ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

Oleh:
Nama : Arlina Setyoningtyas
NIM : B1A017150
Rombongan : VII
Kelompok : B
Asisten : Dyah Retno Anissa

LAPORAN PRAKTIKUM GENETIKA

KEMENTERIAN RISET, TEKNOLOGI, DAN PENDIDIKAN TINGGI

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS BIOLOGI
PURWOKERTO

2018
 HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil
HASIL ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA SAMPEL DNA

Gambar 1. Hasil Visualisasi Elektroforesis DNA

2
1

1. DNA marker
2. Segmen DNA hasil praktikum
B. Pembahasan

Elektroforesis adalah teknik yang digunakan untuk memisahkan dan

memurnikan suatu makromolekul khususnya protein dan asam nukleat berdasarkan
perbedaan ukuran. Elektroforesis merupakan metode yang paling banyak dipakai
saat ini dalam percobaan biokimia dan biologi molekuler (Magdeldin,
2012). Elektroforesis gel agarosa adalah teknik paling baik yang pernah dibuat dan
secara rutin digunakan di laboratorium klinis untuk analisis protein dan DNA pada
berbagai cairan biologis (serum, urin, CSF). Teknik ini merupakan teknik yang
menggunakan prinsip elektroforesis zona. Seperti yang diketahui, molekul protein
bermigrasi pada medium padat/gel yang direndam dengan suatu larutan penyangga di
bawah pengaruh medan listrik. Migrasi ini tergantung pada muatan listrik, titik
isoelektrik bersih dan massa molekul protein (Jean, 2010).
Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat makromolekul yang bermuatan
listrik ditempatkan pada medium berisi tenaga listrik. Molekul-molekul tersebut
akan bermigrasi menuju kutub positif atau kutub negatif berdasarkan muatan yang
terkandung di dalamnya (Magdeldin, 2012). Molekul-molekul yang bermuatan
negatif (anion) akan bergerak menuju kutub positif (anoda), sedangkan molekul-
molekul yang bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif
(katoda) (Klug, 1994).
Menurut Wolfe (1993), dalam proses elektoforesis terdapat beberapa faktor
yang mempengaruhi laju pergerakan dari molekul DNA, yaitu:
1. Ukuran Molekul DNA
Molekul yang berukuran lebih kecil akan cepat bergerak melewati gel karena
hambatan yang akan dihadapi tidak lebih banyak dibandingkan molekul berukuran
besar.
2. Konsentrasi gel
Semakin tinggi konsentrasi agarosa, semakin kaku gel yang dibuat sehingga
sukar untuk dilewati molekul-molekul DNA. Konsentrasi agarosa yang lebih tinggi
memudahkan pemisahan DNA yang berukuran kecil, konsentasi agarosa yang lebih
rendah memudahkan pemisahan DNA dengan ukuran yang lebih besar.
3.Bentuk molekul
Molekul yang memiliki bentuk elips atau fibril akan lebih cepat bergerak
dibandingkan dengan yang berbentuk bulat.
4. Densitas muatan
Densitas muatan yaitu muatan per unit volume molekul. Molekul dengan
densitas muatan tinggi akan bergerak lebih cepat dibandingkan molekul dengan
densitas muatan yang rendah.
5. Pori-pori gel
Semakin kecil pori-pori gel yang digunakan, semakin lambat pergerakan
molekul DNA.
6. Voltase
Semakin tinggi tegangan listrik yang diberikan, semakin cepat pergerakan
molekul DNA.
7. Larutan buffer elektroforesis
Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga
mempercepat migrasi DNA.
Praktikum elektroforesis gel ini dimulai dengan pembuatan gel agarose
0,8%. Praktikan tidak melakukan pembuatan gel agarose 0,8% karena dilakukan
oleh asisten praktikum. Secara umum, proses pembuatan gel agarose 0,8%
dilakukan dengan cara mencampurkan bubuk agarosa dengan larutan buffer TAE,
yang kemudian dipanaskan di dalam microwave, selanjutnya dituangkan ke dalam
cetakan yang telah disiapkan dengan comb-nya dan tunggu sampai mengeras. Bubuk
agarose yang digunakan sebanyak 0,4 gr dan larutan running buffer TAE (Trisasetat-
EDTA) sebanyak 50 mL yang berperan untuk memudahkan migrasi dari fragmen
DNA berdasarkan perbedaan kekuatan ionik (Magdeldin, 2012). Setelah gel
mengeras, gel dimasukkan ke dalam ruang elektroforesis dan dilakukan penambahan
running buffer. Penambahan running buffer dilakukan dengan tujuan mempermudah
pengerasan gel saat dilakukan pemanasan (Gardner, 1991).
Tahap selanjutnya adalah mencampurkan DNA dengan loading buffer yang
memiliki fungsi membantu sampel turun ke dalam well dan membantu memonitor
berapa lama proses elektroforesis telah berlangsung karena memiliki pewarna
bromofenol biru (Magdeldin, 2012).
Selanjutnya dilakukan penuangan campuran loading buffer dengan produk
DNA sebanyak 4µl dan juga larutan marker 1kb sebanyak 3µl pada sumur/well yang
telah dibentuk pada gel. Sedangkan untuk marker 1kb dituang pada dua sisi ujung
(atas dan bawah) well yang ada. Proses pemindahan dilakukan dengan memakai
mikropipet dan harus dilakukan secara hati-hati agar campuran DNA dengan loading
buffer tidak “meluber” ke bagian well yang lain. DNA memiliki muatan negatif
(DNA mengandung gugus PO4) sehingga diharapkan akan bergerak menuju kutub
positif (Martin, 1996).
Praktikum dilanjutkan dengan memasang penutup ruang elektroforesis dan
diberikan arus listrik untuk tahap running. Running elektroforesis dilakukan pada
tegangan 90 Volt dan dengan arus sebesar 400 mA selama 30 menit. Kecepatan
migrasi DNA sangat dipengaruhi oleh tegangan listrik dan arus listrik yang di
berikan oleh power supply ke tangki elektroforesis. Fragmen DNA yang besar akan
bergerak lebih cepat dibandingkan dengan fragmen DNA yang kecil (Magdeldin,
2012). Gel agarose nantinya akan dikeluarkan dari ruang elektroforesis setelah
mengalami perubahan warna. Dokumentasi dilakukan dengan gel doc (Davis, 1994).
Untuk elektroforesis, ada beberapa bahan yang diperlukan, salah satunya
adalah gel agarosa yang merupakan suatu kolodial laut yang dimurnikan dari alga.
Gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang lebih besar (lebih dari
200 bp) dan gel poliakrilamida digunakan untuk fragmen kecil (kurang dari 200 bp).
Ketika dididihkan dalam suatu larutan bufer, agarosa akan larut dan ketika
didinginkan akan memadat membentuk gel. Pendinginan dilakukan sekitar suhu 50-
60oC apabila terlalu panas akan merusak karet-karet penyimpan agar. Selain itu,
viskositasnya rendah sehingga akan menimbulkan gelembung-gelembung sehingga
apabila dituangkan dikhawatirkan ada udara yang terjebak (Birren, 1999).
TAE (tris asetat, EDTA pH 8) berfungsi sebagai media penghantar arus.
Pada media tersebut, fragmen mDNA akan bergerak dengan perbedaan kecepatan
akibat adanya perbedaan kekuatan ionic (Birren et. al., 1999). Fragmen DNA akan
terpisah berdasarkan kekuatan ukuran pasangan basa. Untuk melihat pita DNA maka
harus menandai gel dengan ethidium bromide yang merupakan warna fluoresence
(merah-oranye) yang menginterhelat DNA dan kemudian dapat dilihat dengan sinar
UV (Poedjiadi.1994).
Loading buffer (loading dye) terdiri atas sukrosa 50%, EDTA Ph 8 dan brom
fenol biru yang digunakan sebagai pewarna guna mempermudah pengamatan
berpindahnya noda dalam gel dan menentukan sejauh mana proses elektroforesis
telah berlangsung dengan adanya warna biru yang bergerak dalam agar. Selain itu,
penambahan sukrosa ini adalah sebagai pemberat bagi sampel sehingga tenggelam ke
dalam sumur gel. Loading dye adalah senyawa yang digunakan sebagai pewarna dari
DNA target yang ingin dipisahkan dengan metode elektroforesis. Proses
elektroforesis juga dapat ditentukan sejauh mana proses tersebut telah berjalan,
dilihat dari pergerakan senyawa berwarna yang berwarna biru yang bergerak
melewati gel. Loading dye juga berfungsi sebagai pemberat bagi sampel DNA yang
ingin dipisahkan. Loading dye akan membuat sampel DNA menjadi lebih berat
sehingga dapat tenggelam ke dalam sumur gel (Poedjiadi, 1994).
Etidium bromida dapat berfungsi sebagai pewarna (fluorescence) karena
menyisip di antara basa asam nukleat. Hal ini dapat terjadi karena ethidium bromida
sedikit mirip pasangan basa dan dapat masuk ke dalam rantai ganda DNA di antara
pasangan basanya. Peristiwa tersebut sangat mutagen. Ethidium bromida merupakan
fluoresence yang lemah. Fluoresensi terjadi karena ekeltron tereksitasi ke tingkat
energi yang lebih tunggi (dengan UV 265 nm). Ketika elektron kembali pada tingkat
energi yang lebih rendah, muncul perbedaan energi (sinar tampak) (Poedjiadi.1994).
Praktikum elektroforesis gel juga menggunakan alat-alat yang mempunyai
fungsi dan peranan masing-masing. Alat-alat tersebut yaitu mikropipet, aparatus
elektroforesis, power supply, sumber sinar UV, dan sarung tangan. Mikropipet
berfungsi untuk memindahkan sampel dan larutan lainnya dari tube ke
dalam wells pada aparatus elektroforesis. Aparatus elektroforesis terdiri
atas comb (sisir) yang membentuk well (sumur) pada gel agarosa, tray yang
merupakan wadah cetakan gel, dan chamber yang merupakan medium tempat
berlangsungnya proses elektroforesis. Power Supply (DC) sebagai sumber energi
untuk aparatus elektroforesis. UV transluminator berfungsi untuk membantu
mengamati hasil band yang tampak sehingga terlihat lebih jelas (Amersham,
1999).
Interpretasi dari praktikum elektroforesis yaitu akan didapatkan pita-pita
protein yang terpisahkan berdasarkan berat dan ukuran molekulnya. DNA marka
sebagai acuan akan menunjukkan seberapa jauh DNA sampel bermigrasi dari wells,
semakin jauh jarak DNA sampel bermigrasi menunjukkan semakin kecil molekul
yang mampu menembus gel agarose, dan sebaliknya jika molekul terlalu besar maka
kemampuan bermigrasi pun akan semakin sulit. Visualisasi akan terlihat hasil
migrasi apa terlihat jelas DNA sampelnya atau tidak, jika terlihat jelas maka itu
berarti clear atau tidak terdapat RNA yang tercampur didalamnya, sedangkan jika
tak terlihat jelas maka itu disebut smear atau terdapat RNA yang tercampur di
dalamnya. Hasil praktikum kelompok empat menunjukkan bahwa DNA yang terlihat
di visualisasi merupakan clear karena terlihat jelas.
 KESIMPULAN

1. Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA

berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya.
2. Prinsip kerja elektroforesis yaitu molekul yang bermuatan negatif (anion)
akan bergerak menuju kutub positif (anoda) dan sebaliknya molekul yang
bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (katoda).

DAFTAR REFERENSI

Amersham. 1999. Protein Electrophoresis. USA: Amersham Biosciences.

Birren, B., & Lai. 1993. Pulsed Field ge Electrophoresis: A Practical Guide. San
Diego: Academic Press, Inc.

Davis, L. M., Kuehl & Battey, J. 1994. Basic methods: Molecular Biology 2nd Ed.
Norwola: Appleton & Lange.
Gardner, E.J., Simmons & Snustad, D. P. 1991. Principles of Genetics 8th Ed. New
York: John Wiley & Sons Inc.

Jean, F. G. 2010. Agarose Gel Electrophoresis – Aplications in Clinical

Chemistry. Journal of Medical Biochemistry, 29(1), pp. 20-27.

Klug, W. S. 1994. Concept of Genetics 4th Ed. Ohio: Merrill Publishing Co.

Magdeldin, S. 2012. Gel Electrophoresis - Principles and Basics. Rijeka: InTech

Publisher.

Martin, R. 1996. Gel electrophoresis: Nucleid acids. Inggris: Bros Scientific

Publishers Ltd.

Poedjiadi, A. 1994. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta: UI Press.

Wolfe, S. L. 1995. Introduction to Cell and Molecular Biology. Belmont: Wardworth

Publishing Company.