Anda di halaman 1dari 15

ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

Oleh: Nama NIM Kelompok Rombongan Asisten : Kasriati Heruningsih : B1J011155 :3 : IV : Roman Bramandita

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS BIOLOGI PURWOKERTO 2013

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Metode elektroforesis mulai berkembang akhir abad ke-19 setelah ditemukan penelitian yang menunjukkan adanya penelitian yang menunjukkan adanya efek dari listrik terhadap partikel-partikel atau molekul-molekul yang bermuatan listrik, dalam hal ini termasuk juga protein. Elektroforesis berasal dari bahasa Yunani yang mempunyai arti transport atau perpindahan melalui partikel-partikel listrik. Metode elekroforesis telah digunakan dan dikembangkan di dalam teknik analisa untuk penelitian di bidang biologi dan genetika. Di dalam ilmu biologi maupun biologi molekuler, metode elektrorofesis banyak digunakan untuk taksonomi,

sistematik dan genetik dari hewan ataupun tumbuhan (Hiller dan Davidson, 1994). Prinsip kerja dari elektroforesis gel agarosa adalah memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Analisis hasil amplifikasi dilakukan dengan elektroforesis gel agarosa yang berperan sebagai sirkuit elektrik untuk memisahkan fragmen-fragmen DNA berdasarkan jumlah nukleotida penyusunnya. Semakin kecil ukuran pasang basa nukleotidanya, akan semakin mudah bermigrasi dan berada di bagian gel yang dekat dengan anoda. Pitapita DNA yang terbentuk diamati dengan alat UV transiluminator dan penentuan ukuran fragmen dilakukan dengan cara membandingkan mobilitas fragmen DNA dengan DNA standar yang telah diketahui ukurannya (Radji et al., 2010). Metoda elektroforesis gel agarosa didasarkan pada pergerakan mulekul bermuatan dalam media penyangga matriks stabil di bawah pengaruh medan listrik. Media yang umum digunakan adalah gel agarosa atau poliakrilamid. Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang berukuran lebih besar dari 100 pb dan dijalankan secara horizontal, sedangkan elektroforesis poliakrilamid dapat memisahkan 1 pb dan dijalankan secara vertikal. Elektroforesis poliakrilamid biasanya digunakan untuk menentukan urutan DNA (sekuensing) (Suryanto, 2003).

B. Tujuan Tujuan praktikum kali ini adalah untuk melakukan cara kerja elektroforesis gel agarosa.

II. MATERI DAN METODE

A. Materi Bahan yang digunakan adalah DNA marker (misalnya DNA yang dipotong dengan Hind III), sampel DNA (missal DNA kromosom bakteri dan DNA kromosom buah), agarosa, larutan buffer TAE 50x (242 g tris-base; 57,1 g asam asetat glacial; 100 ml EDTA 0,5 M pH 8; dilarutkan dalam akuades hingga 1000 ml), akuades, Loading dye 6x (0,25% bromophenol blue; 0,25% xylene cyalol; 15% ficoll tipe 4000; EDTA 120 mM) dan larutan Etidium Bromid (EtBr). Alat yang digunakan adalah gelas ukur 1000 ml, hot plate dan stirer, labu erlenmeyer 50 ml, tabung eppendorf, sarung tangan, seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific), kertas parafilm, seperangkat alat elektroforesis, UV transluminator, kaca mata UV dan kamera digital.

B. Metode 1. Sebanyak 0,6 gram agarosa ditambahkan kedalam 500 ml larutan buffer TAE 1x. Larutan buffer TAE 1x dibuat dari 10 ml larutan buffer TAE 50x ditambahkan dengan akuades sebanyak 490 ml. 2. Larutan tersebut dipanaskan dan dihomogenkan sampai homogen diatas hot plate. Larutan didinginkan sampai suam-suam kuku kemudian ditambahkan 1 l larutan EtBr dan dihomogenkan. 3. Baki gel agarosa disiapkan, lekatkan selotip di tiap ujung baki gel agarosa (pastikan bahwa selotip melekat kuat dan tidak ada lubang pada masing-masing ujung baki). 4. Sisir elektroforesis dipasang di salah satu ujung baki gel agarosa dengan posisi hampir menyentuh dasar baki. 5. Larutan agarosa dituang ke dalam baki gel agarosa, biarkan hingga larutan berubah menjadi gel yang padat. Sisir diambil dengan hati-hati, lepaskan selotip dari ujung-ujung baki. 6. Masukkan baki yang telah berisi gel agarosa ke dalam tangki elektroforesis yang telah diisi dengan larutan bufer TAE 1x (pastikan bahwa gel terendam seluruhnya dalam TAE).

7. Siapkan sekitar 5 cm kertas parafilm di dekat tangki elektroforesis. 8. Masukkan 10 l sampel DNA dan 2 l loading dye 6x (hasil PCR) ke dalam sumuran gel agarosa dengan cara mencampurkan kedua bahan tersebut terlebih dahulu secara merata pada kertas parafilm menggunakan mikropipet, antara sampel dan loading dye 5:1. Kemudian masukan DNA marka (DNA 1 l) menggunakan mikropipet. 9. Buatlah catatan mengenai nomor sumuran dan jenis sampel DNA yang dimasukkan. 10. Hubungkan kabel dari sumber arus ke tangki elektroforesis (pastikan bahwa kabel yang tersambung ke kutub negatif berada di dekat sumuran, sedang kabel yang tersambung ke kutub positif berada jauh dari sumuran; jika tidak demikian, ubahlah posisi baki/gel ke arah sebaliknya). 11. Nyalakan sumber arus, aturlah volatase dan waktu running hingga diperoleh angka 100 V dan 30 menit dengan cara menekan tombol yang sesuai pada sumber arus 400 mA. 12. Jalankan elektroforesis (lakukan running) dengan cara menekan tombol run pada sumber arus. 13. Elektroforesis akan berhenti apabila waktu yang ditetapkan sudah habis, yang ditandai oleh adanya bunyi alarm. Matikan sumber arus dan angkatlah baki dari tangki elektroforesis. 14. Keluarkan gel dan letakkan di atas UV transluminator (letakkan selubung kaca hitam di atas UV transluminator). 15. Nyalakan UV transluminator, amati pita-pita DNA yang tervisualisasi. Dokumentasikan dengan kamera digital.

III.

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil

Gambar 1. Hasil Visualisasi Elektroforesis DNA

Keterangan : 1. DNA marka 2. DNA kromosom bakteri 3. DNA kromosom buah

B. Pembahasan Berdasarkan hasil praktikum kelompok 3 menggunakan sampel DNA kromosom bakteri E. coli dan DNA kromosom buah pepaya menunjukkan bahwa tidak terdapat pita DNA yang terwarnai, sehingga tidak dapat diketahui laju migrasinya. Hal ini disebabkan karena beberapa kemungkinan, diantaranya adalah sel tersebut belum lisis sehingga DNA tidak keluar dari sel atau DNA telah mengalami degradasi pada waktu melakukan proses isolasi. Sedangkan menurut Soedarmadji (1996) Hasil elektroforesis akan didapatkan pita-pita yang

terpisahkan berdasarkan berat molekulnya. Tebal tipisnya pita yang terbentuk dari pita tersebut menunjukkan kandungan atau banyaknya molekul yang

mempunyai berat molekul yang sama dan berada pada posisi pita yang sama. Hal ini sejalan dengan prinsip pergerakan molekul bermuatan, yakni molekul

bermuatan dapat bergerak bebas di bawah pengaruh medan listrik, molekul dengan muatan dan ukuran yang sama akan terakumulasi pada zona atau pita yang sama atau berdekatan. Elektroforesis merupakan teknik yang digunakan untuk memisahkan dan memurnikan fragmen-fragmen DNA ataupun RNA yang memiliki muatan listrik di bawah pengaruh medan listrik. Prinsip elektroforesis adalah memisahkan molekul berdasarkan muatannya. DNA yang bermuatan negative karena adanya gugus fosfat akan bergerak ke arah kutub positif selama elektroforesis. Fragmen DNA mempunyai muatan negative yang sama untuk tiap-tiap ukuran panjang, sehingga pergerakan DNA ini akan memiliki kecepatan yang sama untuk mencapai kutub positif (Nugroho, 2010). Pergerakan yang sama antar molekul DNA ini tidak akan dapat digunakan untuk memisahkan DNA berdasarkan ukurannya. Hal inilah yang menyebabkan digunakannya gel untuk memperlambat pergerakan DNA. Gel ini merupakan polimer sehingga akan membentuk semacam jaring-jaring untuk memerangkap DNA. DNA dengan ukuran yang lebih besar akan lebih sulit melewati lubang atau pori dari gel sehingga DNA dengan sendirinya akan terpisah berdasarkan besarnya ukuran karena kemampuan dari DNA yang berbeda-beda dalam melewati pori dalam gel. Media pendukung yang digunakan dalam elektroforesis, antara lain kertas/membrane selulosa, gel pati, gel poliakrilamida, dan gel agarosa (Nugroho, 2010).

Elektroforesis gel merupakan teknik utama dalam biologi molekular dan biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai teknik preparative untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metode-metode sekuensing DNA, atau immuno blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut. Gel yang digunakan adalah agarosa yang berasal dari ekstrak rumput laut yang telah dimurnikan. Marka atau penanda yang digunakan pada proses running merupakan campuran molekul dengan ukuran berbedabeda yang dapat digunakan untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel. Setelah tahap running selesai, dilakukan metode staining dan destaining. Staining methods yaitu pewarnaan gel agarosa dilakukan dengan menggunakan larutan etidium bromida (Etbr) selama 15 menit. Hal ini dilakukan dengan tujuan agar molekul sampel berpendar dalam sinar ultraviolet. Destaining methods atau penghilangan warna dilakukan dengan cara gel dimasukkan ke dalam air (akuades) selama 5 hingga 7 menit (Nugroho, 2010). Hasil penelitian Hadi (2005) tentang karakterisasi fragmen DNA gen glukoamilase (GLU1) produk PCR dengan analisis restriksi menunjukkan hasil elektroforesis gel agarosa dengan urutan DNA marka sebagai berikut :

Gambar 1. Hasil elektroforesis gel agarosa 2% Keterangan : a. DNA kromosom Endomycopsis fibuligera ITB R cc.64 hasil isolasi. b. DNA plasmid psfGLU1 (kontrol positif).

c. Fragmen DNA hasil PCR E. fibuligera ITB.R.cc.64. d. FragmenDNA hasil PCR pSfGLU1. e. Direct Load Wide Range DNA Marker. Fungsi masing-masing dari bahan yang digunakan adalah diantaranya sampel DNA kromosom bakteri dan DNA kromosom buah sebagai sampel, DNA marka sebagai pembanding, buffer TAE ( tris-base 24,2 g sebagai penyeimbang pH DNA sampel, asam asetat glasial 5,71 g sebagai elektrolit dan EDTA 0,5M 10 ml yang berfungsi untuk menginaktifkan enzim DNAse), akuades untuk mencuci EtBr yang tidak menyisip, loading dye 6x sebagai pemberat yang terdiri dari 0,25% bromophenol blue (penanda jalannya DNA), 0,25% xylene cyalol (penanda paling awal jalannya migrasi), 15% ficoll tipe 4000 (sebagai pemberat) dan EDTA 120 mM (menginaktivasi DNAse), larutan Etidium Bromida sebagai pewarna yang akan menyisip diantara basa-basa nitrogen DNA dan akan menunjukkan posisi fragmentfragment dengan ukuran yang berbeda. Fungsi dari alat yang digunakan diantaranya gelas ukur untuk menampung larutan, labu erlenmeyer berfungsi sebagai tempat reaksi kimianya, mikropipet untuk mengambil larutan dengan ukuran yang sangat kecil, sarung tangan berfungsi untuk melindungi tangan dari EtBr yang bersifat karsinogenik dan juga mencegah DNase dari tangan mengkontaminasi bahan-bahan yang akan digunakan, UV transiluminator berfungsi dalam proses visualisasi dan alat elektroforesis yang sangat berperan selama proses elektroforesis berlangsung (Situmorang, 1985). Menurut Gonzalez (2004), bahwa semakin besar ukuran molekul DNA-nya, semakin rendah laju migrasinya, jika hubungan antara ukuran molekul dan laju migrasi dipetakan dalam suatu grafik logaritmik, maka akan diperoleh kurva linier. Semakin rapat agarosa maka hubungannya dengan laju migrasi adalah semakin lambat, begitu sebaliknya apabila semakin renggang agarosa maka laju migrasinya akan semakin cepat. Macam macam elektroforesis menurut Suryanto, (2003) adalah sebagai berikut: 1. Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam dan partikel yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang system pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan

atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorbsivitas zat terlarut. 2. Elektroforesis gel kanji adalah teknik elektroforesis dikembangkan untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar. Tahun 1955 Smithies

mendemonstrasikan bahwa gel yang terbuat dari larutan kanji dapat digunakan untuk memisahkan protein-protein serum manusia. Caranya yaitu dengan menuangkan larutan kanji panas ke dalam cetakan plastik, setelah dibiarkan mendingin kanji tersebut akan membentuk gel yang padat namun rapuh. Gel kanji berperan sebagai fasa diam (stationary phase) yang menggantikan kertas saring Whatman pada teknik terdahulu. Ternyata elektroforesis gel yang diperkenalkan Smithies memicu ilmuwan lain untuk menemukan bahan kimia lain yang dapat digunakan sebagai bahan gel yang lebih baik, seperti gel agarosa dan polimer akrilamida. Penemuan elektroforesis gel kanji di awal karir Smithies membawanya menerima hadiah nobel bidang kedokteran tahun 2007. 3. Teknik elektroforesis gel makin berkembang dan disempurnakan, hingga 12 tahun kemudian ditemukan gel poliakrilamida (PAGE = Polyacrilamide Gel Electrophoresis) yang terbentuk melalui proses polimerisasi akrilamida dan bisakrilamida. PAGE ini sanggup memisahkan campuran DNA/RNA atau protein dengan ukuran lebih besar. Meskipun aplikasi elektroforesis makin berkembang luas, namun ternyata teknik ini masih menyerah jika digunakan untuk memisahkan DNA dengan ukuran yang super besar, misalnya DNA kromosom. Campuran DNA kromosom tidak dapat dipisahkan meskipun ukuran mereka berbeda-beda. 4. Pulse-Field Gel Electrophoresis (PFGE). Pertengahan 1980-an, Schwartz dan Cantor memberitahukan ide cerdasnya untuk memisahkan campuran DNA berukuran super besar menggunakan teknik yang dinamakan Pulse-field Gradient Gel Electrophoresis (PFGE), yang menggunakan pulsa-pulsa pendek medan listrik tegak lurus yang arahnya berganti-ganti. Teknik PFGE kini digunakan secara luas oleh para ahli biologi dalam studi genotyping berskala masif, juga analisa epidemiologi molekular pada patogen. 5. Dua dimensi gel elektroforesis (2-D), sebuah teknologi yang memungkinkan banyak digunakan untuk evaluasi banyak protein. Beberapa langkah dari proses telah dioptimalkan selama beberapa tahun terakhir. Teknik ini memberikan suatu

penyelesaian yang sangat baik. Pengenalan elektroforesis gel different 2-D (DIGE) memungkinkan perbandingan sampel protein yang berbeda dalam gel yang sama, memperkuat analisis kuantitatif dari 2-D (Nilo et al., 2010). Menurut Jusuf (2001) terdapat dua jenis elektroforesis, yaitu : 1. Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ialah ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorpsivitas zat terlarut. 2. Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diam untuk memisahkan molekul-molekul. Awalnya elektoforesis gel dilakukan dengan medium gel kanji (sebagai fase diam) untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar seperti protein-protein. Kemudian elektroforesis gel berkembang dengan menjadikan agarosa dan poliakrilamida sebagai gel media. Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked) yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Elektroforesis gel terdiri dari gel pati, gel agar, dan gel poliakrilamid. Pemisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang memungkinkan pertautan silang (crosslinker), menghasilkan jaringan poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Gel poliakrilamid merupakan gel elektroforesis yang paling sering digunakan karena poliakrilamid lebih efektif untuk diaplikasikan pada asam nukleat, lipoprotein dan lain-lain. Gel poliakrilamid dapat digunakan pada berbagai jenis protein dan asam nukleat dengan ukuran 5 sampai 500 asam basa. Pemisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan. Gel pati berasal dari ektrak kentang. Gel ini biasanya digunakan untuk memisahkan enzim dan protein dengan ukuran 100 kilo Dalton. Sumuran gel ini terletak ditengah-tengah yang bertujuan untuk mengetahui suplai protein. Bila protein bersifat asam maka akan bermigrasi kekutub negatif, bila bernigrasi ke kutub positif berarti bersifat asam. Apabila bersifat netral maka tidak akan terjai migrasi (Mathew, 1990).

Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat. Elektroforesis gel agarosa adalah teknik untuk memisahkan molekul berdasarkan ukuran (berat molekul), muatan listrik dan struktur fisik molekulnya. Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (bp). Gel poliakrilamid (PAGE = polyacrilamida gel electrophoresis) merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein (Diaz-Alaniz, 2012). Beberapa faktor mempengaruhi kecepatan migrasi dari molekul protein menurut Soedarmadji (1996) adalah sebagai berikut : 1. Ukuran molekul protein. Migrasi molekul protein berukuran besar lebih lambat daripada migrasi molekul berukuran kecil. 2. Konsentrasi gel. Migrasi molekul protein pada gel berkosentrasi rendah lebih cepat daripada migrasi molekul protein yang sama pada gel berkosentrasi tinggi. 3. Bufer (penyangga). Dapat berperan sebagai penstabil medium pendukung dan dapat

mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena

ion sebagai pembawa

protein yang bermuatan. Kekuatan ion yang tinggi dalam bufer akan meningkatkan panas sehingga aliran listrik menjadi maksimal. Hal ini dapat mempercepat gerakan molekul protein. Kekuatan ion rendah dalam bufer akan menurunkan panas sehingga aliran listrik akan sangat minimal dan migrasi molekul protein sangat lambat. 4. Medium penyangga. Medium pendukung ideal untuk elektroforesis adalah bahan kimia inert yang bersifat relatif stabil, mudah ditangani dan mempunyai daya serap yang baik, sebagai migrasi elektron atau penyaringan berdasarkan ukuran molekul seperti gel poliakrilamid. 5. Jika ukuran pori dari medium kira-kira sama dengan molekul, maka molekul yang lebih kecil akan berpindah lebih bebas di dalam medan

listrik, sedangkan molekul yang lebih besar akan dibatasi dalam migrasinya. Besarnya pori-pori dapat diatur dengan mengubah

konsentrasi penyusun gel poliakrilamidnya yaitu akrilamid dan biakrilamid. 6. Kekuatan voltase. Voltase yang dipakai rendah (100-500) V, kecepatan migrasi molekul sebanding dengan tingginya voltase yang digunakan. Voltase yang dipakai tinggi (500-10000) V, mobilitas molekul meningkat secara lebih tajam dan digunakan untuk memisahkan senyawa dengan BM rendah serta jenis arus yang dipakai selalu harus searah bukan bolak balik. 7. Temperatur medium disaat proses elektroforesis berlangsung. Jika temperatur tinggi akan mempercepat proses bermigrasinya protein dan sebaliknya jika temperatur rendah akan mengurangi kekuatan bermigrasinya protein.

IV. KESIMPULAN

A. Kesimpulan Berdasarkan hasil dan pembahasan sebelumnya dapat diambil kesimpulan bahwa: 1. Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. 2. Elektroforesis yang sering digunakan ada 3 macam yaitu, gel pati, gel poliakrilamida, dan gel agarosa 3. Hasil yang didapat adalah DNA sampel tidak tervisualisasi, pita-pita dari DNA sampel yang diamati tidak tampak pada elektroforesis gel agarosa. 4. Faktor yang mempengaruhi laju migrasi diantaranya adalah ukuran molekul protein, konsentrasi gel, buffer (penyangga), medium penyangga, kekuatan voltase dan temperatur medium disaat proses elektroforesis berlangsung.

B. Saran Untuk praktikum selanjutnya setiap kelompok melakukan acara praktikum dari pembuatan agarosa sampai visualisasi tidak beberapa kelompok dijadikan satu. Sehingga praktikan lebih memahami dan mengerti cara kerja praktikum tersebut.

DAFTAR REFERENSI

Diaz-Alanis, A.A. Cuellar-Cruz, M. Romero, A.M. Marin, V.M. Urtiz-Estrada, N. Valles, E.G.R. Flores, M.C dan Ruiz-Baca, E. 2012. Analysis by genotyping and by two-dimensional gel electrophoresis of clinical isolates of Streptococcus mutans: A preliminary report. 6(1). Hiller, A.J. & B.E. Davidson. 1994. The use of pulsed field gel elctrophoresis for microbial strain identification. Australasian Biotecnol. 4: 167-168. Gonzalez, R. A. 2004. Morphological and RAPD analysis of hybridization between Quercus affinis and Q. laurina (Fagaceae), two Mexican red oaks. Am. J. of Bot. 91(3):401-409. Hadi, S. 2005. Karakterisasi Fragmen DNA Gen Glukoamilase (GLU1) Produk PCR dengan Analisis Restriksi. Berk. Penel. Hayati: 11 (8179). Jusuf, M. 2001. Genetika I. Sagung Seto, Jakarta. Mathew, Christopher K. 1990. Biochemistry The Benjamin. Cummings, California. Nilo, R., Saffie, C., Lilley, K., Baeza-Yates, R., Cambiazo, V., Campos-Vargas, R., Gonzlez, M., Meisel, L.A., Retamales, J., Silva, H. and Orellana, A. 2010. Proteomic analysis of peach fruit mesocarp softening and chilling injury using difference gel electrophoresis (DIGE). BMC Genomics, 11:43 Nugroho, A.R. 2010. Analisis Integrasi dan Ekspresi Gen Ketahanan Terhadap Geminivirus (AV1) pada Tembakau Transgenik. IPB, Bogor. Radji, Maksum , Anglia Puspaningrum, dan Atiek Sumiati. 2010. Deteksi Cepat Bakteri Escherichia Coli dalam Sampel Air dengan Metode Polymerase Chain Reaction Menggunakan Primer 16E1 dan 16E2. Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi. Departemen Farmasi, FMIPA, Universitas Indonesia: Depok. Makara, Sains, 14 (1): 39-43. Situmorang, M. 1985. Teknik Elektroforesis Agarosa. Erlangga, Jakarta. Soedarmaji, S. 1996. Teknik Analisa Biokimiawi. Edisi Pertama.Liberty, Yogyakarta. Suryanto Dwi. 2003. Melihat Keanekaragaman Organisme melalui beberapa Teknik Genetika Molekuler. Program Studi Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Universitas Sumatera Utara.