Teknik Elektroforesis

Elektroforesis
Merupakan suatu teknik yang mengukur laju perpindahan atau
pergerakan partikel-partikel bermuatan dalam suatu medan
listrik.
Prinsip kerjanya berdasarkan pergerakan partikel-partikel
bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang
bergerak menuju kutub positif (anoda), sedangkan partikel-
partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju
kutub negatif (anoda). Bisa juga untuk protein.
Digunakan untuk mengamati hasil amplifikasi dari DNA.
Hasilnya terbentuknya band (pita) yang merupakan fragmen
DNA hasil amplifikasi dan menunjukkan potongan-potongan
jumlah pasangan basanya. Hasil elektroforesis protein
menunjukkan band yang merupakan pemisahan protein
Menurut STENESH dalam TITRAWANI (1996) teknik
elektroforesis dibedakan menjadi dua cara:
1. Elektroforesis larutan (moving boundary electrophoresis)
larutan penyangganya yang mengandung makro-molekul
ditempatkan dalam suatu kamar tertutup dan dialiri arus
listrik. Kecepatan migrasi dari makro-molekul diukur dengan
jalan melihat terjadinya pemisahan dari molekul (terlihat
seperti pita) di dalam pelarut.
2. Elektroforesis daerah (zone electrophoresis).
menggunakan suatu bahan padat yang berfungsi sebagai
media penunjang yang berisi (diberi) larutan penyangga.
Media penunjang gel agarose, gel pati, gel poliakrilamida
dan kertas sellulose poliasetat.
Menurut SARGENT & GEORGE (1975) elektroforesis daerah
disebut elektroforesis gel dengan dua buah model yaitu
horizontal dan vertikal.
Metode yang biasa digunakan adalah model horizontal, karena
mempunyai beberapa keuntungan yaitu peralatan yang
digunakan sangat sederhana, relatif murah dan pemisahan
untuk enzim tertentu dapat menghasilkan pemisahan yang lebih
baik.
Elektroforesis gel
Perpindahan partikel pada medium gel tersebut
dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti ukuran partikel,
komposisi dan konsentrasi gel, densitas muatan, kuat
medan listrik dan sebagainya. Semakin kecil partikel
tersebut, maka pergerakan atau migrasinya akan semakin
cepat, karena matriks gel mengandung jaringan kompleks
berupa pori-pori sehingga partikel-partikel tersebut dapat
bergerak melalui matriks tersebut.
Di dalam elektroforesis digunakan sumber arus listrik
searah (DC), ruang untuk elektroforesis (Comb, Well,
platform dan cetakan wadah gel), larutan buffer (buffer
ionik dan loading buffer), matriks elektroforesis, marker
dan gel (Brown 1992).
Elektroforesis digunakan dengan tujuan untuk mengetahui
ukuran dan bentuk suatu partikel baik DNA, RNA dan protein.
Selain itu, elektroforesis juga digunakan untuk fraksionasi
yang dapat digunakan untuk mengisolasi masing- masing
komponen dari campurannya, mempelajari fitogenetika,
kekerabatan dan mempelajari penyakit yang diturunkan.
Elektroforesis dalam bidang genetika, digunakan untuk
mengetahui ukuran dan jumlah basa yang dikandung suatu
sekuen DNA tertentu (Klug & Cummings 1994).
Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks
penyangga untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya
panas dari arus listrik yang digunakan.
Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga
yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat.
Gel poliakrilamid biasanya untuk protein, sedangkan gel agarosa
untuk DNA/RNA
Faktor-faktor yang mempengaruhi Elektroforesis:
Teknik pengerjaan dalam pengoperasian alat
Medium pemisah (berupa gel Agarosa, pati atau poliakrilamida).
Disebut fase stasioner atau fase diam.
Sampel
Ditinjau dari muatan, ukuran, dan bentuk molekul. Jumlah
muatan total akan berbanding lurus dengan laju perpindahan,
konsentrasi muatan yang bermigrasi tergantung pada pH. Untuk
ukuran molekul apabila yang diperoleh lebih besar
menyebabkan perpindahan molekul menurun dan membutuhkan
energi perpindahan yang cukup besar dibandingkan dengan
bentuk molekul yang berbeda dengan ukuran yang sama.
Larutan Buffer
Berfungsi untuk mempertahankan pH di dalam medium
pemisah, dan berfungsi sebagai media penyedia elektrolit pada
proses pergerakan aliran listrik.
Ada sejumlah buffer yang digunakan untuk elektroforesis.
Yang paling umum, untuk asam nukleat Tris -Asetat EDTA
(TAE), Tris - Borate EDTA (TBE)
Larutan buffer disebut fase gerak
Medan Listrik
Sumber suatu listik yang stabil sangat diperlukan untuk
menghasilkan aliran listrik dengan tegangan yang konstan.
Voltase untuk DNA/RNA biasa digunakan 100 V, kadang
menggunakan 50 V walaupun lebih lambat tapi hasil
pemisahannya lebih maksimal
Perlengkapan alat elektroforesis terdiri dari:
1. Cetakan gel yang digunakan untuk membuat gel agarosa
2. Alat pencetak sumur yang digunakan untuk membuat
sumur-sumur pada sisi atas dari gel agarosa, yaitu
tempat memasukkan DNA ke dalam gel.
3. Tangki elektroforesis
4. Sumber arus.
Alat dan Bahan
1. Tabung Eppendorf
2. Mikropipet dan tips
3. Alat pemanas
4. Perlengkapan alat elektroforesis
5. Sumber arus
6. Agarose
7. TAE 1X / TBE 1X
8. Loading dye
9. UV illuminator
Tahapan:
1) DNA diekstraksi.
2) Isolasi dan amplifikasi DNA.
3) DNA ditambahkan ke sumur gel.
4) Arus listrik diterapkan ke gel.
5) Pita DNA dipisahkan oleh ukuran.
6) Pita DNA terbentuk.
 Elektroforesis gel agarosa biasanya digunakan untuk pemisahan asam-
asam nukleat:
1. Hasil isolasi DNA
2. Hasil restriksi pengguntingan pita DNA
3. Hasil PCR (Polymerase Chain Reaction) baik DNA dan/atau RNA

DNA merupakan molekul bermuatan negatif, sehingga bila diletakkan di

medan listrik, DNA akan bergerak (bermigrasi) dari kutub negatif ke
kutub positif.
Pergerakan ini kecepatannya tergantung dari: (1) ukuran molekul DNA,
(2) kerapatan media (gel) yang dilalui oleh DNA , dan (3) arus listrik
yang diberikan untuk memigrasikan molekul DNA. Semakin kecil
ukurannya, DNA akan bermigrasi semakin cepat. Semakin rapat media
yang digunakan, yang dicerminkan dari konsentrasi media, semakin
lambat DNA bermigrasi. Semakin besar arus yang digunakan, semakin
cepat DNA bermigrasi..
Sebelum dilakukan elektroforesis, suspensi DNA harus
dicampur dengan penyangga muatan pewarna= loading
buffer/dye

Fungsi loading dye untuk:

1. menambah densitas, sehingga DNA berada di bagian
bawah dari sumur (well),
2. memudahkan meletakkan contoh DNA ke dalam sumur,
3. penanda laju migrasi DNA.

Pewarna yang biasa digunakan adalah: (1) bromofenol biru

(Blue bromophenol), dan xylene cyanol.
Kesalahan yang sering dilakukan pada waktu
elektroforesis
Elektroforesis untuk protein