Tanggal Pengumpulan
: 21 November 2014
disusun oleh :
Rahayu Jatiningsih
10612014
Kelompok 13
Asisten :
Riesa K.W.R
10611047
BAB I
PENDAHULUAN
1.1
Latar Belakang
DNA merupakan komponen terpenting yang dimiliki oleh mahluk hidup,
karena DNA adalah satuan fungsional terkecil yang pasti dimiliki oleh makhluk
hidup baik tanaman, binatang, manusia, bahkan bakteri. Untuk itulah, kegiatan
mempelajari DNA sangat dibutuhkan terutama dalam perkembangan ilmu
genetik. Tentunya ketika kita mempelajari DNA, isolasi terhadap DNA tersebut
penting untuk dilakukan. Isolasi DNA juga dibutuhkan dalam menyelidiki kasus
tertentu seperti pembunuhan, pencurian, dsb. (Haris et al., 2005).
Pada praktikum kali ini hal yang dilakukan salah satunya adalah isolasi
DNA. DNA yang digunakan bukanlah DNA genom melainkan DNA plasmid,
karena Plasmid memiliki suatu kekhususan yaitu mudah disisipi oleh gen lainnya
dan mampu bereplikasi beberapa kali dalam satu kali masa replikasi,
menyebabkan jumlahnya dapat bertambah dengan sangat cepat (Szczepanowski,
2008). Dari sifat khas itu, plasmid sering dimanfaatkan untuk menjadi vektor
suatu gen atau untuk menghasilkan ekspresi gen yang besar, seperti pada produksi
insulin. Penjelasan tersebut cukup mendukung pemilihan DNA plasmid dalam
percobaan dibandingkan DNA genom.
Dalam mempelajari DNA tentu saja tidak terlepas dari adanya suatu gen. Pada
gen terdapat urutan basa nukleotida yang membentuk rantai ganda yaitu DNA itu
sendiri. Ketika melakukan Amplifikasi Gen, sequence DNA ikut diperbanyak.
Amplifikasi gen sangat dibutuhkan dalam ilmu Rekayasa Genetika, pengetahuan
dalam ilmu forensik, serta diagnosis penyakit. Amplifikasi gen dapat dilakukan
dengan metode PCR.
terbaik untuk menyediakan jumlah DNA yang banyak dari sampel suatu segmen
DNA yang tersedia dalam jumlah sedikit. Dalam waktu hitungan jam, sampel
DNA yang diperbanyak bisa berkembang jumlahnya menjadi jutaan kali lipat,
cukup untuk menyediakan DNA dalam sumber penelitian (Reece, 2012).
Elektroforesis
digunakan
untuk
pengamatan
DNA
dalam
1.2
Tujuan
1. Mengisolasi DNA plasmid PGEMT-easy dengan metode alkalin lisis
2. Mengamplifikasi promotor Gen MaEXPA1 dari DNA plasmid PGEMTeasy yang diisolasi dengan metode PCR
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Plasmid
Plasmid sering disebut sebagai DNA sirkuler. Hanya beberapa organisme
yang memiliki Plasmid tersebut, seperti tanaman yang memiliki klorofil,
prokariot, dan mitokondria. Plasmid merupakan DNA ekstrakromosomal, hal
inilah yang membedakannya dengan DNA genom yang berada dalam
kromosom (Alberts, 2012). Plasmid memiliki suatu kekhususan yaitu mudah
disisipi oleh gen lainnya dan mampu bereplikasi beberapa kali dalam satu kali
masa replikasi, menyebabkan jumlahnya dapat bertambah dengan sangat cepat
(Szczepanowski, 2008).
Plasmid pada umumnya memiliki struktur tersier yang sangat kuat dan
kompak, yang biasanya membentuk sirkular. Sedangkan DNA genom jauh
lebih longgar pada ikatan di kedua untaiannya sehingga menyebabkan DNA
genom mudah sekali terdegradasi dibandingkan DNA plasmid (Susanto,
2012). Plasmid yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah PGEMT-easy
yang digambarkan pada peta plasmid berikut,
pada tahun 1993 atas hasil penemuannya ini. Masalah yang timbul sebagai awal
penciptaan PCR ini adalah bagaimana cara meneliti tentang suatu rantai DNA,
namun sumber DNA yang tersedia hanya sedikit. Maka diciptakanlah metode
PCR yang bisa masih bisa dimanfaatkan oleh para ahli di bidang genetika sampai
sekarang (Lo, 2006).
Menurut Lo (2006), prinsip dasar yang dilakukan PCR sebenarnya sangat
sederhana, karena PCR memiliki prinsip kerja berlandaskan terjadinya replikasi
DNA yang terjadi selama proses pembelahan sel. Siklus PCR dapat dilihat pada
gambar 2.2 berikut ini,
1
3
6
2
Keterangan :
5. Elongasi n
1. Denaturasi 1
6. Cooldown
2. Denaturasi 2,3,...,n
Dari
profil
di
atas,
terjadi
3. Annealing
pengulangan proses 2 3 4
4. Elongasi 1,2,...,n-1
2.3 Elektroforesis
Elektroforesis adalah suatu teknik yang dapat mengukur laju perpindahan
atau pergerakan partikel-partikel bermuatan dalam suatu medan listrik. Prinsip
kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-partikel bermuatan
negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub positif
(anoda), sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak
menuju kutub negatif (anoda). Elektroforesis digunakan untuk mengamati hasil
amplifikasi
dari
DNA.
Hasil
elektroforesis
yang
terlihat
adalah
Konsentrasi
BAB III
METODOLOGI
Alat
Bahan
Alat Sentrifuga
Vortex
Mikropipet
Mikrotube 1,5 ml
Tips
300 l solution I
Inkubator
400 l solution II
Alat Elektroforesis
Isopropanol
membuat agarosa
EtOH 70 %
TE 50 l pH 8,0
Tangki elektroforesis
Dream Taq 5 l
Sumber Arus
Primer forward 1 l
Mesin PCR
Primer Reverse 1 l
Deion
Alat pemanas
DNA template 1 l
dNTPs
MgCl2
Agarosa
TAE 50x
10 ml 0,5 M EDTA
Loading buffer 6x
40 % sukrosa
berisi sampel dimasukan kedalam mesin PCR. Lalu mesin PCR di running
Reaksi yang pertama dimulai sesuai dengan siklus yang ada, yaitu
denaturasi awal (suhu 92) selama 2 menit, kemudian diikuti 30 siklus
yakni denaturasi selama 15 detik pada suhu 95, penempelan primer selama
30 detik pada 55, kemudian pemanjangan primer pada suhu 75 selama 2
menit. Lalu siklus ini akan diikuti dengan pemanjangan primer pada suhu
72 selama 7 menit.
3.2.3 Elektroforesis
Cetakan gel diletakan pada pencetak sumur, kemudian dicampurkan
Agarosa dan TAE 1x lalu di didihkan. Setelah itu ditambahkan 1 l EtBr, di
campur dan dituangkan. Kemudian didiamkan hingga gel mengeras. Setelah
gel dalam cetakan mengeras, diletakan pada alat elektroforesis. Di tuang
buffer TAE 1x hingga mencapai tinggi 1 mm diatas gel. Dilepaskan
pencetak sumur dan dicampur dengan 10 l DNA dengan 2 l loading
buffer. Setelah itu dimasukan ke dalam sumur gel lalu dihubungkan dengan
alat elektroforesis dengan sumber arus pada 70 volt hingga bromfenol
sampai ke ujung gel. Setelah itu sumber arus dimatikan dan dikeluarkan dari
tangki gel. Jika jumlah DNA terlalu sedikit dengan pewarnaan methyl
green, maka dicelupkan gel dalam 0,2 0,5 g/ml EtBr dalam buffer TAE
1x selama 10 60 menit. Lalu EtBr dihilangkan dari gel dengan
dipindahkan dalam buffer TAE 1x selama 10 - 60 menit
BAB IV
HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN
4.2 Pembahasan
4.2.1 Metode Isolasi dengan Alkalin Lisis
Dalam praktikum kali ini, digunakan tiga jenis larutan yaitu solution I,
solution II, dan solution III. Solution I berisi gabungan senyawa glukosa,
Tris-Cl dan EDTA yang berfungsi secara keseluruhan untuk menjaga
keutuhan DNA sel E.coli dengan membentuk resuspensi buffer antara
larutan dan bakteri E.coli. Menurut Tyler Mall (2013), glukosa pada
solution I berfungsi sebagi larutan isotonis yang menjaga tekanan osmotik
pada sel E. coli.Larutan glukosa tidak dapat di simpan untuk waktu yang
lama dan harus disimpan dalam suhu 4C. Larutan EDTA merupakan
larutan chelates yang menginaktivasi berbagai macam enzim yang dapat
membahayakan DNA. Larutan Tris-Cl berfungsi sebagai agen larutan
penyangga yang menjaga pH resuspensi agar tetap pada pH 8. Solution II
terdiri atas larutan basa kuat NaOH dan SDS. Larutan basa kuat digunakan
karena isolasi plasmid ini menggunakan metoda alkalin lisis sehingga DNA
genome dan plasmid pada bakteri E.coli dapat terdenaturasi dengan
Jika dibandingkan dengan kelompok lain pun terlihat hasil yang sama, plasmid
telah berhasil di isolasi, hanya saja kelompok 11 menunjukan hasil yang smear.
Menurut Dube (2010), penyebab munculnya smear pada percobaan elektroforesis
DNA diantaranya adalah:
1. Terlalu banyak DNA yang dielektoforesis. Hal ini dapat diatasi dengan
mengurangi jumlah DNA yang digunakan. Dengan membatasi jumlah
komponen DNA yang diteliti, hasil elektroforesis yang didapat tentu akan
lebih akurat.
ekstraksi
Gambar 4.4
(Campbell, 2007)
Gambar 4.7 Rantai nukleotida yang baru terbentuk sebagai hasil ekstensi
(Campbell, 2007)
Gambar 4.9 Hasil elektroforesis PCR kelompok 13 yang dicocokan dengan Leader
(Dokumentasi pribadi, 2014) dan (thermosciencetificbio, 2012)
4.2.3 Elektroforesis
Beberapa reagen yang digunakan dalam percobaan elektroforesis
diantaranya agarosa, TAE, loading buffer, dan Etidium Bromidam, masingmasing reagen memiliki peran dan fungsi tersendiri yang amat mendukung
dan menentukan hasil akhir dari percobaan.
Reagen loading dye memiliki tiga fungsi utama yaitu untuk
menterminasi
reaksi
enzimatik
sebelum
elektroforesis,
menyediakan
kerapatan agar sampel dapat bergerak dalam sumur gel, dan menyediakan
cara untuk melihat pergerakan molekul DNA saat elektroforesis (Surzycki,
2003).
Loading dye mengandung bromofenol biru, xylene cyanol, dan orange
G yang digunakan untuk memvisualisasi sampel DNA. Pada agarosa 1 %,
xylene cyanol bergerak dengan kecepatan setara dengan 4000 bp DNA,
bromofenol biru bergerak dengan kecepatan setara dengan 200 bp DNA, dan
orange G bergerak dengan kecepatan setara dengan 200-400 bp DNA.
Biasanya loading dye juga mengandung gliserol atau sukrosa untuk
meningkatkan kerapatan DNA sehingga dapat masuk dan bergerak dalam
sumur gel (Elkins, 2013).
BAB V
KESIMPULAN
DAFTAR PUSTAKA
Campbell, N., et al. 2007 Biology : Eight Edition. California : Pearson.
Cheng, L., Zhang D. Y. 2008. Molecular Genetic Pathology. New Jersey :
Humana Press.
Haris N ., et al. 2005. Konstruksi Pusaka cDNA dari daun klon karet AVROS
2037 yang Diinfeksi Patogen Corynespora cassiicola. Menara Perkebunan,
Volume 2 (73), pp. 44-62.
Lo, Dennis., et al. 2006. Clinical Applications of PCR : Second Edition. New
Jersey : Humana Press.
Reece, J. B., et al. 2012. Campbell Biology Concept and Connections : Concept
and Connection. California : Pearson.