Ricky Rahadian Lazuardi

11/317055/PA/14172
ELEKTROFORESIS DNA

A. Pendahuluan

DNA adalah molekul utama yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses
metabolisme dalam organisme. DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa
nitrogen, dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida. DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup
yang sangat berperan penting sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan stuktur protein dan
proses metabolisme lain.
Elektroforesis dilakukan untuk memisahkan, mengidentifikasi, mengkarekterisasi dan purifikasi
dari molekul DNA/ RNA. Elektroforesis merupakan cara pengamatan DNA dengan bantuan sinar Ultra violet.
Cara pemisahan dengan elektroforesis ini merupakan alat pendukung yang sangat pokok dalam teknologi DNA
rekombinan, dengan aplikasi yang begitu luas baik untuk pemisahan untai tunggal atau untai ganda molekul
DNA. Elektroforesis digunakan untuk pengamatan DNA dalam penampakan flouresensinya.
B. Prinsip Kerja
Dalam proses elektroforesis, sampel molekul DNA ditempatkan ke dalam sumur (well) pada gel
yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, kemudian dialirkan listrik dengan kutub yang terpisah satu sisi
dengan sisi lainnya. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu
kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju elektroda
positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju
perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium
hidroksida atau formamida digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein
didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein tersebut berbentuk
linear dan bermuatan negatif pada sisi luarnya sehingga pada saat dielektroforesis akan menuju ke kutub positif
secara seragam. Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar molekul
sampel yang telah terpisah dapat dideteksi. Senyawa yang biasanya digunakan adalah Etidium bromida sebagai
zat pewarnanya,. Etium bromida akan berinteraksi dengan basa dari molekul DNA dan akan memberikan warna
orange fluoresance yang dapat dilihat di bawah sinar ultraviolet.
C. Pembahasan
Ketika dilihat di bawah sinar ultraviolet akan terlihat pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang
berbeda pada gel; satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari sumur gel. Pita-pita yang berjarak sama
dari sumur gel pada akhir elektroforesis mengandung molekul-molekul yang bergerak di dalam gel selama
elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang berarti bahwa molekul-molekul tersebut berukuran sama.
Penanda (marker) yang merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan untuk
menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan meng-elektroforesis penanda tersebut pada lajur di gel
yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur marker tersebut dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk
menentukan ukurannya. Jarak pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap logaritma ukuran molekul. Dalam
Hasil pengamatan terlihat bahwa terdapat fragmen DNA yang terlihat terurai dan tidak terurai. Semakin sedikit
DNA yang terurai, maka semakin baik hasil elektroforesis DNA nya.
beberapa faktor yang mempengaruhi Elektroforesis migration rate selama DNA bergerak
menembus gel agarose, sebagai berikut :
1. Ukuran molekul DNA
Molekul yang lebih besar akan bergerak lebih lambat, missal DNA linier lebih cepat dibanding DNA
sirkuler. Jarak migrasi molekul DNA pada gel adalah laju terbalik proporsional log-10 dari jumlah
pasangan basa.
2. Konsentrasi gel agarose
Fragmen DNA yang bervariasi ukuran molekulnya akan berberak sesuai dengan konsentrasi dari gel
agarose yang digunakan. Rumusnya adalah: log=log-KrT dimana adalah free electrophoresis
mobility, Kr adalah retardation coefficient, dan T adalah gel konsentrasi serta adalah electrophoretic
mobility DNA.

Tabel 1. konsentrasi gel agarose dan ukuran molekul DNA
No Konsentrasi Gel Agarose
(%)
Effisiensi range Pemisahan pada
DNA linier (kb)
1 0.3 60-5
2 0.6 20-1
3 0.7 10-0.8
4 0.9 7-0.5
5 1.2 6-0.4
6 1.5 4-0.2
7 2.0 3-0.1




3. Konformasi DNA
Laju migrasi juga tergantung pada bentuk/konformasi DNA, kita tahu bahwa ada 3 macam bentuk DNA
yaitu super-helix circular (I), circular-opened (II), dan linier (III). Meskipun ketiga bentuk itu mempunyai
berat yang sama tetapi laju migrasi pada gel elektroforesis berbeda. Perbedaan laju migrasi ini karena:
konsentrasi gel agarose
kekuatan arus listrik dan ionik buffer yang digunakan
densitas kembaran superheliks pada bentuk I
pada beberapa kondisi bentuk I lebih cepat dibanding bentuk III
tergantung juga kenaikan kuantitas EtBr: konsentrasi EtBr meningkat, pengikatan DNA meningkat
pula sehingga mobilitas meningkat tajam, contoh untuk bentuk I
konsentrasi EtBr kritis antara 0.1g/ml-0.5l/mg
4. Penggunaan Voltage dan arah dari bidang elektris
Voltage rendah menyebabkan laju migrasi DNA linier proporsional. Idealnya untuk DNA 2kb pada gel
agarose bergerak 5v/cm. Arah dari bidang elektris konstans untuk DNA 50-100kb bergerak dengan
laju yang sama, akan berubah secara periodik sesuai kecepatan pergerakan DNA akan berubah juga.
5. Komposisi basa DNA atau temperature
Baik komposisi basa maupun temperature tidak begitu berpengaruh, mobilitas DNA stabil pada temp. 4-
30C. Dan elektroforesis gel agarose dilakukan pada suhu kamar
6. Keberadaan pewarna DNA
Iintercalating agent ethidium bromide (EtBr) adalah pewarna fluoresen untuk deteksi asam nukleat,
EtBr ini akan mengikat pada sela-sela pasangan basa DNA. EtBr dapat mengurangi mobilitas DNA
linier sampai 15%. Hanya sedikit DNA 1ng dapat dideteksi secara langsung dengan cara gel
diletakkan pada media UV-transilluminator. EtBr dapat digunakan untuk mendeteksi single- atau
double-stranded asam nukleat (DNA atau RNA). Meskipun, affinity dari EtBr-dye ini untuk single-
stranded asam nukleat relative rendah dan pendaran fluorensen minimum. PERHATIAN! EtBr ini
powerful mutagen, pengguna harus selalu memakai sarung tangan pada saat bekerja, dan lindungi
mata anda dengan kaca pelindung pada saat mengamati di atas UV-transilluminator.
7. Komposisi buffer elektroforesis
Buffer elektroforesis yang digunakan harus sesuai dengan pelarut yang digunakan untuk pembuatan
gel agarose. Missal:
Tris-acetate; umum dipakai untuk preparative, kemampuannya paling rendah, tetapi efektif untuk
isolasi DNA dari gel agarose baik elektroelusi maupun gel ekstraksi.
Tris-borat; resolusi cukup baik, tapi untuk mengisolasi kembali DNA dari agarose kurang
effektif, karena ada interaksi dengan agarose


D. Referensi
Fatchiyah. 2006. Gel Elektroforesis. Malang: Brawijaya Press
Yuwono T. 2005. Biologi Molekuler. Jakarta: Erlangga