PERCOBAAN IV

PENETAPAN RESPON MIKROBA TERHADAP ZAT ANTIMIKROBA

(AMPISILIN TRIHIDRAT)

I. Tujuan
1. Menentukan potensi antibiotik Ampisilin Trihidrat
2. Menentukan rasio potensi antibiotic AMpisilin Trihidrat terhadap larutan
Ampisilin standar
II. Prinsip
Membandingkan respon dari mikroba yang peka, dalam kondisi pertumbuhan
yang sama (identik) dari dosis sediaan uji (sampel) terhadap sediaan atau zat
baku (standar) yang telah diketahui konsentrasi dan potensinya. Respon tersebut
berupa efek hambatan terhadap pertumbuhan mikroba uji.
III. Teori umum
Penetapan potensi antimikroba termasuk kepada cara-cara penetapan dengan
menggunakan metoda hayati, dimana jasad hayati yang digunakan adalah
mikroba. Teknik penetapan potensi antibiotika yang umum digunakan meliputi
dua cara, yaitu:
1. Cara Difusi (cara lempeng)
Zat yang diuji berdifusi dari pencadang (reservoir) ke dalam media agar yang
telah diinokulasikan dengan mikroba penguji. Setelah inkubasi, diameter
hambatan pertumbuhan diukur dan dibandingkan.
2. Cara Tabung (cara turbidimetri)
Pada cara ini digunakan media cair. Kekeruhan yang disebabkan oleh
pertumbuhan mikroba diukur dengan menggunakan instrument yang cocok,
misalnya spektrofotometer.
Selain perbedaan dalam teknik pengerjaannya, kedua cara di atas mempunyai
dasar yang sama, yaitu:
1. Membandingkan sediaan uji yang tidak diketahui potensinya terhadap baku
pembanding (standar) yang telah diketahui potensinya.
2. Mengukur efek hambatan dari pertumbuhan mikroba yang digunakan.
3. Adanya hubungan kuantitatif antara konsentrasi zat aktif dan respon.

4. Hubungan kuantitatif tersebut, sama-sama diberikan baik oleh sediaan baku

pembanding maupun sediaan uji.

IV. Alat dan Bahan

a.
Alat
- Cawan petri
- Tabung reaksi
- Ose bundar
- Pinset
- Labu takar 25 mL
- Labu takar 10 mL
- Rak tabung reaksi
- Pipet agar 20 mL
- Pipet ukur 1 mL
- Erlenmeyer
- Pipet tetes
- Bunsen
- Pencadang kertas
- Jangka sorong
- Inkubator 37C
- Spektrofotometer
- Antibiotic zone reader
- pH meter

b.

Bahan
- Media nutrien agar
- Akuades steril
- Larutan dapar pH 8
- Suspensi Sarcina lutea
- Ampisilin standar

V. Prosedur Kerja

q20P
1%
8A
,cH
jyS
37lL
w
rhugC
m
otensiabkdpD
/
-4
Diagram alir Prosedur Kerja Uji Potensi Antibiotik

VI. Hasil Pengamatan

Tabel 6.1. Hasil Pengamatan Daerah Hambat atau Zona Bening Setiap Cawan
Cawan 1

Cawan 2

Cawan 3

Seri
I

Seri
II

Seri

III

Seri
IV

Seri
V

Tabel 6.2. Hasil Pengukuran Diameter Hambatan (cm)

Seri 1
Cawan 1
Cawan 2
Cawan 3

S1
3
2,7
2,5

R(1)
2,5
2,3
2,3

S1
3
2,8
2,6

R(1)
2
2,2
2,8

S1
2,85
2,6
2.2

R(1)
3
2
0

Seri II
Cawan 1
Cawan 2
Cawan 3

S2
1,9
2,8
2,7

R(2)
2,1
2,6
2,3

S2
2,3
2,7
2,6

R(2)
2,1
2,5
2,1

S2
2,1
2,8
2,5

R(2)
1,9
2,1
2,1

Seri III
Cawan 1
Cawan 2
Cawan 3

U
3,6
3
3

R(3)
2,3
2,5
2

U
3,4
4,2
3,5

R(3)
2,6
2,4
2,2

U
3,2
3,8
2,3

R(3)
2,4
2,8
2,5

Seri IV
Cawan 1

S4
2

R(4)
2,1

S4
1,9

R(4)
2

S4
2

R(4)
2,3
4

Cawan 2
Cawan 3

1,9
1,8

2
1,9

1,9
1,9

2
2

1,9
2,1

2,2
2,2

S5
R(5)
S5
R(5)
S5
R(5)
Seri V
Cawan 1
2,2
2,3
2
2,3
2,3
2
Cawan 2
2,2
1,7
1,9
2,2
2,2
2,1
Cawan 3
2,3
2,3
2,1
2
2,2
2,1
Keterangan : Konsentrasi S1 = 75 g/ml; Konsentrasi S2 = 60 g/ml; Konsentrasi S3
= 48 g/ml; Konsentrasi S4 = 38,4 g/ml; Konsentrasi S5
VII.

= 30,72 g/ml.

Perhitungan :

1. Diameter rata-rata tiap seri

Y1 =

S1 = (3+2,7+2,5+3+2,8+2,6+2,85+2,6+2,2) cm
nS1
9

= 2,69 cm

Y2 =

S2 = (1,9+2,8+2,7+2,3+2,7+2,6+2,1+2,8+2,5) cm
nS2
9

= 2,49 cm

Y4 =

S4 = (2+1,9+1,8+1,9+1,9+1,9+2+1,9+2,1) cm
nS4
9

= 1,93

Y5 =

S5 = (2,2+2,2+2,3+2+1,9+2,1+2,3+2,2+2,2) cm
nS5
9

= 2,15

cm

cm
2. Rata-rata diameter R tiap seri
Y31 =

R(1) = (2,5+2,3+2,3+2+2,2+2,8+3+2+0) cm
nR(1)
9

= 2,12

Y32 =

R(2) = (2,1+2,6+2,3+2,1+2,5+2,1+1,9+2,1+2,1) cm
nR(2)
9

= 2,20

Y34 =

R(4) = (2,1+2+1,9+2+2+2+2,3+2,2+2,2) cm
nR(4)
9

= 2,07

cm

cm

cm

Y35 =

R(5) = (2,3+1,7+2,3+2,3+2,2+2+2+2,1+2,1) cm
nR(5)
9

= 2,11 cm

3. Rata-rata diameter R semua seri

Y3T

R =
nR

R(1)+R(2)+R(3)+R(4)+R(5)
nR

19,1+19.8+21,7+18,7+19 = 2,18 cm
9
4. Diameter Koreksi
S1(a) = Y1 + ( Y3T Y31 ) = 2,69 + (2,18 - 2,12) = 2,75 cm
S2(b) = Y2 + ( Y3T Y32 ) = 2,49 + (2,18 - 2,20) = 2,47 cm
S3(c) = Y3T = 2,18 cm
S4(d) = Y4 + ( Y3T Y34 ) = 1,93 + (2,18 - 2,07) = 2,04 cm
S5(e) = Y5 + ( Y3T Y35 ) = 2,15 + (2,18 - 2,11) = 2,22 cm
5. Nilai log [konsentrasi]
Xa = log [S1] = log [75]

= 1,875

Xb = log [S2] = log [60]

= 1,778

Xc = log [S3] = log [48]

= 1,681

Xd = log [S4] = log [38,4] = 1,584

Xe = log [S5] = log [30,72] = 1,487
6. Persamaan regresi
Sumbu y : diameter koreksi; Sumbu x : log [konsentrasi]
y = a + bX = -0,242 + 1,534X

Grafik 7. Regresi log [konsentrasi] terhadap diameter koreksi

3

2.5

Sumbu Y 1.5 Y = -0,242 + 1,534X

Linear (Y = -0,242 + 1,534X)

0.5

0
1.45

1.5

1.55

1.6

1.65

1.7

1.75

1.8

1.85

Sumbu X

1.9

7. Nilai Yu koreksi
a. Nilai Ys
Ys = a + b(Xc)
= -0,242 + 1,534(1,681)
= 2,337 cm
b. Nilai Yu = diameter rata-rata U pada cawan U
Yu =

(3,6+3+3+3,4+4,2+3,5+3,2+3,8+2,3) cm
9

= 3,333 cm

c. Nilai Y3u = rata-rata diameter R pada seri V

Y3u =

(2,3+2,5+2+2,6+2,4+2,2+2,4+2,8+2,5) cm
9

= 2,411 cm

Nilai Yu koreksi = Yuk

Yuk = Ys + (Yu-Y3u)
= 2,337 + (3,333 - 2,411)
Yuk = 3,259
8. Konsentrasi sampel (X)
9.
10.

Yuk
= -0,242 + 1,534X
3,259 = -0,242 + 1,534X

11.

3,259 + 0,242
1,534

12.
X
= 2,282
13.
14. Dosis sampel (Dosis U)
15.

16.
17.

X
x dosis S3
Xc
= 2,282 x 48 g/ml
1,681

Dosis U =

Dosis U = 65,161 g/ml

18.
19. Potensi uji
20.

Dosis U Potensi standar

x
Dosis R
21. = 65,161 x 957,25 g/ml
48

Potensi uji =

Potensi uji = 1299,487 g/ml

22.

23. Diameter pada dosis terendah (Yr)

3 a+2b +ce
5
= 3 (2,75)+2(2,47)+2,182,24
5

24. Yr =
25.

26. Yr = 2,62 cm
27.
28. Diameter pada dosis tertinggi (Yt)

3 e+2 d +ca
5
= 3 (2,24)+2(2,08)+2,182,75
5

29. Yt =
30.

31. Yt = 2,06 cm
32.

33. Rasio potensi

34.

Potensi uji
x 100 %
Potensistandar
= 1299,07 x 100 %
957,25

Rasio potensi =
35.
36.

= 135,71 %

37.
VIII. Pembahasan
38. Antimikroba adalah obat pembasmi mikroba, khususnya mikroba
yang merugikan manusia. Contoh penggunaan zat antimikroba adalah dengan
antiseptik, disinfektan, dan antibiotik. Antiseptik merupakan zat antimikroba
untuk membunuh bakteri pada permukaan jaringan hidup, seperti kulit.
Antiseptik digunakan untuk mencegah infeksi, sepsis, dan putrefikasi. Berbeda
dengan antiseptic, disinfektan merupakan zat antimikroba untuk mencegah,
menghambat, atau membunuh pertumbuhan mikroorganisme pada benda mati
dengan menciptakan kondisi lingkungan yang tidak sesuai bagi pertumbuhan
mikroorganisme. Sedangkan, antibiotic merupakan zat kimia yang dihasilkan
oleh suatu mikroorganisme yang menghambat pertumbuhan mikroorganisme
lain (Pelczar dan Chan, 2005). Antibiotik juga dapat didefinisikan sebagai
senyawa kimia yang dihasilkan oleh organisme hidup atau yang diperoleh dari
proses sintesis dengan indeks kemoterapi yang tinggi. Antibiotik memiliki
9

kemampuan untuk membunuh mikroorganisme di dalam tubuh, khususnya

bakteri saat terjadi infeksi. Aktivitas antibiotik pada dosis sangat rendah secara
spesifik mampu menghambat proses vital tertentu pada mikroorganisme.
Antibiotik memiliki daya antimikroba yaitu potensi antibiotik, yaitu kekuatan
zat tersebut dalam menghambat pertumbuhan mikroba yang bergantung pada
kadar (konsentrasi zat tersebut) dan dosis (jumlah penggunaan zat tersebut
pada pasien).
39. Menurut Entjang (2003), antibiotik yang ideal sebagai obat harus memenuhi
syarat-syarat berikut:
1. mempunyai kemampuan untuk

mematikan atau menghambat

pertumbuhan

mikroorganisme yang luas (broad spectrum antibiotic);

2. tidak menimbulkan terjadinya resistensi dari mikroorganisme pathogen;
3. tidak menimbulkan pengaruh samping (side effect ) yang buruk pada host,
sepertireaksi alergi, kerusakan saraf, iritasi lambung dan lain sebagainya;
4. tidak mengganggu keseimbangan flora yang normal dari host seperti flora
usus atau flora kulit; dan
5. konsentrasi antibiotik dalam jaringan harus mencapai taraf cukup tinggi
sehingga mampu menghambat atau mematikan penyebab infeksi.
40.

Pada pengobatan modern yang berkaitan dengan penyakit akibat

mikroorganisme, antibiotik dan vaksin memiliki peranan yang besar. Secara

umum, antibiotik maupun vaksin memiliki fungsi yang sama, yaitu melawan
mikroorganisme yang masuk ke tubuh manusia sehingga kerugian-kerugian
yang menyebabkan terganggunya fungsi fisiologis tubuh normal dapat
dihambat. Akan tetapi, keduanya memiliki perbedaan yang dapat ditinjau dari
berbagai aspek, antara lain dapat dilihat pada tabel berikut:
41.
Tabel 8. Perbedaan Antibiotik dan Vaksin

10

1.
3.

5.

Antibiotik
Bertindak melawan bakteri

Sebagian besar diberikan

2.
4.

Vaksin
Bertindak terhadap sebagian

42. Be
rdasarkan

besar mikroorganisme, termasuk

aktivitas

virus

luas

6.

Diberikan sebelum

atau

spektrum

setelah terjadi infeksi

7.
Bekerja terhadap banyak

manifestasi infeksi
8.
Bekerja secara spesifik, yaitu

luas

spesies bakteri
9.
Bekerja dengan merusak

terhadap satu jenis mikroba

10.
Bekerja dengan

antibiotik

bakteri pathogen atau menyebabkan

meningkatkan imunitas atau

kerjanya,

kerusakan biokimia mikroorganisme kekebalan alami tubuh

dikelompokkan menjadi 2, yaitu :
1. Antibiotik Spektrum Luas (Broad Spectrum), yaitu antibiotik yang bersifat aktif
terhadap banyak jenis mikroba, baik bakteri gram positif maupun bakteri gram
negative. Pada umumnya, antibiotic berspektrum luas digunakan untuk
mengobati penyakit infeksi yang belum diidentifikasi dengan pembiakan dan
sesitifitas. Akan tetapi, penggunaan antibiotik ini dianjurkan untuk dihindari
karena dapat membunuh bakteri menguntungkan yang sebenenarnya bermanfaat
di dalam tubuh. Contoh antibiotic golongan ini yaitu sulfonamida, sefalosporin,
tetrasiklin, rifampisin, aminoglikosida, amnifenikol, makrolida, dan turunan
penicilin.
2. Antibiotik Spektrum Sempit (Narrow Spectrum), yaitu antibiotik yang aktif
bekerja hanya secara spesifik hanya terhadap satu jenis mikroba saja, yaitu
bakteri gram positif atau bakteri gram negatif. Antibiotik berspektrum
sempit bersifat lebih selektif, sehingga obat-obat yang tergolong di
dalamnya lebih aktif dalam melawan organisme tunggal. Contoh antibiotic
golongan ini adalah eritromisin, klindamisin, kenamisin yang bekerja
terhadap bakteri gram positif dan streptomisin, gentamisin yang bekerja
terhadap bakteri gram negatif.
43.
44.

Berdasarkan mekanisme kerjanya, antibiotik dikelompokkan menjadi:

1. Antibiotik sebagai inhibitor sintesis dinding sel bakteri

45.

Pada mekanisme ini, bakteri memiliki efek bakterisidal dengan cara

memecah enzim dinding sel dan menghambat enzim dalam sintesis dinding
11

sel. Antibiotik golongan ini menghambat biosintesis peptidoglikan, sintesis

mukopeptida, atau menghambat sintesis peptide dinding sel sehingga
menyebabkan dinding sel melemah. AKibat adanya tekanan turgor dari
dalam, dinding sel bakteri akan pecah atau lisis sehingga bakteri akan mati.
Contoh: golongan -Laktam seperti penisilin, sefalosporin, karbapenem,
monobaktam, vancomysin, dan basitrasin.
2. Antibiotik sebagai inhibitor sintesis protein bakteri
46.

Sel

mikroba

memerlukan

kelangsungan

sintesis

berbagai

protein

hidupnya.

untuk
Sintesis

protein terjadi di ribosom dengan bantuan mRNA dan

tRNA.

Ribosom

bakteri terdiri dari dua subunit, yaitu ribosom 30S dan 50S. Kedua subunit
bersatu pada pangkal rantai mRNA menjadi ribosom 70S agar dapat
berfungsi pada sintesis protein. Penggunaan antibiotic golongan ini akan
menghambat reaksi transfer antara donor dengan aseptor atau menghambat
translokasi t-RNA peptidil dari situs aseptor ke situs donor yang
menyebabkan

sintesis

protein

terhenti.

Contoh:

kloramfenikol,

golongan tetrasiklin,eritromisin, klindamisin, dan pristinamisin.

3. Antibiotik yang menghambat metabolisme sel mikroba
47.

Sel mikroba membutuhkan asam folat untuk kelangsungan hidupnya,

yang diperoleh dengan cara mensintesis sendiri dari asam amino benzoat
(PABA). Koenzim asam folat diperlukan oleh mikroba untuk sintesis purin,
pirimidin, maupun senyawa-senyawa untuk pertumbuhan seluler dan
replikasi. Oleh sebab itu, sel-sel tidak dapat tumbuh dan membelah apabila
tidak ada asam folat. Antibiotik golongan ini memiliki efek bakteriostatik.
Contohnya adalah sulfonamida. Sulfonamide memiliki struktur mirip PABA
sehingga penggunaannya akan menghasilkan asam folat yang tidak
berfungsi. Contoh lainnya yaitu trimetoprim dan asam p-aminosalisilat.
4. Antibiotik yang mengganggu keutuhan membran sel mikroba
48.

Antibiotik golongan ini bekerja mengubah permeabilitas membran sel

dan memiliki efek bakteriostatik. Kerusakan membran sel menyebabkan

keluarnya berbagai komponen esensial dalam sel mikroba sehingga sel lisis

12

akibat hilangnya substansi seluler. Contoh: polimiksin, amfoterisin B,

gramisidin, nistatin, dan kolistin.
5. Antibiotik yang menghambat sintesis Asam Nukleat sel mikroba
49.

Contoh antibiotic golongan ini adalah rifampisin dan golongan

kuinolon. Rifamisin akan berikatan dengan enzim RNA-polimerase pada

subunit sehingga menyebabkan terhambatnya sintesis RNA dan DNA.
Sedangkan golongan kuinolon bekerja dengan menghambat enzim DNAgirase yang dapat menyebabkan terbukanya dan terbentuknya superheliks
pada DNA sehingga penggunaannya dapat menghambat replikasi DNA.
50.
51.

Berdasarkan daya kerjanya, antibiotik dikelompokkan menjadi 2 yaitu

:
1. Bakteriosid
52. Antibiotik golongan ini memberikan efek dengan cara membunuh sel
tetapi tidak terjadi lisis sel. Contoh: penisilin, sefalosporin, rifampisin, dan
isoniazid.
2. Bakteriostatik
53.
Antibiotik golongan ini memberikan efek dengan cara menghambat
pertumbuhan, tetapi tidak membunuh bakteri. Contoh: eritromisin,
tetrasiklin, kloramfenikol, dan sulfonamida.
54.
55. Menurut Tjay dan Rahardja (2007), berdasarkan gugus kimianya,
antibiotik dikelompokkan menjadi :
1. Aminoglikosida. Contohnya amikasin,

gentamisin,

kanamisin,

dan

streptomisin.
2. Beta-laktam. Contohnya karbopenem, sefalosporin, beta-laktam monosiklik,
dan penisilin.
3. Glikopeptida.
4.
5.
6.
7.
8.
9.

Contohnya

vakomisin,

teikoplanin,

ramoplanin,

dan

dekaplanin.
Polipeptida. Contohnya makrolida, ketolida, dan tetrasiklin.
Polimiksin. Contohnya polimiksin dan kolistin.
Kinolon. Contohnya siprofloksasin, ofloksasin, asam nalidoksat.
Streptogramin. Contohnya pristinamycin, virginamisin, dan mitramycin.
Oksazolidinan. Contohnya linezolid dan AZD2563.
Sulfonamida. Contohnya kotrimoksazol dan trimethoprim.
56.

13

57.

Penggunaan antibiotik harus diperhatikan, karena jika penggunaannya

tidak tepat, tidak sampai habis sesuai dosisnya, atau secara terus menerus,
maka sebagian bakteri akan memiliki gen resistensi yang akan ditularkan ke
bakteri sejenis lainnya yang belum mengalami resistensi. Mekanisme transfer
materi genetik akibat adanya resistensi antibiotik dapat melalui 3 cara, yaitu :
1. Transformasi
58. Mekanisme: pemindahan materi genetik dari suatu bakteri ke bakteri
lain dengan proses fisiologi kompleks secara langsung atau tanpa perantara.
2. Transduksi
59. Mekanisme: pemindahan materi genetik dengan perantara virus yang
membentuk profage sehingga dapat menginfeksi bakteri lain.
3. Konjugasi
60. Mekanisme: pemindahan materi genetik melalui kontak langsung
dengan membentuk jembatan sitoplasma dari sel pili dan terjadi proses
pertukaran plasmid.
61.
62.
63.
64.
65.
66.
67.
68.
69.

Gambar 8.1. Mekanisme penularan gen resisten pada sel bakteri

(a) Transformasi; (b) Transduksi; (c) Konjugasi
(b)
70.

Mekanisme resistensi antibiotik, antara lain :

1. Perubahan area target yang menurunkan daya ikat antibiotik.

71. Mekanismeinidilakukandengancaramengubahtempatpengikatanantibi
otik di dalam bakteri. Perubahan yang terjadi disebabkan oleh bakteri yang
mengalami mutasi gen. Contoh: antibiotik fluorokuinon bekerja dengan cara
mengganggu fungsi protein yang terlibat dalam proses replikasi DNA
bakteri. Mutasi yang menyebabkan resistensi terhadap fluorokuinon dapat
14

mengubah konformasi protein sehingga pengikatan antibiotik pada sasaran

menjadi berkurang.
2. Menghasilkan enzim pengurai antibiotik sehingga antibiotik menjadi tidak
aktif. Bakteri akan mengkode gen yang menghasilkan enzim untuk
menguraikan molekul antibiotik sebelum dapat bekerja membunuh bakteri.
Contoh: enzim -laktamase yang akan menguraikan struktur -laktam pada
antibiotik sehingga menjadi tidak aktif dan tidak fungsional.
3. Menurunkan akumulasi antibiotik intraseluler dengan cara menurunkan
permeabilitas atau mengaktifkan efluks aktif antibiotik.
72. Perubahan permeabilitas membran sel menyebabkan penurunan
(influx) masuknya antibiotik dan mengaktifkan pengeluaran (efluks)
antibiotik. Dengan demikian, akumulasi antibiotik dalam bakteri menjadi
berkurang sehingga efektivitasnya menurun. Contoh: bakteri yang resisten
terhadap antibiotik tetrasiklin.
4. Mengubah dinding sel sehingga tidak dapat tembus.
73. Mekanisme ini menyebabkan kurangnya target tempat berikatan
antibiotik dan membran sel yang tidak dapat ditembus.
5. Menghilangkan target antibiotik dengan membentuk jalur metabolik baru.
74. Resistensi terhadap suatu antibiotik menyebabkan terbentuknya enzim
dihydrofolate reductase yang resisten terhadap antibiotik dari plasmid atau
transposon. Elemen materi genetik yang dapat bergerak ini menyebabkan
penyebaran resistensi antibiotik terjadi secara cepat antarbakteri.
75.
76.

Pada percobaan ini, dilakukan penetapan respon mikroba terhadap

salah satu zat antimikroba, yaitu penetapan potensi antibiotik. Prinsip

percobaan adalah membandingkan respon mikroba yang peka dari dosis
sediaan uji (sampel) terhadap sediaan baku standar yang telah diketahui
konsentrasi dan potensinya di dalam kondisi pertumbuhan yang sama.
77. Uji potensi antibiotik secara mikrobiologi <131> menurut Farmakope
Indonesia IV yaitu aktivitas (potensi) antibiotic dapat ditunjukkan pada kondisi
yang sesuai dengan efek daya hambat terhadap mikroba. Suatu penurunan
aktivitas antimikroba juga dapat menunjukkan perubahan kecil yang tidak
dapat ditunjukkan oleh metode kimia, sehingga pengujian secara mikrobiologi
atau biologi biasanya merupakan standar untuk mengatasi keraguan tentang
kemungkinan hilangnya aktivitas. Potensi antibiotic dinyatakan dalam unit atau
15

g aktivitas. Pengertian g aktivitas berasal dari sediaan antibiotic yang dipilih

sebagai baku pembanding yang dianggap secara keseluruhan terdiri dari bahan
kimia tunggal, dan oleh karena itu dinyatakan potensi 1000 g per mg.
78. Efektivitas daya hambat pada zat antibiotic dapat diketahui dengan
menentukan kadar atau potensinya. Kadar merupakan persentase atau
konsentrasi zat antimikroba dalam suatu sediaan, sedangkan potensi
merupakan kekuatan suatu zat untuk bekerja terhadap suatu mikroorganisme.
Antibiotic tertentu bekerja untuk mikroorganisme (bakteri) tertentu pula pada
umumnya. Oleh sebab itu, penggunaan antibiotik harus memperhatikan jumlah
agar dapat menghasilkan suatu efek terhadap mikroba tertentu. Jumlah saat
penggunaan antibiotic untuk menghasilkan efek disebut dosis.
79. Berdasarkan Farmakope Indonesia IV terdapat 2 metode umum yang
dapat dilakukan dalam penetapan potensi antibiotic, yaitu:
1. Penetapan dengan lempeng silinder atau difusi
80. Metode ini didasarkan oleh difusi antibiotik dari silinder yang
dipasang tegak lurus pada lapisan agar padat dalam cawan petri, sehingga
mikroba yang ditambahkan terhambat pertumbuhannya pada daerah berupa
lingkaran atau zona di sekeliling silinder berisi larutan antibiotik. Silinder
yang dimaksud adalah pencadang (reservoir). Pencadang yang dapat
digunakan pada metode ini beragam, antara lain:
a. Pecadang logam
81.Kelebihan penggunaan pencadang logam:
i.
Jumlah antibiotic dalam pencadang logam dapat diatur secara tepat
ii.

sesuai daya tampung silinder

Ketersediaann antibiotic dalam pencadang selama waktu inkubasi
terjamin
82.Kekurangan penggunaan pencadang logam:

i.
ii.
iii.
iv.

Mudah bergeser
Mahal
Larutan antibiotik dapat mengalir dari pencadang ke permukaan media
Diameter hambat dalam pencadang satu dan lainnya dapat bersatu

sehingga data diameter hambat tidak bisa diukur.

83.
b. Kertas Cakram
84.Kelebihan penggunaan kertas cakram:
i.
Jumlah antibiotic dapat diatur sesuai kapasitas kertas cakram sehingga
tidak melebar kemana-mana
16

ii.
iii.
iv.

Praktik, ringan, dan ekonomis

Tidak mudah bergeser
Antibiotik terpusat pada satu titik saja, tidak melebar
85.Kekurangan penggunaan kertas cakram:

i.

Volume antibiotik pada kertas cakram satu dan lainnya tidak diketahui

ii.
iii.

secara pasti
Kertas cakram tidak presisi dan berbeda ukuran
Adanya variasi difusi antibiotik yang membuat diameter hambat
bervariasi apabila kertas cakram heterogen.

86.
c. Cetak lubang (Punched holes)
87.Apabila menggunakan pencadang jenis ini, medium agar yang telah

i.
ii.

diinokulasi dengan mikroba penguji dilubangi dengan alat pengisap agar.

88.Kelebihan penggunaan cetak lubang:
Jumlah larutan antibiotik yang berdifusi dapat terukur
Medium yang digunakan tidak terlalu tebal.
89.Kekurangan penggunaan cetak lubang adalah difusi zat uji dapat
terpengaruh akibat lubang yang terbentuk tidak sempurna (berbeda

ukuran).
90.
91. Penetapan potensi antibiotik dengan metode difusi ini dilakukan
dengan mengamati dan mengukur diameter hambat berupa zona bening di
sekitar pencadang. Diameter hambat menggambarkan seberapa besar potensi
antibiotic yang akan diuji terhadap mikroba yang peka. Diameter hambat pada
tiap seri atau tiap konsentrasi berbeda-beda. Faktor yang mempengaruhi
diameter daerah hambatan yaitu konsentrasi dari antibiotik yang digunakan.
Semakin besar konsentrasinya, maka semakin besar diameter daerah hambatan.
Selain itu, faktor-faktor lainnya antara lain komposisi dan kandungna media,
suhu dan waktu inkubasi, ukuran inokulum, pH, kapilaritas kertas cakram atau
pencadang lainnya, derajat sensitivitas mikroorganisme terhadap antibiotic, dan
laju difusi antimikroba melawan laju pertumbuhan bakteri.
92. Beberapa jenis desain untuk penetapan potensi

antibiotik

menggunakan metode difusi atau lempeng silinder dibedakan menjadi 3, yaitu

1) Desain (2+2)
93. Pada desain ini digunakan satu baku pembanding dan satu sampel,
masing-masing dengan dua tingkat dosis yang diperlakukan dalam satu
lempeng agar.
17

2) Desain (3+3)
94. Pada desain ini digunakan satu baku pembanding dan satu sampel,
masing-masing dengan tiga tingkat dosis yang diperlakukan dalam satu
lempeng agar.
3) Desain (5+1)
95. Pada desain ini digunakan satu baku pembanding dengan lima tingkat
dosis dan satu sampel dengan satu tingkat dosis yang setara dengan dosis
menegah baku pembanding.
96.
2. Penetapan dengan tabung atau turbidimetri
97. Metode turbidimetri didasarkan hambatan pertumbuhan mikroba
dalam larutan berisi antibiotik pada media cair yang dapat diamati
kekeruhannya. Metode ini menggunakan instrumen yang sesuai seperti
spektrofotometer. Semakin keruh zat dalam tabung, maka semakin banyak
jumlah mikroba yang tumbuh dalam media. Pada spektrofotometer,
dihasilkan cahaya dengan panjang gelombang tertentu lalu melewati
suspense dalam tabung. Saat terkena partikel, dalam hal ini mikroba, maka
gelombang akan diserap atau dipantulkan dan apabila tidak, gelombang
akan diteruskan. Hasil pengukuran spektrofotometer dinyatakan dalam
transmitan yang menunjukkan banyaknya cahaya yang diteruskan oleh
sampel yang diukur. Semakin kecil transmitan, maka semakin sedikit cahaya
yang diteruskan. Hal ini menggambarkan larutan (media) yang semakin
keruh.
98.
99.

Pada percobaan ini, potensi antibiotic yang akan ditetapkan adalah

Ampisilin Trihidrat. Ampisilin berbentuk anhidrat dan trihidrat memiliki rumus

molekul C16H19N3O4S.3H2O dengan berat molekul 403,45. Ampisilin
berbentuk anhidrat atau trihidrat mengandung tidak kurang dari 95,0%
C16H19N3O4S dihitung terhadap zat anhidrat. Antibiotik ini berwarna putih,
tidak berbau, berwujud serbuk kristal dan higroskopis, serta sangat larut dalam
air dan mengandung 0,9 % NaCl. Ampisilin trihidrat mempunyai kelarutan
dalam air sekitar 6 mg/mL pada suhu 20 0C dan 10 mg/mL pada suhu 40 0C.
Garam trihidratnya stabil pada suhu kamar, dengan kelarutan 1 g/ml dalam air,

18

1 g/250 ml dalam etanol absolut dan praktis tidak larut dalam eter dan
kloroform (Ditjen POM, 1995).
100.
101.
102.
103.
104.
105.
106.

Gambar 8.2.

Struktur

Ampisilin

Trihidrat
107. Antibiotik ini memiliki spectrum antimikroba yang luas dan
digunakan dalam pengobatan infeksi yang peka (non-betalaktamaseproducting

organism).

Mekanisme

kerja

Ampisilin

Trihidrat

adalah

menghambat sintesa dinding bakteri dengan mengikat satu atau lebih pada
ikatan penisilin-protein (PBPs protein binding peniilins) sehingga terjadi
penghambatan pada tahap akhir transpeptidase sintesis peptidoglikan dalam
dinding sel bakteri. Dengan demikian, biosintesis dinding sel terhambat dan sel
bakteri menjadi pecah (lisis).
108. Proses persiapan ampisilin trihidrat standar menggunakan ampisilin
standar dengan konsentrasi 957,25 g/ml, kemudian dilarutkan dalam aquades
hingga diperoleh larutan induk standar dengan konsentrasi 1000 g/ml, lalu
dilakukan pengenceran dengan desain 5+1 hingga diperoleh dosis S 1 S5.
Pengenceran dilakukan dengan larutan dapar pH 8 dengan tujuan untuk
mengkontrol pH antibiotik dan inokulan pada rentang netral, sehingga interaksi
antara antibiotik dan inokulan tidak terganggu oleh perubahan pH. Selain itu,
pH tersebut merupakan pH optimum bagi pertumbuhan mikroba yang
diinokulasikan, yaitu Sarcina lutea. Alasan penggunaan Sarcina lutea sebagai
mikroba penguji adalah karena zat antibiotic yang diuji dan dibandingkan
dalam percobaan ini bersifat toksik selektif terhadap bakteri ini. Ampisilin
trihidrat dapat bekerja pada bakteri gram positif maupun negatif khususnya
pada bakteri pencernaan di usus, yaitu Sarcina lutea yang memiliki zat
karotenoid dengan warna kuning, sehingga pengamatan menjadi lebih mudah.
Selain itu, penggunaan kombinasi uji ampisilin trihidrat dengan Sarcina lutea

19

ditujukan karena keduanya memiliki potensi yang setara antara potensi

pertumbuhannya dan potensi antibiotiknya. Profil bakteri Sarcina lutea
109.
Kingdom : Bacteria
110.
Phylum
: Firmicutas
111.
Class
: Clostridia
112.
Ordo
:
Clostridiales
113.
Famili

Clostridiaceae
114.
Genus
: Sarcina
115.
Spesies
: Sarcina lutea
Gambar
8.3. Sarcina
116. Sarcina lutea merupakan bakteri
non-motil,
gramlutea
positif, bersifat
aerob obligat, micrococcus penghasil pigmen, dan dapat ditemukan di udara,
tanah, maupun air. Koloni bakteri ini berwarna kuning. Kondisi ideal
pertumbuhannya adalah pada suhu 25oC.
117. Pembuatan agar inokula menggunakan media agar Nutrien Agar (NA)
yang ditambahkan dengan 1ml suspense Sarcina lutea (agar inokulas 1%) lalu
diambil sebanyak 20ml pada cawan petri hingga memadat. Setelah agar
inokula padat, pencadang kertas cakram diletakkan pada permukaan media,
lalu diteteskan larutan standard an larutan uji masing-masing sebanyak 10l
pada tiap kertas cakram yang telah diberi label. Setelah itu, dilakukan proses
pre-inkubasi pada suhu kamar selama 20 menit hingga 30 menit sebelum
diinkubasi pada 37oC selama 18 hingga 24 jam. Proses pre-inkubasi bertujuan
supaya antibiotik ampisilin trihidrat dapat berdifusi sempurna pada agar
inokulas, sehingga terjadi interaksi langsung antara antibiotik dan inokulan.
Apabila langsung dimasukkan ke dalam inkubator, maka suhu lingkungan
adalah suhu yang paling optimal bagi pertumbuhan bakteri (37oC) sehingga
pertumbuhan bakteri berlangsung cepat dan antibiotik tidak dapat bekerja
dengan baik untuk melawan pertumbuhan bakteri.
118. Berdasarkan data hasil perhitungan, didapatkan data diameter hambat
rata-rata yang bervariasi pada tiap seri. Secara kuantitatif, hubungan diameter
hambat dengan konsentrasi larutan antibiotic seharusnya adalah berbanding
lurus, artinya semakin besar konsentrasi antibiotic, maka semakin besar
diameter hambat yang dapat diamati. Hal ini ditandai dengan kurva regresi
yang seharusnya linier. Akan tetapi, hasil perhitungan yang didapatkan tidak

20

sesuai dengan teori sebab diameter hambat rata-rata pada tiap seri saat
digambarkan dalam grafik menunjukkan hasil yang tidak linier. Padahal
aktivitas antibiotic seharusnya semakin menurun dari seri I ke seri berikutnya.
Hasil diameter hambar rata-rata yang didapat adalah S 1> S2> S3(R)> S5> S4.
Selain itu, didapatkan pula diameter hambat yang berbeda-beda di ketiga
cawan pada seri yang sama padahal hasil aktivitas antibiotic yang ditujukan
seharusnya sama karena nutrisi dan lingkungan ketiga cawan pada setiap seri
adalah sama.
119. Dengan demikian, data yang didapatkan tergolong kurang akurat
akibat beberapa faktor kesalahan yang mungkin terjadi. Faktor-faktor tersebut
antara lain:
1. Pencampuran media NA dan suspense Sarcina lutea yang kurang merata
atau tidak homogeny sehingga pertumbuhan bakteri pada tiap daerah
berbeda-beda. Terdapat daerah yang banyak mengandung mikroba dan
daerah yang hanya mengandung sedikit mikroba. Oleh sebab itu, pada
daerah yang terdapat banyak mikroba, zona bening (diameter hambatnya)
besar, begitupun sebaliknya.
2. Perbedaan ukuran kertas cakram yang digunakan. Ukuran kertas cakram
yang tidak presisi sama mempengaruhi difusi larutan yang diteteskan, baik
larutan uji maupun larutan standar sehingga aktivitasnya pada tiap daerah
juga berbeda.
3. Perbedaan jumlah larutan yang diteteskan. Walaupun telah ditetapkan bahwa
tiap larutan diteteskan sebanyak 10l menggunakan mikro-pipet, namun
dapat terjadi perbedaan jumlah larutan yang dilepaskan dari mikro pipet
akibat adanya gelembung udara atau sejumlah kecil larutan yang
terperangkap dalam pipet sehingga jumlah yang diteteskan pada tiap kertas
cakram tidak persis sama.
4. Penguruan diameter hambat yang kurang tepat. Pada hasil pengamatan,
dapat dilihat bahwa diameter hambat pada beberapa cawan cukup besar
pada tiap daerah yang ditandai pencadang, sehingga melebar dan menyatu
dengan zona bening disekitarnya. Hal ini membuat sedikit kesulitan dalam
pengukuran diameter hambat sehingga hasil yang didapat kurang tepat.

21

5. Pengenceran yang kurang tepat. Pada saat dilakukan pengenceran untuk tiap
seri, dapat terjadi kesalahan seperti pencampuran yang kurang homogen,
pengambilan zat tidak presisi, atau bahkan konsentrasi zat yang tidak tepat.
120.
121. Berdasarkan hasil perhitungan pula, diperoleh data diameter rata-rata
R tiap seri lebih kecil daripada diameter rata-rata konsentrasi tiap seri. Hal ini
menunjukkan bahwa antibiotic yang diuji memiliki aktivitas hambat yang lebih
tinggi daripada larutan standar, yaitu dengan potensi sebesar 1299,487 g/ml
dibandingkan larutan standar yang hanya memiliki potensi 957,25 g/ml.
Akibatnya, rasio potensi yang didapat juga sangat tinggi, yaitu sebesar
135,71%.
122.
IX. Kesimpulan
1. Potensi antibiotic Ampisilin Trihidrat yang diuji adalah 1299,487 g/ml.
2. Rasio potensi antibiotic Ampisilin Trihidrat yang diuji terhadap larutan
Ampisilin standar adalah 135,71%.
123.
124.

126.

125.
PERCOBAAN VI dan VII
DETEKSI DNA DENGAN TEKNIK POLYMERASE CHAIN
127.

REACTION (PCR)
ELEKTROFORESIS DNA DAN PROTEIN

128.
I. Tujuan
1. Menentukan bobot molekul DNA sampel
2. Menentukan bobot molekul protein sampel
3. Menentukan kemurnian DNA sampel
129.
II. Prinsip percobaan
130.

Fragmen DNA spesifik dapat diamplifikasi menggunakan teknik in

vitro yang disebut dengan PCR. Pada prinsipnya sepasang primer yang
membatasi fragmen DNA yang diamplifikasi mengawali reaksi polimerisasi
yang dikatalisis oleh DNA polimerase yaitu Taq DNA polimerase. PCR dapat
digunakan untuk mendeteksi keberadaan DNA patogen bila fragmen DNA
22

tersebut hanya spesifik berada pada patogen tersebut. Kespesifikan PCR

ditentukan oleh primer yang digunakan.
131. Setelah selesai diamplifikasi sebanyak siklus tertentu, perlu dilakukan
elektroforesis terhadap produk PCR untuk mengetahui apakah produk PCR
dihasilkan dan bila dihasilkan merupakan produk PCR yang dikehendaki.
Molekul DNA dan protein merupakan molekul yang bermuatan sehingga bila
diletakkan dalam medan listrik akan bergerak ke daerah yang muatannya
berlawan, dengan kecepatan migrasi berdasarkan bobot molekulnya. Dalam hal
ini, DNA bermuatan negatif sehingga akan bergerak dari kutub negatif ke kutub
positif pada elektroforesis.
132.
III.

Teori Umum
133.

Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu teknik atau

metode replikasi DNA tanpa menggunakan organisme. Dengan teknik ini, DNA
dapat dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu relatif singkat sehingga
memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Pada dasarnya PCR
menggunakan suhu untuk amplifikasi DNA. Suhu diatur sedemikian rupa agar
terjadi proses denaturasi, annealing (penempelan), dan elongasi. Setelah melalui
proses ini, fragmen DNA hasil amplifikasi akan terbentuk. Fragmen DNA ini
akan

diuji

bobot

molekul

dan

kemurniannya

dengan

elektroforesis.

Elektroforesis adalah sebuah metode separasi atau pemisahan sebuah molekul

besar dari campuran molekul yang serupa. Elektroforesis digunakan untuk
memisahkan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat
migrasinya dalam sebuah medan listrik.
134. DNA dan protein merupakan senyawa polimer yang terdapat dalam
makhluk hidup. Apabila dillakukan isolasi DNA atau protein tertentu baik dari
sel mikroba, tanaman ataupun manusia biasanya masih berupa campuran
sehingga perlu dilakukan permisahan dan karakterisasi lebih lanjut. Salah satu
metode yang digunakan adalah elektroforesis, dimana DNA dan protein dalam
matriks yang berpori (gel) diletakkan pada medan listrik yang memiliki kutub
negatif dan positif. Berdasarkan bobot molekulnya, DNA dan protein akan
terpisah dan bergerak ke kutub yang muatannya berlawanan. DNA yang
bermuatan negaif akan bergerak ke kutub positif. Protein dibuat linier dan
23

bermuatan negatif dengan pemanasan, penambahan senyawa pereduksi dan

Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) sehingga akan bergerak ke kutub positif. Gel
yang digunakan pada elektroforesis DNA adalah gel agarosa sedangkan untuk
protein digunakan gel poliakrilamid. Elektroforesis protein disebut Sodium
Dodecyl Sulfate-Poliacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE).Tahap akhir
elektroforesis adalah visualisasi DNA/protein menggunakan pewarna/molekul
yang dapat mengikat atau berinteraksi dengan DNA/protein. Untuk menentukan
bobot molekul, elektroforesis dilakukan bersamaan dengan suatu marka
DNA/protein target dihitung berdasarkan kurva logaritma bobot molekul
senyawa target terhadap jarak migrasinya.
IV.Alat dan bahan
a. Alat dan Bahan untuk Deteksi DNA dengan teknik PCR
b. Alat dan bahan untuk Elektroforesis DNA dan Protein
c.
d. a.1. Alat

f. a.2. Bahan

Tabung PCR 100 l

2 l Cetakan DNA

Pipet mikro 10 dan 50 l

0,3 l Taq DNA polymerase

Thermocycler

Alat elektroforesis DNA dan power

0,5 l dNTP 10mM

supply

0,7 l MgCl2 25 mM

Sentrifuga

2,5 l Buffer PCR 10x

Rak tabung Eppendorf

Agarose

Tempat es dan es

Etidium bromida

Loading bufferDNA

Parafilm

0,5 l P1 30 mM

0,5 l P2 30 mM

18 l Aqua bidest

Larutan TAE 1x steril

e.

5 IU/l

g. b.1. Alat

Brom fenol biru

n. b.2. Bahan

h. - Kit Elektroforesis DNA dan

o. - Larutan TAE 1x steril

24

Protein
i. - Mikropipet
j. - Erlenmeyer
k. - Transluminator ultraviolet
l.

p. - EtBr (Etidium Bromida )

10mg/ ml
q. - Loading buffer DNA dan
Protein
r. - Agarosa

m.

s. - Akrilamid 30%
t. - Separting buffer
u. - Stacking buffer
v. - APS 10% (Ammonium
persulfat )
w. - TEMED
x. - Buffer elektroforesis
y. - Coomasie blue
z. - Larutan staining dan
destaining

aa.
ab.

25

emuabhndicprkHsltofvS

V. Prosedur kerja
ac. Diagram 5.1. Diagram Alir Prosedur Kerja PCR dan Elektroforesis DNA

Alat Bio-Rad Mini

Lempeng
Protean
kaca,
II disiapkan
spacer, dan alat
Gel pencetak
sandwichgel
disusun
dibersihkan
dengandan
menyelipkan
dikeringkan
lempengan kaca yang dis

APS 10% dan TEMED dimasukkan

Separatingpaling
gel 12%
akhir.
(b/v)
Aquades
dan dimasukkan
stacking gel ke
4%ruang
(b/v) pencetak
disiapkangel untuk memastikan tidak a

separating dimasukkan
garis batas
dengan
gel stacking
Campuran Gel
di homogenkan
lalu di tuangkekedalam
dalamgel
gelsandwich
sandwichsecara perlahan hingga
Dibiarkan
hingga
memadat

elipkan pada gel stacking secara

Gel hati-hati
stacking sampai
di masukkan
Padamenyentuh
persiapan
ke dalam
gel
bagian
sandwich
stacking,
atas dari
APS
secara
gel10%
separating
perlahan
dan TEMED
hinga penuh
10 di tambahkan untuk me

Dibiarkan hingga memadat

Campuran sampel protein dididihkan selama 10-15 menit lalu dihom
il dalam jumlah yang setara ( untuk protein murni minimal mencapai 1 atau leih ) dan ditambhakan sampel buffer 2x ( 10 sa

ae.
af.
ag.
ah.
ai.
aj.

Pada gel yang sudah memadat,

Aquades
sisirditambahkan
penceta k sumur
untukditarik
mengeluarkan
Gel sandwichgelembung
dimasukkan
udara
ke dalam
pada sumur
chamber elektroforesis elek

Sampel
protein
dimasukkan
menggunakan
20 buffer
dan juga
marka protein
SDS-PAGE dilakukan
pada
tegangan
125 V selama
45 menitmikropipet
Chamber sebanyak
diisi dengan
elektroforesis
hingga sumur p

Gel di destaining untuk menghilangkan sisa staining

s distainingdengan cara merendam gel ke dalam solution Coomasie blue selama 15 menit

ak.
al.
am.
an.

ao.
ap.
aq.
ar.
as.
at.
au. Diagram 5.2. Diagram Alir Prosedur Kerja Elektroforesis Protein
av.
aw.
ax.
ay.
az.
ba.
bb.
bc.
bd.
VI.

Hasil Pengamatan dan Perhitungan

be.
bf.
bg.
bh.
bi.
bj.
bk.
bl.
bm.
bn.
bo.
bp.
bq. Gambar 6.1. Hasil Elektroforesis DNA
br.
bs.Tabel 6.1. Hasil Perhitungan Jarak Migrasi Molekul DNA

bt.

BM (dalam
base
bw.
bz.
cc.
cf.
ci.
cl.
co.
cr.
cu.
cx.
da.
dd.
dg.
dj.
dm.

bu.

pair)
3000
2500
2000
1500
1200
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100

Jarak

bv.

Migrasi (cm)
bx.
2.3
ca.
2.5
cd.
2.7
cg.
3.2
cj.
3.6
cm.
3.8
cp.
4.0
cs.
4.2
cv.
4.4
cy.
4.6
db.
4.9
de.
5.2
dh.
5.6
dk.
6.0
dn.
6.5
dp.

log BM

by.
cb.
ce.
ch.
ck.

3.477121255
3.397940009
3.301029996
3.176091259
3.079181246
cn.
3.000
cq.
2.954242509
ct.
2.903089987
cw.
2.84509804
cz.
2.77815125
dc.
2.698970004
df.
2.602059991
di.
2.477121255
dl.
2.30102996
do.
2.000

4.0
3.5
3.0

f(x) = - 0.32x + 4.22

R = 0.99

2.5
log BM 2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
2

2.5

3.5

4.5

5.5

6.5

Jarak Migrasi (cm)

dq. Grafik 6.1. Grafik Logaritma Bobot Molekul DNA terhadap Jarak Migrasi
dr.
ds. Persamaan regresi yang didapat adalah

y=0,3204 x+4,2225

dt. Jarak sumur ke pita paling terang sebagai jarak migrasi (x) adalah 6,2 cm
sehingga:
du.

y=0,3204(6,2)+4,2225=2,23602

dv.
1. Perhitungan Bobot Molekul DNA
dw. BM (Bobot Molekul) = anti log y
dx.

= anti log (2,23602)

dy. BM (Bobot Molekul) = 172,194 bp

dz.
ea. 2. Persentase galat
eb.
ec. galat=
ed.

192 bp X
100
192bp

ee. galat= 192 bp172,194 bp 100

192 bp

ef.
eg.
eh.

3.Kemurnian DNA sampel

ei.

BM DNA sampel
172,194
100 =
100 =89 , 684
192
192
ej.
ej.
ej.
ej.
ej.
ej.

ej. Gambar
6.2. Hasil Elektroforesis Protein
ek. Tabel 6.2. Hasil Perhitungan Jarak Migrasi Molekul Protein
el.

BM (kDa)
eo.
116,0
er.
66,2

em.

JarakMigrasi (cm)
ep.
0.9
es.
1.5

en.
log BM
eq.
2.064457989
et.
1.820857989

eu.
ex.
fa.
fd.
fg.

45,0
35,0
25,0
18,4
14,4

ev.
ey.
fb.
fe.
fh.

2.5
3.5
4.1
4.8
5.5
fj.

ew.
ez.
fc.
ff.
fi.

1.653212514
1.544068044
1.397940009
1.264817823
1.158362492

2.5
2.0

f(x) = - 0.18x + 2.16

R = 0.98

1.5
log BM

1.0
0.5
0.0
0

Jarak Migrasi (cm)

fk.
fl. Grafik 6.2. Grafik Logaritma Bobot Molekul Protein terhadap Jarak Migrasi
fm.
fn.

Persamaan regresi yang didapat adalah

fo.
sehingga:

y=0,1848 x+2,1595

Jarak sumur ke pita paling terang sebagai jarak migrasi = 2,6 cm

fp.

y=0,1848(2,6)+2,1595

1,67902

fq.
fr.

Perhitungan Bobot Molekul DNA

fs.

BM (Bobot Molekul) = anti log y

ft.

= anti log (1,67902)

fu.

BM (Bobot Molekul) = 47,755 kDa

fv.
VII.

Pembahasan
fw.

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah metode replikasi DNA

secara in vitro (di luar tubuh organisme). Prinsip kerja PCR adalah
memanfaatkan suhu untuk menghasilkan sejumlah DNA dalam waktu yang
relatif singkat. Proses PCR dapat menghasilkan fragmen DNA target dalam

jumlah besar sehingga banyak dimanfaatkan pada berbagai aplikasi biologi

molekular. Beberapa aplikasi yang memanfaatkan PCR, antara lain:
1. Memperkuat gen spesifik sebelum diklon.
2. Membuat fragmen gen DNA dalam jumlah besar.
3. Mendeteksi atau mendiagnosis DNA sel embrionik yang mengalami
kelainan sebelum dilahirkan.
4. Mengetahui kekerabatan antar spesies.
5. Tes DNA.
fx.

Terdapat tiga tahapan penting dalam PCR, yaitu denaturasi,

penempelan primer atau disebut annealing, dan elongasi. Sebelum ketiga tahap
tersebut dilakukan, mesin PCR (thermo cycler) diatur pada program suhu 94C
selama 5 menit sebagai tahap persiapan denaturasi. Tahapan pra-PCR ini
dilakukan untuk memastikan suhu sudah mencapai 94 C. Selanjutnya, suhu
diatur pada 94 C selama 1 menit untuk tahap denaturasi. Pada tahap ini, ikatan
hidrogen DNA terputus sehingga untai ganda DNA berubah menjadi untai
tunggal. Untai tunggal ini bersifat tidak stabil dan siap menjadi tempat
penempelan primer. Tahap berikutnya adalah annealing atau penempelan pada
suhu 50-65C selama 1 menit. Pada tahap ini primer menempel pada bagian
DNA yang berkomplementer urutan basanya. Setelah itu adalah elongasi atau
pemanjangan pada suhu 72C selama 1 menit. Pada tahap ini, terjadi
pemanjangan primer hingga terbentuk fragmen untai ganda DNA yang utuh.
Ketiga tahap di atas diatur untuk dilakukan pengulangan sebanyak 25-35 kali
sehingga dapat menghasilkan banyak fragmen DNA. Tahap paling akhir adalah
proses pasca-PCR yang dilakukan pada 72C selama 10 menit untuk
memastikan setiap fragmen DNA yang terbentuk telah mengalami proses
pemanjangan secara utuh.
fy.

Dalam proses PCR, terdapat beberapa komponen utama sebagai bahan

untuk membuat campuran PCR atau PCR mixture, yaitu:

1. DNA cetakan

fz.

DNA cetakan merupakan fragmen DNA yang akan dilipatgandakan.

DNA fragmen berfungsi sebagai cetakan untuk pembentukan molekul DNA

baru yang sama. DNA cetakan ini dapat berupa DNA kromosom, DNA
plasmid, ataupun fragmen DNA lain asalkan di dalam DNA cetakan tersebut
terdapat fragmen DNA target yang dituju.
2. Oligonukleotida primer
ga.

Oligonukleotida primer adalah suatu sekuen oligonukleotida pendek

(15-25 basa nukleotida) yang digunakan untuk mengawali sintesis rantai

DNA. Primer yang digunakan dalam PCR ada dua, yaitu oligonukleotida
yang mempunyai sekuen yang identik dengan salah satu rantai DNA cetakan
pada ujung 5-fosfat dan oligonukleotida yang kedua identic dengan sekuen
pada ujung 3-OH rantai DNA.
3. Desoksiribonukleotida trifosfat (dNTP)
gb.

Campuran dNTP adalah larutan air pada pH 7,0 yang mengandung

dATP, dCTP, dGTP, dan dTTP. Masing-masing terdapat pada konsentrasi

akhir baik 10 mM atau 25 mM. DNTP berfungsi sebaga penyedia nukleotida
dalam proses elongasi.
4. Taq DNA Polimerase
gc.

Taq DNA polimerasi berasal dari bakteri Thermus aquaticus, yang

bersifat termostabil pada suhu tinggi saat denaturasi. Taq DNA polymerase
tersusun atas satu rantai polipeptida dengan berat molekul kurang lebih 95
kD. Enzim ini memiliki kemampuan polimerasi DNA yang sangat tinggi.
Taq DNA polimerase mempunyai suhu optimum yang cukup tinggi untuk
sintesis DNA yaitu 75-80 C.Aktivitas spesifik enzim ini dalam
menggabungkan nukleotida mencapai 150 nukleotida per detik per molekul
enzim. Taq DNA polimerase mempunyai keunikan yaitu mampu
menambahkan satu nukleotida, terutama dATP, pada ujung 3 fragmen DNA
hasil polimerasi meskipun tanpa adanya cetakan.Dengan demikian,

ujungfragmen DNA hasil polimerasi dengan metode PCR pada umumnya

tidak pepat, melainkan ada tambahan satu nukleotida pada kedua ujungnya.
5. Buffer dan MgCl2
gd.

Buffer standar untuk PCR tersusun dari 50 mM KCl, 10 mM Tris-Cl

(pH 8,3) dan 1,5 mM MgCl2. Buffer standar ini bekerja denganbaik untuk
DNA cetakan dan primer dengan kondisi tertentu. MgCl2berperan sebagai
kofaktor yang menstimulasi aktivitas DNA polimerasi dan meningkatkan
interaksi primer dengan cetakan.Selain itu, konsentrasi ion magnesium
dalam PCR merupakan faktor yang penting karena dapat mempengaruhi
suhu disosiasi untai DNA cetakan dan produk PCR.
ge.

Setelah menyelesaikan semua tahap yang telah diprogram pada

thermo cycler, perlu dilakukan elektroforesis terhadap produk PCR untuk

mengetahui apakah benar telah dihasilkan produk DNA yang baru dan
memastikan produk PCR yang dihasilkan tersebut merupakan produk yang
dikehendaki. Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul
bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan
listrik. Ada beberapa jenis elektroforesis, yaitu:
1. Elektroforesis kertas
gf.

Elektroforesis kertas terdiri dari kertas sebagai fase diam dan partikel

bermuatan yang terlarut (terutama ion-ion kompleks) sebagai fase gerak.

Fase diam yang biasa digunakan yaitu kertas selulosa asetat. Pemisahan
tersebut terjadi karena adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem
pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau
valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi
elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan daya absopsi zat terlarut.
2. Elektroforesis kapiler
gg.

Elektroforesis kapiler adalah metode elektroforesis yang digunakan

untuk memisahkan asam amino, protein, lipid, karbohidrat, dan nukleotida

dengan resolusi tinggi yang dilakukan pada pipa kapiler berisi buffer.
Metode ini menggunakan listrik bertegangan tinggi yang menyebabkan
semua komponen ion atau molekul netral bergerak ke katoda. Deteksi dapat

dilakukan dengan teknik pendeteksian spektrometri atau elektrokimia.

Teknik pemisahan ini dipengaruhi oleh tegangan listrik, koefisien difusi,
panjang, dan diameter pipa kapiler, serta konsentrasi sampel.
3. Elektroforesis gel
gh.

Elektroforesis gel menggunakan gel sebagai fase diam untuk

memisahkan molekul-molekul seperti DNA dan protein menjadi pita-pita

yang masing-masing terdiri atas molekul-molekul dengan panjang yang
sama. Teknik yang digunakan yaitu memberi gaya pada makromolekul
tersebut untuk melewati medium berisi gel yang dibantu dengan tenaga
listrik. Elektroforesis gel memisahkan berdasarkan laju perpindahannya
melewati suatu gel di bawah pengaruh medan listrik. Komponen umum
dalam elektroforesis gel yaitu (Birren & Lai, 2007) loading buffer, running
buffer, sisir sebagai pembentuk sumur pada gel, tray

sebagai cetakan

gel, chamber sebagai wadah gel, sumber listrik untuk memberi arus saat
proses elektroforesis, larutan elektrolit sebagai larutan pembawa komponen,
umumnya buffer dengan pH tertentu, dan elektroda dengan anoda dan
katoda yang dihubungkan arus listrik.
gi.

Elektroforesis gel umumnya menggunakan gel agarosa untuk

elektrofesis DNA dan gel poliakrilamid untuk elektroforesis protein sebagai

fase diam. Perbedaan kedua gel ini dapat dilihat pada tabel berikut (Fatchiyah,
2006):
gj.
gk.

Tabel 7. Perbandingan Gel Agarosa dan Gel Poliakrilamid

gl.

Gel Agarosa

gm.

Gel Poliakrilamid

hc.

Umumnya

hl.

Umumnya

No
.
gn.
1.
go.
gp.
gq.
gr.
2.
gs.
3.
gt.

memisahkan

memisahkan

fragmen DNA berukuran 100bp

protein berukuran 5-200 kDa,

50kb, namun bisa juga protein

namun bisa juga DNA berukuran

berukuran > 200 kDa.

hd.
Resolusi lebih rendah
he.
Voltase lebih rendah
hf.
Mempunyai
laju

5-500 bp
hm.
hn. Resolusi lebih tinggi
ho.
Voltase lebih tinggi
hp.
Mempunyai
laju

pemisahan lebih cepat

hg.
Medan gerak

biasanya

pemisahan lebih lambat

hq.
Medan gerak biasanya

4.
gu.
gv.

horizontal
hh.
Preparasi gel lebih mudah

dan murah
5. hi.
Bersifat non-toksik
gw. hj.
Mudah rusak oleh tangan
hk.
Pita yang dihasilkan dapat
6.
gx. berkabut dan menyebar agak jauh
gy.

vertikal
hr. Preparasi gel lebih sulit
dan mahal
hs.
ht.

Toksik
hu.

7.
gz.
8.
ha.
9.
hb.
hv.
hw.

Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai hal berikut:

1. Membandingkan gen homolog dari spesies yang berbeda dan mengetahui

susunan sekuens berbagai genom.
2. Sidik jari DNA (DNA fingerprinting) dan mendeteksi kelainan genetik.
3. Mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu.
4. Mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme
atau percobaan perlakuan gen.
5. Mempelajari evolusi tingkat molecular dan variasi genetik yang ada di alam.
6. Menentukan atau mengidentifikasi berat molekul DNA, RNA, dan protein
tertentu.
7. Mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu.
8. Mengetahui jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan DNA
plasmid.
9. Menganalisis fragmen DNA yang diamplifikasi lewat PCR.
hx.

Ada beberapa hal yang harus diperhatikan dalam elektroforesis.

Dalam pengambilan bahan, mikropipet yang digunakan haruslah mikropipet

dengan range ukuran yang sesuai. Apabila tidak sesuai, maka mikropipet dapat
rusak. Tegangan ketika hendak menjalankan elektroforesis juga perlu
diperhatikan karena akan mempengaruhi hasil yang di dapat. Ketika melakukan

pewarnaan dan destaining, sebaiknya tidak boleh terlalu lama karena akan
menyebabkan hasil sulit dibaca ketika diamati di transluminator.
hy.

Pada percobaan ini, jenis elektroforesis yang digunakan adalah

elektroforesis gel. Pada dasarnya, elektroforesis memanfaatkan muatan listrik

yang terdapat pada makromolekul, dalam hal ini DNA yang bermuatan negatif.
Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, maka
molekul tersebut akan bergerak dari muatan negatif menuju muatan positif.
Faktor yang mempengaruhi pergerakan makromolekul dalam elektroforesis
yaitu:
a. Ukuran dan bentuk molekul
hz.

Molekul yang berukuran lebih kecil akan cepat bergerak melewati gel

karena hambatan yang akan dihadapi tidak lebih banyak dibandingkan

molekul berukuran besar. Molekul yang memiliki bentuk elips atau fibril
akan lebih cepat bergerak dibandingkan dengan yang berbentuk bulat.
Molekul berbentuk sekunder atau tersier memiliki pergerakan yang lebih
lambat dibandingkan dengan bentuk primer.
b. Konsentrasi gel
ia.

Semakin tinggi konsentrasi gel, pori-pori akan semakin kecil dan gel

akan semakin kaku sehingga pergerakan molekul menjadi lebih lambat.

Selain itu, dengan semakin tingginya konsentrasi gel ukuran molekul yang
dapat lewat juga semakin kecil.
c. Densitas muatan
ib.

Molekul dengan densitas muatan tinggi akan bergerak lebih cepat

dibandingkan molekul dengan densitas muatan yang rendah.

d. Pori-pori gel
ic.

Semakin kecil pori-pori gel yang digunakan, semakin lambat

pergerakan molekul.
e. Voltase
id.

Semakin tinggi tegangan listrik yang diberikan, semakin cepat

pergerakan molekul.
ie.
f. Larutan buffer elektroforesis

if.

Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik

sehingga mempercepat migrasi. pHbuffer berpengaruh pada titik isoelektrik

sehingga dapat mempengaruhi tingkat dan arah pergerakan protein.
g. Suhu
ig.

Pada elektroforesis, suhu akan mempengaruhi denaturasi protein

dimana pada elektroforesis digunakan suhu 90-95oC untuk mendenaturasi

protein.
ih.

Dalam elektroforesis DNA, terdapat beberapa komponen atau bahan

yang digunakan, yaitu:

1.

Gel agarosa
ii.

Gel agarosa adalah suatu polisakarida yang diekstraksi dari

berbagai jenis ganggang merah. Gel agarosa dapat digunakan untuk

pemisahan sampel DNA dengan ukuran 200 hingga 20.000 pasangan basa
(pb).
2.

Etidium Bromida
ij.

Etidium

bromida

merupakan

senyawa

yang

bersifat

karsionogenik.Etidium bromide digunakan untuk meningkatkan daya

fluoresensi dari DNA sehingga visualisasi DNA dapat dilihat dengan
jelas.Etidium Bromida bekerja dengan menyelip di sela-sela basa
nukleotida.
3.

Loading buffer
ik.

Loading buffer berfungsi untuk meningkatkan densitas sampel DNA

sehingga fragmen tersebut berada di dasar sumur dan tidak menyebar.

Buffer ini juga dapat membantu pergerakan sampel ke anoda. Loading
buffer pada elektroforesis DNA berisi pelarut ddH2O, pewarna Brom fenol
biru Blue, dan pemberat sukrosa. Brom fenol biru berfungsi untuk memberi
warna pada fragmen DNA sehingga mempermudah pengamatan proses
elektroforesis dalam memantau kecepatan molekul DNA bergerak dalam
gel. Sukrosa berfungsi sebagai pemberat sehingga sampel masuk ke dalam
sumur.
4.

TAE

il.

TAE merupakan running buffer yang berfungsi sebagai

penstabil DNA pada pH 8 dan buffer. Running buffer berfungsi sebagai

tempat pemisahan fragmen DNA, penyangga dan media penghantar listrik
yang tepat. Buffer TAE memiliki kapasitas buffering terendah tetapi
memberikan resolusi terbaik untuk DNA yang lebih besar. Ini berarti
tegangan yang digunakan lebih rendah dan menghabiskan lebih banyak
waktu, tapi produk yang dihasilkan lebih baik.
im.

Pada percobaan ini, konsentrasi gel agarosa yang dibuat adalah

sebesar 1%. Konsentrasi ini dibuat sesuai dengan ukuran DNA yang akan
melewatinya. Apabila konsentrasi yang dibuat lebih tinggi dari 1%, maka gel
yang terbentuk akan menjadi lebih padat dan sulit dilalui oleh DNA.
Sebaliknya, apabila konsentrasi yang digunakan lebih rendah, pori-pori gel
menjadi terlalu besar sehingga gel terlalu cepat dilalui oleh DNA.
in.

Sebelum memadat, larutan agarosa dimasukkan kedalam cetakan yang

telah dipasang sisir. Sisir berfungsi untuk membuat sumur-sumur pada gel
agarosa. Sumur-sumur tersebut digunakan sebagai tempat meletakkan sampel
DNA yang akan dielektroforesis. Salah satu sumur diisi dengan marka DNA
sebagai pembanding dalam mengukur jarak migrasi DNA. Sumur-sumur
lainnya diisi dengan larutan sampel yang dibuat dari campuran loading buffer
dan produk PCR, yaitu dengan perbandingan 1:5. Larutan sampel dimasukkan
ke

dalam

sumur-sumur

yang

terbentuk

menggunakan

mikro

pipet.

Selanjutnya, elektroforesis dilakukan pada 80 volt selama 45 menit untuk

memastikan sampel sudah bermigrasi secara sempurna. Apabila voltase yang
digunakan lebih besar, maka waktu yang diperlukan akan menjadi lebih
singkat. Hasil elektroforesis DNA divisualisasi di atas transluminator Ultra
Violet supaya hasil dapat diamati dengan jelas. Hal ini dilakukan karena
terdapat EtBr (EtidiumBromida) di dalam gel yang bersifat karsinogenik. Hasil
penyinaran dengan sinar UV tersebut menghasilkan garis-garis terang pada gel
agarosa.
io.

Berdasarkan hasil perhitungan regresi jarak migrasi pada marka dan

logaritma berat molekul dalam satuan bp (base pair), diperoleh persamaan

regresi

y=0,3204 x+4,2225

. Jarak sumur ke pita paling terang sebagai

jarak migrasi adalah sebesar 6,2 cm sehingga diperoleh berat molekul sampel
DNA adalah 172,194 bp. Dengan demikian, didapatkan persentase kemurnian
sampel DNA sebesar 89,684%. Akan tetapi, diperoleh persentase galat
percobaan sebesar 10,3156%. Hal ini dapat terjadi akibat beberapa faktor
kesalahan, seperti jumlah zat yang kurang tepat saat pembuatan campuran
PCR, proses PCR yang kurang sempurna, konsentrasi agarosa yang kurang
tepat, yaitu lebih besar sehingga pori-pori agarosa menjadi lebih kecil, dan
pengukuran jarak migrasi yang kurang teliti.
ip.

Pada elektroforesis protein atau disebut dengan SDS-PAGE (Sodium

Dodecyl Sulfate Poliacrylamide Gel Electrophoresis), komponen-komponen

yang diperlukan, yaitu:
1. Poliakrilamid
iq.

Poliakrilamid merupakan fasa diam pada elektroforesis protein.

Polikarilamid berfungsi untuk mencegah difusi akibat timbulnya panas pada

arus listrik. Media ini dipilih karena memiliki ukuran pori-pori yang lebih
kecil sehingga dapat memisahkan molekul protein yang kecil dan perbedaan
protein dapat teramati. Konsentrasi akrilamid total dalam gel dapat
mempengaruhi migrasi protein. Poliakrilamid merupakan hasil polimerisasi
secara spontan dari akrilamid dan bisakrilamid jika tidak terdapat oksigen.
2. Separating buffer
ir.

Separating buffer berfungsi untuk memisahkan atau menseparasi

protein berdasarkan berat molekulnya.

3. Stacking buffer
is.

Stacking bufferberfungsi untuk mencetak sumur, menimbun atau

memekatkan protein menjadi satu jalur yang sempit sebelum protein itu
memasuki gel pemisah dan menahan sementara agar sampel bermigrasi
pada waktu yang bersamaan.
4. SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)
it.

SDS

merupakan

detergen

anionik,

yang

apabila

dilarutkan

molekulnya memiliki muatan negatif dalam range pH yang luas. SDS

berfungsi memberikan muatan negatif pada protein yang akan dianalisis.

Selain itu, SDS dapat mendenaturasi protein, mempermudah menyamakan

kondisi, dan menyederhanakan protein (bentuk, ukuran, dan muatan).
Muatan negatif SDS akan menghancurkan sebagian stuktur kompleks
protein dan secara kuat tertarik ke arah anoda bila ditempatkan pada suatu
medan listrik.
iu.
iv.

Dalam pembuatan gel separating dan stacking, terdapat beberapa

bahan yang digunakan seperti TrisHCl, SDS, APS dan TEMED. TrisHCl
merupakan buffer pada gel dengan pH dan konsentrasi yang berbeda untuk
masing-masing gel (1.5 M dengan pH 8.8 untuk gel separating dan 0.5 M
dengan pH 6.8 untuk gel stacking). TrisHCl pH 6,8 berguna untuk
menstabilkan pH buffer agar muatan dari protein tidak berubah dan pH 8,8
berguna untuk mendapatkan pori-pori yang lebih kecil sehingga protein akan
terseparasi dengan baik. Saat proses elektroforesis (running), pH 8,8 menjaga
protein agar tetap dalam keadaan muatan negatif dan pH 6,8 berfungsi agar
kondisi pH stacking gel berada di bawah isoelektrik protein (pH 8) sehingga
protein akan tersusun secara berjajar pada bagian bawah dari stacking gel.
Metode yang digunakan dalam elektroforesis protein adalah metode vertikal.
SDS berguna untuk memberikan muatan negatif pada protein. APS digunakan
sebagai katalisator dalam polimerasi gel poliakrilamid dan TEMED digunakan
sebagai katalisator pembentukan radikal bebas dari ammonium persulfat serta
sebagai pemadat. Oleh karena itu, APS dan TEMED pencampurannya
dilakukan terakhir agar larutan tidak menjadi padat terlebih dahulu sebelum
seluruh bahan tercampur. Protein yang digunakan dalam elektroforesis gel
sebelumnya didenaturasi dengan menggunakan SDS dan memutus ikatan
disulfida pada struktur protein menggunakan beta-merkaptoetanol. Hal ini
bertujuan agar protein memiliki struktur primer yang seragam.
iw.
Seperti prosedur kerja pada elektroforesis pada DNA, sumursumur yang telah terbentuk pada stacking gel diisi dengan larutan sampel yang
dibuat dari campuran loading buffer dan sampel protein, yaitu dengan
perbandingan 1:4. Selanjutnya, SDS-PAGE dilakukan pada 125 volt selama 45
menit. Gel hasil elektroforesis direndam dalam larutan staining untuk diwarnai
selama 15 menit, lalu dilakukan proses destaining selama satu malam untuk

menghilangkan larutan staining. Sebagian besar komposisi larutan staining dan

destaining sama, hanya saja larutan destaining tidak mengandung zat
pewarna Coomassie Brilliant Blue.
ix.

Hasil elektroforesis protein yang telah melalui proses destaining

selama 24 jam menunjukkan adanya garis-garis berwarna biru pada gel yang
menandakan jarak migrasi protein. Setelah dilakukan pengukuran jarak
migrasi, diperoleh persamaan

y=0,1848 x+2,1595

yang didapat dari

perhitungan regresi jarak migrasi pada marka dan logaritma berat molekul
dalam satuan kDa (kilo Dalton). Jarak migrasi protein adalah sebesar 2,6 cm
sehingga diperoleh berat molekul sampel protein adalah 47,755 kDa.
iy.
VIII.

Kesimpulan
1. Bobot molekul DNA sampel adalah 172,194 pasangan basa.
2. Bobot molekul protein sampel adalah 47,755 kDa atau 47.755 Dalton.
3. Persentase kemurnian DNA sampel adalah
iz.
ja.
jb.
jc.
jd.
je.
jf.
jg.
jh.
ji.
jj.
jk.
jl.
jm.
jn.
jo.

89,684

jp.
jq.
jr.
js.
jt.
ju. DAFTAR PUSTAKA
jw.
jx.

jy.

jz.
ka.

kb.
kc.
kd.
ke.
kf.
kg.
kh.

ki.

jv.
Birren, B. dan E. Lai. 1993. Pulsed field gel electrophoresis: a practical guide.
San Diego: Academic Press, Inc.
Blair, J.M.A., Webber, M.A., Baylay, A.J., dan Piddock, L.J.V. 2015.
Molecular Mechanisms of Antibiotic Resistance. Nature Reviews
Microbiology. Halaman 42-51.
Burkhulailah. 1995. Studi Hubungan Kadar Senyawa Aktif Sulfametoksazol,
Trimetoprim, dan Kotrimoksazol yang Ditetapkan Secara Spektrofotometri
Lembayung Ultra dengan Diameter Hambatan Terhadap Bakteri Escherichia
Coli ATCC 10536. Surabaya: Universitas Airlangga, hal 18-19
Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 1995. Farmakope Indonesia Edisi
IV. Jakarta :Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Halaman 891.
Entjang, Indan. 2003. Mikrobiologi dan Parasitologi Untuk AKademi
Keperawatan Dan Sekolah Tenaga Kesehatan Yang Sederajat. Bandung: Citra
Aditya Bakti
Fatchiyah. 2006. Gel Elektroforesis. Malang: Lab Sentral Biologi Molekuler
dan Seluler Departemen Biologi Universitas Brawijaya
Jawetz, et.al. 2004. Mikrobiologi Kedokteran Edisi 20. Jakarta : Buku
Kedokteran EGC. Halaman 451.
Kee, J.L. dan Evelyn, R.H. 1996. Farmakologi: Pendekatan Proses
Keperawatan Cetakan I. Jakarta: Buku Kedokteran EGC
Madigan, Michael T. dan John M.Matinko. 2015. Brock Biology of
Microorganism. USA: Prentice Hall, halaman 319-320
Magdeldin, Sameh. 2012. Gel Electrophoresis Principles and Basics,
Croatia: InTech Publisher
Pelezar, J., M.E.C.S., Chan.1998. Dasar Dasar Mikrobiologi Jilid 2. Jakarta :
UI Press. Halaman 530-535 dan 901
http://ffarmasi.unand.ac.id/bahanajar,rpkps,jurnal,buku,cv/BA.RPKPS/Akmal/
Akmal%20Djamaan%20(Bhn%20Ajar%20Mikfar%20II).pdf, diakses pada 8
November 2015, pukul 15.12 WIB
http://fungsi.web.id/2014/09/perbedaan-antara-vaksin-dan-antibiotik.html,
diakses pada 7 November 2015 pukul 18.32

kj.

http://lsihub.lecture.ub.ac.id/category/bakteri/, diakses pada 6 November 2015,

pukul 11.38 WIB

kk.

https://modmedmicrobes.wikispaces.com/Sarcina+Lutea,
November 2015, pukul 11.34 WIB

kl.

diakses

pada