasnya secara
normal diperlukan untuk melakukan isolasi jenis mikroba tertentu. Setiap media spesifik memiliki
kandungan senyawa tertentu yang dapat mendukung pertumbuhan mikroba tertentu tetapi
menghambat pertumbuhan jenis mikroba lainnya. Diantaranya yaitu Media MCA ( Mac Conkey
Agar) mengandung zat warna yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri Gram Positif,
sedangkan bakteri gram negatif tetap tumbuh.
Media yang digunakan yaitu MCA (Mac Conkey Agar), Vogel Johnson Agar (VJA),
Cetrimide Agar (CA), Simmon sitrat dan Triple Sugar Iron Agar (TSIA).

Mac Conkey Agar (MCA) merupakan suatu jenis media yang digunakan untuk identifikasi
mikroorganisme, yang merupakan medium kultur yang dirancang untuk tumbuhnya bakteri gram
negative dan noda mereka untuk fermentasi laktosa, serta menghambat pertumbuhan
mikroorganisme gram positif. Mac Conkey Agar (MAC) juga termasuk dalam media selektif
diferensial bagi mikroba. Jenis mikroba tertentu akan membentuk koloni dengan ciri tertentu yang
khas apabila ditumbuhkan pada media ini. Persenyawaan utama dalam media ini ialah laktosa,
garam empedu, dan neutral red sebagai indicator warna. Media ini akan menghambat pertumbuhan
bakteri gram positif dengan adanya garam empedu yang akan membentuk kristal violet. Bakteri
gram negatf yang tumbuh dapat dibedakan dalam kemampuannya memfermentasikan laktosa.
Koloni bakteri yang memfermentasikan laktosa berwarna merah bata dan dapat dikelilingi oleh
endapan garam empedu. Endapan ini disebabkan oleh penguraian laktosa menjadi asam yang akan
bereaksi dengan garam empedu.
 Bakteri yang tidak memfermentasikan laktosa biasanya bersifat patogen. Golongan bakteri
ini tidak memperlihatkan perubahan pada media. Hal ini menyebabkan warna koloninya sama
dengan warna media. Dimana warna koloni dapat dilihat pada bagian koloni yang
terpisah. Beberapa contoh pertumbuhan koloni pada MCA, adalah sebagai berikut :

Salmonella dan Shigella : serupa media

Escherichia coli : merah dikelilingi zona keruh

Enterobacter dan Klebsiella : merah muda dan mukoid

Enterococcus dan Staphylococcus : kecil dan tidak terang tembus

Gambar 1. Media Mac Conkey Agar (MAC).

Vogel Johnson agar (VJA) digunakan untuk mendeteksi bakteri Staphylococcus

aureus, dengan mengidentifikasi koagulase-positif dan-fermentasi manitol strain. Medium yang
sangat baik untuk mendeteksi Staphylococci Staphylococcus pembawa serta studi kepedulian
sanitasi. S. aureus S. aureus mengurangi tellurite kalium ke tellirium logam dan menghasilkan
pertumbuhan koloni hitam. Fermentasi manitol ini ditunjukkan dengan zona kuning di sekitar
koloni hitam dan mengubah warna merah medium menjadi kuning.

Peptone merupakan sumber karbon, nitrogen, vitamin dan mineral. Ekstrak ragi persediaan
vitamin B-kompleks yang merangsang pertumbuhan bakteri. Manitol merupakan karbohidrat.
Penghambatan organisme nonstaphylococcal dicapai dengan kalium yang hambat untuk beberapa
spesies dari kedua gram positif dan gram negatif bakteri, oleh lithium klorida dan oleh isi glisin
tinggi. Staphylococci mungkin sedikit dihambat oleh kehadiran tiga inhibitor, namun
ini dikompensasikan dengan penambahan manitol dan glisin. Merah Fenol merupakan indikator
pH dan agar-agar yaitu agen solidifying.

Komposisi gram/liter :

1. Glycine 10.00 mL
2. Trypton 10.00 gram
3. Lithium Klorida 5.00 gram
4. Fenol Merah 0,025 gram
5. Manitol 10.00 mL
6. Fosfat Dipotassium 5.00 gram
7. Ekstrak Ragi 5.00 gram Gambar 2. Meda Vogel Johnson agar (VJA)
8. Agar bakteriologis 15.00 gram

Suspend 60 gram media dalam satu liter air suling. Aduk rata dan panas dengan agitasi
sering. Didihkan selama satu menit atau sampai medium benar-benar dibubarkan. Mensterilkan
pada 121 ° C selama 15 menit. Cool ke 45 - 50 ° C dan menambahkan 6 ml tellurite Kalium
3,5%. Aduk rata dan mengeluarkan. Untuk mempersiapkan media selektif kurang tambahkan
hanya 3 ml 3,5 tellurite% Kalium.

Cetrimide Agar (CETA) merupakan media selektif dan diferensial yang digunakan untuk
isolasi dan identifikasi Pseudomonas aeruginosa dari spesimen klinis dan non-klinis . Cetrimide
agen selektif dan menghambat sebagian besar bakteri dengan bertindak sebagai deterjen
(Cetyltrimethylammonium bromide, amonium kuaterner, deterjen kationik). Cetrimide Agar
digunakan sebagai media selektif untuk isolasi Pseudomonas aeruginosa dari nanah, dahak dan
saluran air. Pseudomonas aeruginosa menghasilkan sejumlah chelators besi yang larut dalam air,
termasuk pyoverdin fluorescent kuning-hijau atau kuning. Ketika pyoverdin bergabung
dengan pyocyanin yang larut dalam air biru , karakteristik warna hijau cerah dari Pseudomonas
aeruginosa tercipta. Intisari pankreas gelatin memberikan nutrisi yang diperlukan untuk P.
aeruginosa seperti nitrogen, vitamin, dan karbon. Penambahan magnesium klorida dan kalium
sulfat merangsang produksi pyocyanin dan pyoverdin (fluorescein). Cetyltrimethylammonium
bromide (Cetrimide) ialah agen selektif dan menghambat sebagian besar bakteri dengan bertindak
sebagai deterjen. Ketika kontak dengan bakteri, menyebabkan pelepasan nitrogen dan fosfor dari
sel bakteri selain Pseudomonas aeruginosa. Gliserol ditambahkan sebagai sumber karbon.

Komposisi gram/liter :

1. Intisari Pankreas Gelatin 20,0 gram

2. Kalium sulfat 10,0 gram
3. Magnesium Klorida 1,4 gram
4. Cetyltrimethylammonium Bromide 0,3 gram
5. Gliserin 10,0 mL
6. Agar 13,6gram
7. Air sulingan 1000 mL Gambar 3. Media
Cetrimide Agar (CETA)

Kehadiran pertumbuhan Pseudomonas aeruginosa menunjukkan reaksi positif. Periksa

koloni dengan sinar ultraviolet dengan panjang gelombang pendek (254 nm) untuk mengetahui
adanya fluorescein. Pemeriksaan visual juga dapat mengungkapkan warna kuning-hijau menjadi
biru yang menunjukkan produksi pyocyanin. Baik pyocyanin dan fluorescein biasanya diproduksi
oleh strain Pseudomonas aeruginosa.

Xylose Lysine Deoxychollate (XLD) merupakan median pertumbuhan selektif yang

digunakan dalam isolasi spesies salmonella dan shigella dari sampel klinis dan dari makanan.
xylose lysine deoxychollate memiliki pH sekitar 7,4 meninggalkannya dengan warna merah muda
cerah atau merah karena indikator fenol merah. Fermentasi gula menurunkan pH dan indikator
fenol merah mencatat ini dengan mengubah menjadi kuning. Kebanyakan bakteri usus,
termasuk Salmonella, dapat memfermentasi gula xylose untuk menghasilkan asam
koloni shigella tidak dapat melakukan ini dan karena itu tetap merah. Setelah menguras pasokan
xylose, koloni Salmonella akan mendekarboksisat lisin, meningkatkan pH sekali lagi menjadi basa
dan meniru koloni Shigella merah. Salmonella memetabolisme tiosulfat untuk
menghasilkan hidrogen sulfida, yang mengarah pada pembentukan koloni dengan pusat hitam dan
memungkinkan mereka untuk dibedakan dari koloni Shigella yang berwarna sama.
Komposisi:
1. Xilosa 3,50 gram
2. Lisin 50 gram
3. Laktosa 7,50 gram
4. Sukrosa 7,50 gram
5. Natrium klorida 50 gram
6. Ekstrak ragi 3,0 gram
7. Fenol merah 0,08 gram Gambar 4. Media
8. Agar 13,50 gram Xylosa lysine Desoksichollate (XLDA)
9. Natrium deoksikolat 2,50 gram
10. Natrium tiosulfat 6,80 gram
11. Besi amonium sitrat 0,80 gram
12. Aquadest sd 1 liter
13. pH 7,4

Enterobacteria lain seperti e.coli akan memfermentasi laktosa yang ada dalam medium sampai
batas yang akan mencegah pengembalian pH dengan dekarboksilasi dan mengasamkan media
yang mengubahnya menjadi kuning.

 Spesies Salmonella : koloni merah, beberapa dengan pusat hitam. Agar itu sendiri akan
berubah menjadi merah karena adanya koloni jenis Salmonella.
 Spesies Shigella : koloni merah.
 Coliforms : koloni kuning ke oranye.
 Pseudomonas aeruginosa : koloni berwarna merah muda, datar, kasar. Koloni jenis ini dapat
dengan mudah dikira Salmonella karena kesamaan warna.

Sebelum melakukan percobaan, ruangan tempat penanaman bakteri harus bersih dan dalam
keadaan steril. Hal ini dilakukan agar tidak terjadi kesalahan dalam pengamatan atau
percobaan dalam laboratorium. Setelah melakukan pensterilan ruangan, meja sebagai tempat
melakukan penanaman inokula pun harus dibersihkan menggunakan alcohol 70 %. Hal ini
dilakukan agar tidak terjadinya kontaminasi mikroorganisme. Semua pekerjaan pada praktikum
ini dilakukan dengan memperhatikan prosedur teknik aseptic. Teknis aseptis sangat diperlukan
pada saat memindahkan biakan dari suatu tempat ke tempat lainnya. Tujuan teknik aseptis
mencegah terjadinya kontaminasi dengan biakan yang mungkin bersifat pathogen. Kerja aseptic
dilakukan dengan bekerja diantara dua nyala api bunsen dengan jarak ± 20 cm hal ini dilakukan
untuk meminimalkan kontaminasi serta melindungi praktikan dari mikroorganisme pathogen
maupun non pathogen. Sebelum melakukan pertumbuhan bakteri tertentu yang diinokulasi pada
media spesifik, alat dan bahan yang digunakan harus steril yang sudah di lakukan proses sterilisasi
dengan panas lembab pada alat autoklaf. Hal ini bertujuan untuk menghancurkan secara lengkap
semua mikroba hidup dan spora-sporanya.

Suatu media yang memenuhi kebutuhan mikroba untuk bertahan hidup dan melakukan
aktivitasnya secara normal diperlukan untuk melakukan isolasi jenis mikroba tertentu. Setiap
media spesifik memiliki kandungan senyawa tertentu yang dapat mendukung pertumbuhan
mikroba tertentu tetapi menghambat pertumbuhan jenis mikroba lainnya. Pada umumnya media
yang digunakan untuk membiakkan mikroba mengandung air, sumber energi (protein dan
karbohidrat), zat hara (sumber karbon, nitrogen, sulfur, fosfat, oksigen dan hidrogen), serta faktor
penunjang pertumbuhan (seperti asam amino, vitamin).

Proses awal praktikum ini adalah membuat media plat agar dan agar miring. Pada
praktikum ini inokulasi di media padat yang dapat dilakukan dengan teknik plat agar yaitu media
MCA (Mac Conkey Agar), Vogel Johnson Agar (VJA) dan Cetrimide Agar (CA) menggunakan
cawan petri dan untuk inokulasi dengan teknik agar miring yaitu Simmon sitrat dan Triple Sugar
Iron Agar (TSIA) menggunakan tabung reaksi. Proses kedua praktikum ini adalah menginokulasi
bakteri Staphylococcus aureus, E. Coli dan Pseudomonas aeruginosa.ke masing masing media
spesifik dengan cara streak/gores Kemudian setelah melakukan inokulasi maka di inkubasi ke
dalam inkubator dengan suhu 37 ℃ selama 24 jam. Digunakan kondisi suhu 37℃ karena
bakteri akan mengalami pertumbuhan di suhu tersebut.

Peraksi yang digunakan dalam praktikum kali ini yaitu pereaksi indil, metil merah, voges
prokauser. Pada biakan bakteri usia 24 jam ditambahkan pereaksi indol sebanyak 3-4 tetes pereaksi
kovacs, pada biakan bakteri usia 48 jam ditambahkan pereaksi metil merah sebanyak 1-2 tetes
pereaksi metil merah dan pada biakan bakteri usia 48 jam ditambahkan 0,5 mL larutan alfa naftol
dan 1 mL larutan KOH 16%.
1. Indole

Beberapa bakteri dapat memproduksi indole dari pemecahan asam amino trypthopan
dengan menggunakan ezim tryptophanase. Produksi indole akan dideteksi dengan
menggunakan pereaksi erlich atau reagen kovak. Indole akan bereaksi dengan aldehyde
dalam reagen dan memberikan warna merah. Sebuah lapisan alkohol merah akan terbentuk
sepeti cincin di bagian atas menandakan indole positif.

Organisme yang memiliki enzim tryptophanase dapat menghancurkan asam amino

triptofan menjadi gugusan indol. Ketika indole bereaksi dengan para-dimetil- amino
benzaldehye (Kovac's reagen) akan menghasilkan kompleks yang berwarna merah muda,
triptofan yang paling banyak didalam media. Pertumbuhan pada agar darah atau coklat agar
dapat menghasilkan efek terbaik. Percobaan ini digunakan untuk mengetahui apakah suatu
organisme dapat menghasilkan gugus indol dari tryptophan atau peptone. Sesudah inkubasi
mikroorganisme dalam media tryptophan atau peptone broth, tambahkan reagen kovac.

 Uninoculated medium.(steril)
 Reaksi Positive : Escherichia coli.
 Reaksi Negative : Salmonella.

Bakteri akan diinokulasi dalam medium glucose phosphate broth, yang mengandug enzim
tryptophanase dapat menghancurkan asam amino triptofan yang kemudian diinkubasi
dalam suhu 37℃ selama 48 jam. Untuk mengetahui pH dalam medium maka
ditambahakan 3-4 tetes reagen indol. Jika berubah warna menjadi merah maka hasil
menunjukkan positif.

2. Metil merah
Digunakan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam memproduksi dan
memelihara kestabilan asam dari proses akhir fermentasi glukosa. Methy Red merupakan
indikator pH, yang menunjukan indikator merah berarti pH asam yang diproduksi itu
sekitar 4,4. Beberapa organisme menghasilkan asam dari metabolisme glukosa dalam
jumlah yang cukup untuk menghasilkan pH 4,4 dalam media. Asam ini tidak
dimetabolisme lebih lanjut dan dikatakan sebagai asam stabil . Pada pH 4,4 atau kurang
pH indikator metil red berwarna merah ceri. Pada penetesan methyl red digunakan untuk
 mengetahui apakah suatu organisme dapat menghasilkan dan mempertahankan asam
dalam suatu medium yang mengandung buffer. Ini merupakan sebuah percobaan
kuantitatif untuk mengetahui jumlah asam yang dihasilkan dari fermentasi
karbohidrat. Biakkan dalam media diinkubasi pada kondisi yang sesuai. Separuh dari
biakan media ini kemudian digunakan untuk uji methyl red, dan separoh sisanya untuk
uji voges-proskauer.

Indikator Methyl red ditambahkan ke dalam biakan :

 Uninoculated medium.(steril)
 Reaksi Positive : Salmonella., E. coli
 Reaksi Negative : Klebsiella.

Bakteri akan diinokulasi dalam medium glucose phosphate broth, yang mengandug
glukosa dan buffer phospat yang kemudian diinkubasi dalam suhu 37℃ selama 48 jam.
Untuk mengetahui pH dalam medium maka ditambahakan 5 tetes reagen metil merah. Jika
berubah warna menjadi merah maka hasil menunjukkan positif.

3. Voges proskauer

Voges Proskauer berguna dalam mendeteksi adanya butylene glycol yang

diproduksi bakteri. Acetyl-methyl carbinol (acetoin) adalah produksi lanjutan dari butylene
glycol. Dalam tes ini reagen yang dipakai adalah KOH 40% dan alpha-naphthol. Setelah
diinkubasi maka acetoin akan terbentuk dan akan dioxidasi oleh udara oxigen dan KOH
menjadi dacetyl. Diacetyl kemudian akan bereaksi dengan guanidine yang merupakan
kkomponen peptone saat ditambahakan alpha-naphthol akan terbentukk warna merah.
Beberapa organisme awalnya menghasilkan asam dari metabolisme glukosa, tetapi lebih
lanjut akan dimetabolisme menjadi asam netral sebagai produk akhir, seperti acetoin, dan
2,3-butanediol. Awalnya mungkin penurunan pH menjadi 4,4 tapi produk
akhir menyebabkan meningkatnya pH dan uji metil red menjadi negatif. Acetoin dan 2,3-
butanediol di bawah kondisi alkali akan bereaksi dengan alfa-naphthol (1-naphthol) untuk
menghasilkan warna merah mahoni.
 Tujuan dari diteteskan Voges Proskauer untuk mengetahui apakah organisme dapat
menghasilkan acetylmethylcarbinol (acetoin) dari fermentasi glukosa Biakan organisme
dalam media clark and lubb's diinkubasi pada kondisi yang sesuai. Biakkan dalam
media clark and lubb's diinkubasi pada kondisi yang sesuai. Separoh dari biakan media ini
kemudian digunakan untuk uji methyl red, dan separoh sisanya untuk uji voges proskauer .
alpha-naphtol (5%) dan potassium hydroxide (40%) ditambahkan ke dalam medium. Jika
acetoin terdapat dalam medium akan menghasilkan warna merah muda- merah.

 Uninoculated medium (steril)

 Reaksi Positive : Klebsiella.
 Reaksi Negative : Escherichia coli.

Bakteri yang hendak di uji akan di inokolasi kedalam glucosa peptone broth, diinkubasi
dalam suhu 37℃. diteteskan 0,6 ml aplha-naphthol kedalam medium tersebut dan dikocok.
0,2 ml KOH 40% ditambahkan selanjutnya warna merah yang terjadi menunjukkan hasil
tes yang positif.

Bakteri yang digunakan yaitu, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa,

Salmonella, dan Escherichia coli.

1. Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus merupakan bakteri gram positif berbentuk bulat
berdiameter 0,7-1,2 μm, tersusun dalam kelompok-kelompok yang tidak teratur seperti
buah anggur, fakultatif anaerob, tidak membentuk spora, dan tidak bergerak. Bakteri
ini tumbuh pada suhu optimum 37 ºC, tetapi membentuk pigmen paling baik pada suhu
kamar (20-25 ºC). Koloni pada perbenihan padat berwarna abu-abu sampai kuning
keemasan, berbentuk bundar, halus, menonjol, dan berkilau. Lebih dari 90% isolat
klinik menghasilkan S. aureus yang mempunyai kapsul polisakarida atau selaput tipis
yang berperan dalam virulensi bakteri. Berbagai derajat hemolisis disebabkan oleh S.
aureus dan kadang-kadang oleh spesies stafilokokus lainnya.
 Klasifikasi Staphylococcus aureus yaitu:

Domain : Bacteria

Kerajaan : Eubacteria

Filum : Firmicutes

Kelas : Bacilli

Ordo : Bacillales Gambar 1. Staphylococcus aureus

Famili : Staphylococcaceae

Genus : Staphylococcus

Spesies : S. aureus

Nama binomial : Staphylococcus aureus

2. Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa adalah bakteri gram negatif yang membentuk batang
halus atau lengkung, motil, berukuran sekitar 0,6 x 2 mm. Bakteri ini dapat ditemukan
soliter, berpasangan dan kadang-kadang membuat rantai pendek. Pseudomonas
aeruginosa merupakan bakteri motil karena memiliki flagela monotrika (flagel tunggal pada
kutub) dan membutuhkan oksigen untuk motilitas.
Pseudomonas aeruginosa merupakanbakteri aerob obligat yang tumbuh dengan
mudah pada berbagai jenis media pembiakan, kadang-kadang sering manis seperti
anggur atau seperti bau jagung taco. Beberapa strain dari Pseudomonas aeruginosa
menghemolisis agar darah. Pseudomonas aeruginosa tumbuh dengan baik pada suhu
37℃-42ºC. Membandingkannya pada suhu 42ºC membantu membedakannya dari
spesies Pseudomonas lain dalam kelompok fluoresen. Bakteri ini oksidase positif,
nonfermenter tetapi beberapa strain ada yang mengoksidasi emisi. Pseudomonas
aeruginosa memiliki kebutuhan nutrisi yang sederhana seperti amonia dan karbon
dioksida sebagai satu-satunya sumber nitrogen dan karbon. Suasana aerob diperlukan
untuk pertumbuhan dan optimal, strain regapi P. aeruginosa juga dapat tumbuh dengan
 peningkatan dalam kondisi anaerobik jika tersedia nitrat (NO3) sebagai akseptor
elektron.
Klasifikasi Pseudomonas aeruginosa
Filum : Proteobacteria
Kelas : Gamma Proteobacteria
Ordo : Pseudomonadales
Famili : Pseudomonadaceae
Genus : Pseudomonas
Spesies : Pseudomonas aeruginosa Gambar 2. P. aeruginosa

3. Escherichia coli.

E.coli merupakan bakteri gram negatif bersifat anaerob fakultatif dan tidak dapat
membentuk spora. Bakteri ini dapat hidup pada berbagai substrat dengan melakukan
fermentasi anaerobik menghasilkan asam laktat, suksinat, asetat, etanol, dan
karbondioksida E. coli termasuk family enterobacteriaceae, bentuknya batang atau koma,
terdapat tunggal atau berpasangan dalam rantai pendek. Escherichia coli yang diisolasi dari
spesimen feses, urin, sputum, cairan serebrospinal, maupun darah dapat dikultur dengan
menggunakan media agar mac conkey maupun agar (EMB) agar (EMB) yang mengandung
satu jenis 11 gula dalam konsentrasi tinggi akan menyebabkan organisme memfermentasi
gula sehingga membentuk koloni berwarna kemerahan.

Klasifikasi Escherichia coli

Kingdom : Bacteria

Filum : Proterobacteria

Kelas : Gamma Proteobacteria

Ordo : Enterobacteriales Gambar 3. Escherichia coli

Family : Enterobacteriaceae

Genus : Escherichia
 Species : Escherichia coli.

Pada isolasi, inkubasi, konfirmasi mikroba serta pewarnaan gram dilakukan

pembiakan pada media MCA, VJA, CETA, XLDA, agar miring, agar tegak serta larutan
uji. Pada media MCA, VJA, CETA, XLDA dilakukan inokulasi dengan cara zigzak dan
pada pewarnaan gram dilakukan dengan penambahan indikator indol pada biakan usia 24
jam dengan menambahkan 3-4 tetes pereaksi kovacs, mrtil merah ditambahkan pada saat
biakan usia 48 jam dengan menambahkan 1-2 tetes, voges prokauer ditambahkan pada saat
biakan usia 48 jam 0,5 mL larutan naftol dan 1 mL larutan KOH 16% dikocok kemudian
dibiarkan selama 10 menit, diamati pembiakan bakteri selama 6 hari pada setiap media uji.

Dari hasil pengamatan yang dilakukan pada mrdia MCAtidak terjadi pertumbuhan
bakteri, pada media VJA tidak terjadi pertumbuhan bakteri tetapi pada media VJA terjadi
perubahan warna pada media dari warna merah menjadi warna kuning karena, media VJA
tidak terjadi pertumbuhan bakteri tetapi terjadi perubahan warna pada media dari merah
menjadi kuning karena madia VJA digunakan untuk mendeteksi bakteri staphylococcus
aureus dengan mengidentifikasi koagulase positif dan fermentasi manitol strain. Medium
yang sangat baik untuk mendeteksi staphylococcus aureus. Pada media CETA tidak terjadi
pertumbuhan bakteri, pada media XLDA tidak terjadi pertumbuhan bakteri, pada
penambahan indol pada larutan uji tidak terjadi pertumbuhan bakteri tetapi terjadi
perubahan warna bening atau jernih menjadi hijau, pada penambahan metil merah pada
larutan uji tidak terjadi pertumbuhan bakteri tetapi terjadi perubahan warna dari warna
bening menjadi warna coklat, sedangkan pada penambahan voges proskauer tidak terjadi
pertumbuhan pada larutan uji warna larutan bening atau jernih. Pada media agar miring
yang yang di inokulasi tidak terjadi pertumbuhan bakteri, dan pada media agar tegak terjadi
pertumbuhan bakteri dan terjadi perubahan warna merah menjadi warna kuning.

V. PENUTUP
5.1 Kesimpulan
1. Isoladi merupakan cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu
dari lingkungannya, sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni.
 2. Pewarnaan gram digunakan untuk mempermudah prngamatan bentuk sel bakteri,
memperluas ukuran jazad, mengamati struktur dalam dan luas sel bakteri, dan
melihat reaksi jazad terhadap pewarnaan sehingga dapat diketahui.
3. Dari sampel bakteri yang diujikan positif bakteri staphylococcus aureus pada media
VJA .

DAFTAR PUSTAKA

Aditya, Mushoffa. 2010. Teknik Pewarnaan Bakteri. Universitas Indonesia. Jakarta

Budiarti, T. 2007. Fisiologi Mikroba. Bumi Aksara. Jakarta

Dwidjoseputro, D.1998.Dasar-Dasar Mikrobiologi, Malang : Djambatan.

Dwidjoseputro, 1990.Dasar-Dasar Mikrobiologi.Jakarta : Djambatan.

Hadioetomo, R. S, 1990. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta : Gramedia.

Lay, Bibiana.W, 1994, Analisis Mikroba di Laboratorium. Rajawali. Jakarta.

Lay,1994. Menghitung Mikroba pada bahan makanan, cakrawala (Suplemen pikiran rakyat
untuk iptek).Bandung : Farmasi FMIPA ITB.

Pelczar. J. Michael dan Chan E.C.S. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi. Universitas Indonesi
Jakarta.

Pelczar, Michael,1988. Dasar Mikrobiologi.Jakarta : gramedia.

Ratna, sri, 1990. Mikrobiologi dasar dalam praktek.Jakarta : gramedia.

Rudi, 2010. Bakteri Gram dan Pewarnaannya Mikrobiologi. Makassar.

Sutedjo, Mul Mulyani.1991.Mikrobiologi Tanah.Jakarta : Rineka Cipta.

Subandi, M. 2009. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Bandung: UIN SGD.

Waluyo, lud. 2004. Mikrobiologi Umum.Malang : UMM Press.

Waluyo, L. 2005. Mikrobiologi Umum. UMM Press, Malang.