Berikut Pembahasan Laporan Elektroforesis Gel Agarosa

1. Pengertian elektroforesis
2. Tujuan dan manfaat elektroforesis
3. Cara kerja elektroforesis
4. Alat dan bahan yang digunakan, serta fungsinya
5. Macam agar yg bisa dipakai untuk elektroforesis
6. Macam-macam elektroforesis
7. Faktor-faktor yang mempengaruhi elektroforesis
8. Hasil elektroforesis rombongan
(Untuk hasil sertakan foto)
Selamat Mengerjakan

Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip dasar teknik
ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini,
molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di
dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul bersangkutan.
Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai
teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metode-metode lain seperti
spektrometri massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau immuno-blotting yang merupakan
metode-metode karakterisasi lebih lanjut.

Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked) yang porositasnya dapat
diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA,
RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan
konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang memungkinkan pertautan silang (cross-linker),
menghasilkan jaringan poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam
nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari
ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan.
Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well) pada gel yang
ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya. Molekul-molekul sampel
tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya.
Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju elektroda positif, disebabkan oleh muatan
negatif alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan asam
nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau
formamida digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein
didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein tersebut
berbentuk lurus dan bermuatan negatif.
Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar molekul sampel yang
telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak, atau pewarna "biru Coomassie" (Coomassie blue)
dapat digunakan untuk keperluan ini. Jika molekul sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya
setelah "diwarnai" dengan etidium bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet. Jika molekul sampel
mengandung atom radioaktif, autoradiogram gel tersebut dibuat.
Pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel akan tampak setelah proses pewarnaan; satu
lajur merupakan arah pergerakan sampel dari "sumur" gel. Pita-pita yang berjarak sama dari sumur gel
pada akhir elektroforesis mengandung molekul-molekul yang bergerak di dalam gel selama elektroforesis

dengan kecepatan yang sama, yang biasanya berarti bahwa molekul-molekul tersebut berukuran sama.
"Marka" atau penanda (marker) yang merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda dapat
digunakan untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan meng-elektroforesis marka
tersebut pada lajur di gel yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur marka tersebut dapat
dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan ukurannya. Jarak pita dari sumur gel berbanding
terbalik terhadap logaritma ukuran molekul.
Elektroforesis gel agarosa adalah metode pemisahan molekul DNA dan RNA menurut muatan, ukuran,
dan bentuk. Teknik ini sederhana, cepat terbentuk, dan mampu memisahkan campuran potongan DNA
sesuai dengan ukurannya secara akurat, dibanding dengan densitas gradient sentrifugasi. Saat arus
listrik diaplikasikan pada gel, molekul bermuatan negatif akan berpindah menuju elektroda positif dan
molekul bermuatan positif akan menuju elektroda bermuatan negatif. Faktor-faktor yang menyebabkan
kegagalan elektroforesis gel agarosa antara lain karena sel belum lisis sempurna, DNA belum keluar dari
sel, serta DNA mengalami degradasi (tekanan mekanik).
Fungsi alat dan bahan yang digunakan dalam praktikum elektroforesis gel agarosa ini yaitu :

Buffer elektroforesis yang terdiri dari TAE memiliki daya ion dalam larutan sebagai penghantar
listrik.

Loading dye berfungsi sebagai pemberat agar tidak keluar dari sumuran.
Etidium bromida sebagai pewarna DNA yang akan menyisip di sela-sela basa nukleotida.
UV transiluminator untuk visualisasi pewarnaan DNA didalam gel agarosa.

Aquades sebagai pelarut

Baki gel agarosa sebagai cetakan gel agarosa

TAE : Trisbase sebagai buffer sesuai dengan pH

Asam Asetat Glasial sebagai elektrolit gram

EDTA (Etylen Diamine Tetra Asetic Acid) sebagai pe-non aktif DNA

Sisir elektroforesis untuk membuat sumuran pada gel agarosa

Tangki elektroforesis untuk running DNA

Mikropipet untuk mengambil dan menghomogenkan sampel DNA dan loading dye

Kertas Parafilm untuk tempat menghomogenkan sampel DNA dan loading dye

Sarung tangan untuk melindungi terkena DNA-se yang dapat merusak DNA

Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen DNA dari produk PCR,
memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda ukuran, kemudian di-sequencing, dan juga
untuk pemurnian atau purifikasi DNA. Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan
berikut:
1. Membandingkan gen homolog dari sspesies yang berbeda, mengetahui susunan sekuens berbagai
genom.
2. DNA fingerprinting.
3. Mendeteksi kelainan genetik.
4. Mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu.
5. Mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme atau percobaan
perlakuan gen.
6. Mempelajari evolusi tingkat molecular.
7. Mengetahui variasi genetik yang ada di alam.
8. Menentukan atau mengidentifikasi berat molekul DNA, RNA, dan protein tertentu.
9. Mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu.
10. Mengetahui jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan DNA plasmid.
11.Menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi lewat PCR.
Menurut Susanto (2012), laju migrasi DNA ditentukan oleh konformasi molekulnya, dari yang
paling cepat yaitu Covalently Closed Circular (CCC), Open Circular, dan linier. Laju migrasi DNA dalam
medan listrik berbanding terbalik dengan massa DNA. Migrasi DNA terutama ditentukan oleh ukuran
panjang dan bentuk DNA. Fragmen DNA yang berukuran kecil akan bermigrasi lebih cepat dibanding
yang berukuran besar, sehingga elektroforesis mampu memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukuran
panjangnya.
Agarosa memiliki beberapa kelebihan seperti mudah didapat, harganya relatif murah, tidak
bersifat toksik, serta memiliki pori yang kecil. Agarosa merupakan polisakarida yang diekstrak dari
rumput laut. Hasil dari elektroforesis gel agarosa akan menunjukkan warna biru dari loading dye pada

posisi paling depan kemudian plasmid DNA berwarna orange terang. Berdasarkan pustaka, teknik
elektroforesis pada dasarnya didasarkan pada fakta bahwa DNA cenderung bermuatan negatif pada pH
netral dengan buffer phospat sebagai penyangga pH agar. Saat dilakukan elektroforesis dengan
memberikan daya listrik di kedua kutub maka DNA akan bergerak ke kutub positif, inilah prinsip kerja
elektroforesis gel agarosa. Agarosa merupakan gel yang memiliki resolusi lebih rendah dalam pemisahan
tetapi dapat memisahkan sampel yang berukuran sampai puluhan kilo basa. Agarosa terbuat dari
polisakarida, dilarutkan dengan buffer dan dipanaskan, setelah dingin akan membentuk gelatin yang
padat.

Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada pH dan komposisi medium
dimana molekul biologi tersebut terlarut. Bila berada dalam suatu medan listrik, molekul biologi
yang bermuatan positif akan bermigrasi keelektroda negative dan sebaliknya. Prinsip inilah yang
dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekul-molekul berdasarkan muatanya. Oleh
karena partikel sol bermuatan listrik, maka partikel ini akan bergerak dalam medan listrik.
Pergerakan ini disebut elektroforesis. Jika sistem koloid bermuatan negative, maka pertikel itu akan
menuju elktrode positif.
Elektroforesis gel agarosa dijadikan sebagai metode standar untuk memisahkan, mengidentifikasi dan memurnikan
fragmen DNA atau RNA. Gel agarosa memiliki resolusi yang lebih rendah daripada gel poliakrilamid, akan tetapi gel
ini dapat memisahkan DNA yang berukuran sampai puluhan kilo pasang basa. Elektroforesis gel agarosa dapat
memisahkan fragmen DNA dan RNA yang berukuran lebih besar dari 100 bp (base pair) hingga 50 kb dan
memisahkan protein dengan ukuran > 200 kDa dengan gerak medan yang digunakan adalah secara horizontal.
Konsentrasi agarosa mempengaruhi hasil elektroforesis karena semakin tinggi konsentrasi maka ruang antar molekul
pada gel agarosa lebih kecil sehingga mempersulit pergerakan molekul yang melewatinya. Dengan demikian untuk
mempermudah pergerakan molekul tersebut maka persentase konsentrasi yang digunakan pun lebih rendah. Hal ini
cukup menguntungkan karena biaya yang dikeluarkan untuk membuat gel juga akan menjadi lebih murah.
Kelebihan elektroforesis gel agarosa diantaranya teknik yang digunakan sederhana, preparasi gel lebih cepat
dilakukan karena pembuatan gel agarosa lebih mudah dan bersifat non toksik, laju pemisahan lebih cepat sehingga
fragmen DNA pun lebih cepat terbentuk, dan dapat memisahkan campuran potongan DNA sesuai dengan
ukurannya. Elektroforesis gel agarosa ini dapat dilakukan pada suhu kamar. Akan tetapi kekurangan dari gel
agarosa ini yaitu lebih mudah rusak oleh tangan sehingga membutuhkan kehati-hatian, dan bands yang dihasilkan
dapat berkabut dan menyebar agak jauh.
Hal yang perlu diperhatikan dalam elektroforesis gel agarosa adalah penggunaan arus listrik. Voltase yang
digunakan haruslah rendah sebab jika terlalu besar dapat mengakibatkan panas yang akan merubah bentuk pita
DNA. Agarosa memiliki sifat tidak dapat larut dalam air/bufer pada suhu kamar sehingga diperlukan pemanasan
dengan microwave.
Berbeda dari gel agarosa, elektroforesis menggunakan gel poliakrilamid dilakukan pada medan gerak vertikal dan
pembuatannya lebih sulit dibanding gel agarosa, karena biasanya digunakan poliakrilamid dengan resolusi yang
tinggi dan membutuhkan biaya yang lebih mahal serta preparsi yang lebih lama. Gel poliakrilamid bersifat toksik

sehingga harus lebih berhati-hati dalam penanganannya. Namun demikian, gel poliakrilamid dapat menampung
jumlah DNA yang lebih besar daripada gel agarosa.
Gel poliakrilamid sering digunakan untuk uji kualitatif protein, meskipun juga digunakan untuk uji kualitatif DNA.
Resolusi dalam memisahkan DNA lebih tinggi jika dibandingkan gel agarosa sehingga panjang molekul DNA yang
berbeda hanya satu nukleotida dapat dideteksi. Elektroforesis gel poliakrilamid dapat memisahkan protein dengan
ukuran 5200 kDa, sedangkan untuk pemisahan fragmen DNA hanya dalam rentang ukuran DNA yang sempit yaitu
antara 5500 bp.
Adapun gel poliakrilamid lebih murni serta dapat digunakan untuk aplikasi lainnya. Namun demikian, laju pemisahan
fragmen lebih lambat dibandingkan menggunakan gel agarosa dan membutuhkan persentase konsentrasi yang lebih
banyak dal voltase yang digunakan lebih tinggi.

Ada tiga jenis gel yang dapat digunakan dalam elektroforesis DNA, yaitu:
1. Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi untuk memurnikan penanda oligonukleotida dan
menganalisis hasil ekstensi primer.
2. Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang berukuran besar.
3. Gel agarosa formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem elektroforesis
yang digunakan untuk fraksi RNA pada ukuran standar.
(Davis dkk. 1994: 151).
Dalam proses elektoforesis terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi laju
pergerakan dari molekul DNA, yaitu:
1. Ukuran Molekul DNA
Molekul yang berukuran lebih kecil akan cepat bergerak melewati gel karena hambatan
yang akan dihadapi tidak lebih banyak dibandingkan molekul berukuran besar.
2. Konsentrasi gel
Semakin tinggi konsentrasi agarosa, semakin kaku gel yang dibuat sehingga sukar untuk
dilewati molekul-molekul DNA. Konsentrasi agarosa yang lebih tinggi memudahkan
pemisahan DNA yang berukuran kecil, konsentasi agarosa yang lebih rendah memudahkan
pemisahan DNA dengan ukuran yang lebih besar.
3. Bentuk molekul
Molekul yang memiliki bentuk elips atau fibril akan lebih cepat bergerak dibandingkan
dengan yang berbentuk bulat.

4. Densitas muatan yaitu muatan per unit volume molekul. Molekul dengan densitas muatan
tinggi akan bergerak lebih cepat dibandingkan molekul dengan densitas muatan yang
rendah.
5. Pori-pori gel
Semakin kecil pori-pori gel yang digunakan, semakin lambat pergerakan molekul DNA.
6. Voltase
Semakin tinggi tegangan listrik yang diberikan, semakin cepat pergerakan molekul DNA.
7. Larutan buffer elektroforesis
Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga mempercepat
migrasi DNA.
(Wolfe 1993: 127; Bowen 2000: 3-4).
Marker adalah segmen DNA yang spesifik dan telah diketahui
ukurannya. Marker berfungsi sebagai acuan untuk mengetahui ukuran DNA hasil
ampifikasi. Marker DNA yang terdapat di dalam ruang elektroforesis berfungsi sebagai
penanda posisi pasangan basa dari molekul DNA yang bermigrasi. Marker-marker DNA
tersebut merupakan marker yang telah dibuat oleh pabrik sehingga tanda pasangan basanya
jelas. Salah satu contoh marker DNA adalah lambda HindIII. Marker tersebut memiliki
delapan fragmen DNA dengan kisaran 125 pb hingga 23.130 pb. Penggunaan
DNA markertersebut dikarenakan molekul DNA yang akan diamati memiliki fragmen DNA
dengan ukuran 110--20.000 pb. (Birren & Lai 1993: 82; Martin 1996: 77).
Elektroforesis gel memiliki beberapa komponen yang terdiri dari:
1. Comb: digunakan untuk membentuk well pada gel agarosa.
2. Tray: digunakan untuk sebagai cetakan gel agarosa.
3. Chamber: digunakan sebagai wadah gel agarosa.
4. Sumber listrik: digunakan untuk memberi arus saat proses elektroforesis.
Dalam elektroforesis juga digunakan bahan-bahan sepert Etidium Bromida yang
bersifat karsinogenik dan Brom Fenol Blue. Hal tersebut karena Etidium Bromida dapat
meningkatkan daya fluoresensi dari DNA sehingga dapat terlihat jelas, sedangkan Brom

Fenol Blue berfungsi sebagai pewarna untuk memantau kecepatan molekul DNA pada gel
(Birren & Lai 1993: 79--81).
Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen DNA dari
produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda ukuran, lalu dapat
disequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi DNA. Elektroforesis dapat
diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan, antara lain membandingkan gen homolog
dari spesies yang berbeda, mengetahui susunan sekuens berbagai genom, DNA finger
printing, mengetahui ada atau tidaknya gen-gen penyebab kelainan genetik atau penyakit
tertentu, mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu, mengetahui
aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme atau aktivitas gen sebelum
dan sesudah diberi perlakuan tertentu, mempelajari evolusi di tingkat molekular,
mengetahui variasi genetik dalam populasi natural di alam, menentukan atau
mengidentifikasi berat molekul fragmen DNA, RNA, protein dan aktivitas enzimatik,
menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi melalui PCR, mengidentifikasi persamaan
dan perbedaan genetik antar individu, dan menentukan jumlah fragmen DNA yang diklon
dalam rekombinan plasmid DNA (Russell 1994: 299--310 & 500--501; Fairbanks &
Andersen 1999: 278).

1.

2.

3.

Menurut Moran (1994) perbedaan antara gel poliakrilamid, gel agarosa dan gel pati yaitu :
Gel Poliakrilamid :
Dapat memisahkan sampel DNA dengan ukuran 5-500 bp
Cara bacanya vertikal
Cara membuatnya kompleks
Gel agarosa
:
Memisahkan sampel DNA dengan ukuran ratusan-20000 bp
Cara bacanya horisontal
Cara membuatnya mudah
Gel pati
:
Memisahkan sampel DNA sampai 100 kd
Cara bacanya horisontal
Cara membuatnya kompleks
Dapat membaca sifat dari suatu protein