ELEKTROFORESIS GEL AGAROSE

Elektroforesis adalah teknik yang digunakan untuk memisahkan dan memurnikan

suatu makromolekul khususnya protein dan asam nukleat berdasarkan perbedaan ukuran.
Elektroforesis merupakan metode yang paling banyak dipakai saat ini. Prinsip kerja
elektroforesis gel dimulai saat makromolekul yang bermuatan listrik ditempatkan pada
medium berisi tenaga listrik. Molekul-molekul tersebut akan bermigrasi menuju kutub positif
atau kutub negatif berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya. Molekul-molekul yang
bermuatan negatif (anion) akan bergerak menuju kutub positif (anoda), sedangkan molekul-
molekul yang bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (katoda).
Elektroforesis digunakan untuk menyediakan informasi mengenai ukuran, konfirmasi
dan muatan dari protein dan asam nukleat. Elektroforesis dalam skala besar memungkinkan
untuk digunakan sebagai metode pemisahan yang dapat digunakan untuk menentukan
komponen dari protein atau asam nukleat setiap individu. Elektroforesis gel memisahkan
makromolekul berdasaran laju perpindahannya melewati suatu gel di bawah pengaruh medan
listrik. Elektroforesis gel memisahkan suatu campuran molekul DNA menjadi pita-pita yang
masing-masing terdiri atas molekul DNA dengan panjang yang sama.
Biasanya, gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang lebih besar
(lebih dari 200 bp) dan gel poliakrilamida digunakan untuk fragmen kecil (kurang dari 200
bp). Jarak antara dua fragmen DNA yang berbeda ukuran dapat ditentukan berdasarkan
konsentrasi matriks agarose. Mobilitas/pergerakan DNA relatif tergantung pada faktor-faktor
tertentu, terutama pada konsentrasi agarosa dalam gel, kekuatan arus yang digunakan,
kekuatan ionik dari larutan buffer, dan konformasi fragmen DNA itu sendiri. Molekul DNA
bermigrasi melalui pori-pori kecil yang terbentuk dalam padatan gel agarosa. Secara umum,
molekul yang lebih kecil bergerak lebih cepat dan bermigrasi lebih jauh dari molekul kecil
karena memiliki gesekan yang lebih rendah saat bergerak menuju elektroda positif.
Konsentrasi yang rendah pada gel agarosa memberikan resolusi yang lebih baik untuk
fragmen besar, dengan memberikan pemisahan yang lebih besar antara band yang secara
ukuran tidak terlalu jauh berbeda. Konsentrasi gel yang lebih tinggi, di sisi lain, dapat
mengurangi kecepatan migrasi fragmen panjang yang sementara itu dapat memfasilitasi
pemisahan yang lebih baik pada fragmen DNA kecil.
Elektroforesis gel memiliki beberapa komponen yang terdiri dari :
1. Comb: digunakan untuk membentuk well pada gel agarose.
2. Tray : digunakan untuk sebagai cetakan gel agarose.
3. Chamber: digunakan sebagai wadah gel agarose.
4. Sumber listrik: digunakan untuk memberi arus saat proses elektroforesis
Dalam elektroforesis juga digunakan bahan-bahan sepert Etidium Bromida yang
bersifat karsinogenik dan Brom Fenol Blue. Hal tersebut karena Etidium Bromida dapat
meningkatkan daya fluoresensi dari DNA sehingga dapat terlihat jelas, sedangkan Brom
Fenol Blue berfungsi sebagai pewarna untuk memantau kecepatan molekul DNA pada gel.
 Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen DNA dari
produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda ukuran, lalu dapat
disequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi DNA. Elektroforesis dapat
diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan, antara lain membandingkan gen homolog dari
spesies yang berbeda, mengetahui susunan sekuens berbagai genom, DNA finger printing,
mengetahui ada atau tidaknya gen-gen penyebab kelainan genetik atau penyakit tertentu,
mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu, mengetahui aktivitas
gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme atau aktivitas gen sebelum dan
sesudah diberi perlakuan tertentu, mempelajari evolusi di tingkat molekular, mengetahui
variasi genetik dalam populasi natural di alam, menentukan atau mengidentifikasi berat
molekul fragmen DNA, RNA, protein dan aktivitas enzimatik, menganalisa fragmen DNA
yang diamplifikasi melalui PCR, mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar
individu, dan menentukan jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan plasmid
DNA.
PEMBAHASAN
Secara singkat, elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul selular
berdasarkan ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu
medium yang mengandung sampel yang dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan
memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan
negatif. Prinsip kerjanya adalah jika molekul yang bermuatan negatif (DNA) dilewatkan
melalui suatu medium, misalnya gel agarose, kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub ke
kutub yang berlawanan muatannya (positif), maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub
negatif ke kutub positif (Elektroforesis) melalui membran matriks gel agarose tersebut.
Marker adalah segmen DNA yang spesifik dan telah diketahui ukurannya. Marker
berfungsi sebagai acuan untuk mengetahui ukuran DNA hasil ampifikasi. Marker DNA yang
terdapat di dalam ruang elektroforesis berfungsi sebagai penanda posisi pasangan basa dari
molekul DNA yang bermigrasi. Marker-marker DNA tersebut merupakan marker yang telah
dibuat oleh pabrik sehingga tanda pasangan basanya jelas. Salah satu contoh marker DNA
adalah lambda HindIII. Marker tersebut memiliki delapan fragmen DNA dengan kisaran 125
pb hingga 23.130 pb.
Praktikum dilanjutkan dengan memasang penutup ruang elektroforesis dan diberikan
arus listrik untuk tahap running. Running elektroforesis dilakukan pada tegangan 90 Volt dan
dengan arus sebesar 400 mA selama 30 menit. Kecepatan migrasi DNA sangat dipengaruhi
oleh tegangan listrik dan arus listrik yang di berikan oleh power supply ke tangki
elektroforesis. Fragmen DNA yang besar akan bergerak lebih cepat dibandingkan dengan
fragmen DNA yang kecil. Gel agarose nantinya akan dikeluarkan dari ruang elektroforesis
setelah mengalami perubahan warna. Dokumentasi dilakukan dengan gel doc.
Pada tahap dokumentasi hal yang pertama dilakukan adalah merendam gel agarose
hasil elektroforesis pada larutan EtBr kurang lebih selama 15 menit. Larutan ini berfungsi
untuk meningkatkan daya fluoresensi DNA saat disinari sinar UV dalam Gel Doc. Setelah itu
dilakukan pembilasan dengan menggunakan Aquades selama kurang lebih 15 menit juga.
Setelah tahap-tahap tersebut barulah divisualisasi dengan menggunakan Gel Doc. Gel doc
adalah alat yang digunakan untuk mengamati dan mendokumentasikan hasil elektroforesis.
Komponen gel doc terdiri dari lampu UV, kamera dan komputer. Lampu UV berfungsi
menerangi bagian dalam dalam dari gel doc, kamera berfungsi memotret hasil elektroforesis
dan komputer berfungsi menjalankan proses dokumentasi lewat bantuan software.
Dalam proses elektoforesis terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi laju
pergerakan dari molekul DNA, yaitu:
1. Ukuran Molekul DNA
Molekul yang berukuran lebih kecil akan cepat bergerak melewati gel karena
hambatan yang akan dihadapi tidak lebih banyak dibandingkan molekul berukuran besar.
2. Konsentrasi gel
Semakin tinggi konsentrasi agarosa, semakin kaku gel yang dibuat sehingga sukar
untuk dilewati molekul-molekul DNA. Konsentrasi agarosa yang lebih tinggi memudahkan
pemisahan DNA yang berukuran kecil, konsentasi agarosa yang lebih rendah memudahkan
pemisahan DNA dengan ukuran yang lebih besar.
3. Bentuk molekul
Molekul yang memiliki bentuk elips atau fibril akan lebih cepat bergerak
dibandingkan dengan yang berbentuk bulat.
4. Densitas muatan
Densitas muatan yaitu muatan per unit volume molekul. Molekul dengan densitas
muatan tinggi akan bergerak lebih cepat dibandingkan molekul dengan densitas muatan yang
rendah.
5. Pori-pori gel
Semakin kecil pori-pori gel yang digunakan, semakin lambat pergerakan molekul
DNA.
6. Voltase
Semakin tinggi tegangan listrik yang diberikan, semakin cepat pergerakan molekul
DNA.
7. Larutan buffer elektroforesis
Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga
mempercepat migrasi DNA.