LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

PERCOBAAN 5

DIGESTI DAN ELEKTROFORESIS

Disusun oleh

Nama : NURUN NADA ABHAR

NIM : K100190176

Kelas :L

Kelompok : 2

Korektor : Diana Shofita S.

Laboratorium Biologi Molekuler

Fakultas Farmasi
Universitas Muhammadiyah Surakarta
Semester Genap 2020/2021
 DIGESTI DAN ELEKTROFORESIS

I. Tujuan
 Mahasiswa mampu melakukan digesti DNA plasmid BSKS- ARE-LacZ dengan
enzim endonuklease restriksi.
 Mahasiswa mampu melakukan elektroforesis plasmid yang telah didigesti dan
plasmid yang tidak didigesti serta menganalisis hasilnya.

II. Dasar teori

Digesti merupakan proses pemotongan fragmen DNA dengan menggunakan suatu
enzim khusus yaitu enzim restriksi. Enzim restriksi yang digunakan yaitu enzim restriksi
endonuklease yang akan mengenali dan memotong fragmen DNA pada sekuen yang
spesifik. Fragmen yang dipotong akan digabungkan dengan suatu fragmen DNA lain
yang berperan sebagai vektor.
(Klug & Cummings, 1994)
Enzim restriksi endonuklease adalah sejenis enzim bakteri yang dapat mengenali dan
memotong sekuens nukleotida tertentu di dalam untai ganda molekul DNA. Enzim
restriksi endonuklease mampu mengenali sekuens pasangan basa sebanyak 4-8
nukleotida dan melakukan pemotongan di dalam nukleotida tersebut. Enzim restriksi
juga dapat mengenali palindrom. Palindrom merupakan sekuens yang identik jika dibaca
dalam arah 5’ ke 3’ pada kedua untai molekul DNA.
(Stansfield, dkk. 2006)
Digesti adalah pemotongan fragmen DNA yang dihasilkan oleh DNAase I dan II dan
micrococcali nuklease oleh enzim restriksi. Enzim restriksi biasa digunakan pada
pengklonaan gen dan rekayasa genetika. Enzim restriksi mampu memotong molekul
DNA pada lokasi-lokasi spesifik yang jumlahnya terbatas, misalnya enzim restriksi
EcoRI. Enzim restriksi EcoRI hanya akan memotong DNA dengan urutan basa GAATTC
pada sekuens DNA. Enzim restriksi adalah suatu endonuklease yang mengenali urutan
pendek DNA, panjangnya berkisar 4-6 bp. Enzim restriksi dapat memutuskan kedua
untai DNA di dalam suatu urutan DNA.
(Marks dkk. 2000)
III. Alat dan bahan
Digesti Plasmid
Alat :
1. Mikro pipet dengan ukuran (P2, P20, P200, P1000)
2. Tip Box (P2, P20, P200, P1000)
3. Tube dengan label (A+, A-, K+, K-)
4. Microcentrifuge, Trash, Lemari es
5. Baskom berisi es
6. Floating tube rack
7. Waterbath.
Bahan :
1. Larutan buffer
2. pKAN-R plasmid (K) solution
3. pARA plasmid (A) solution
4. Enzim restriksi
5. Air distilasi (dH2O)
Elektroforosis gel
Alat :
1. Mikro pipet dengan ukuran (P2, P20, P200, P1000)
2. Tip Box (P2, P20, P200, P1000)
3. Tube dengan label (gK-, gK+, gA-, gA+, gLIG)
4. Agarose gel
5. Gel rektrophoresis box
6. Power supply
7. Powe supply leads
8. Microcentrifuge
9. Trash.
Bahan :
1. Larutan: pKAN-R (K-), pKAN-R (K-), pKAN-R (K+), pKAN-R (K+)
2. Larutan: pARA (A-), pARA (A-), pARA (A+), pARA (A+)
3. Ligated plasmids (LIG) solution
4. Loading Dye (LD) Solution
5. Distilled water (dH20) solution
6. DNA ladder (M) solution
7. Balancing Tube solution
 8. 1 X Sodium Borate Buffer flask
IV. Cara kerja
Digesti enzim retriksi
Diatur suhu waterbath

Diatur volume mikropipet P20

Diambil larutan buffer retriksi dengan mikropipet P20

Dipipet buffer restriksi ke dalam tabung K+.

Dipipet buffer restriksi ke dalam tabung K-, A+ dan A-.

Dimasukkan larutan lain ke dalam tabung K+, K-, A+ dan A-.

Diputar tabung larutan dalam sentrifugasi.

Diinkubasi tabung larutan pada suhu 37ºC.

Disimpan tabung larutan di dalam freezer.

Verifying a Recombinant Plasmid by Gel Electrophoresis

Diisi tabel protoko.

Ditambahkan dH₂O ke tabung sampel.

Ditambahkan loading dye ke tabung sampel.

Ditambahkan sampel Anda ke tabung sampel. Larutan K+ ke K+ tube, larutan K- ke tube
K-, larutan A+ ke A+ tube, larutan A- ke A- tube, larutan LIG ke gLIG.

Disiapkan microcentrifuge, lakukan sentrifugasi masing-masing sampel.

Disiapkan kotak elektroforesis.

Disusun DNA lead.

Dipipet Tangga DNA ke dalam gel agarosa sesuai urutan.

Dipipet gK− dan solusi lain ke dalam sumur lainnya.

Dilakukan elektroforesis gel dan lihat hasilnya.

V. Hasil percobaan
1. Hasil Digesti

2. Hasil Elektroforesis

1 2 3 4 5 6 7 8 Keterangan:

1 : gA+: terdapat fragmen fragmen DNA hasil

digesti

2. gA-: tidak ada fragmen fragmen DNA hasil

digesti

3. gK+: dihasilkan fragmen DNA hasil digesti

4. gK-: tidak dihasilkan fragmen DNA

5:

6:
Foto gel:
VI. Pembahasan
Digesti Plasmid
Tujuan dalam percobaan ini adalah mampu melakukan digesti DNA plasmid dengan
enzim endonuklease restriksi. Enzim yang digunakan adalah BamHI dan HindIII pada
plasmid pKAN-R dan pARA. Prinsip digesti ini berdasarkan pemotongan DNA sampel
plasmid yang tersedia dengan bantuan enzim restriksi. Digunakan larutan buffer (2,5XB)
dan juga air distilasi pada praktikum ini. Larutan buffer (2,5XB) ini dimasukkan kedalam
semua tabung yaitu tabung K+, tabung K-, tabung A+, dan tabung A-. Kemudian
ditambahkan plasmid pKAN-R kedalam tabung K+ dan K- yang sudah berisi larutan
bufffer tadi. Plasmid pKAN-R mengandung rfp gen, promotor untuk mengontrol ekspresi
gen (pBAD), dan sebuah gen yang dapat membuat bakteri menjadi resisten terhadap
antibiotik kanamycin (kanR). Sedangkan plasmid pARA ditambahkan kedalam tabung A+
dan A-.Yang kemudian keempat tabung tadi disentrifugasi di mikrosentrifugasi dan
diinkubasi dalam waterbath dengan suhu 37ºC. Hasil akhir dari digesti plasmid ini adalah
tabung K+ dan A+ terdapat hasil fragmen DNA sedangkan pada tabung K- dan A- tidak
terdapat hasil fragmen DNA.
Elektroforesis Gel
Pada simulasi Elektroforesis gel digunakan 5 sampel yaitu larutan pKAN-R (K-) yang
berisi plasmid pKAN-R nondisgesti; pKAN-R (K+) yang berisi plasmid pKAN-R digesti;
pARA (A-) berisi plasmid pARA non digesti; pARA (A+) berisi plasmid pARA digesti; dan
larutan LIG yang berisi plasmid ligasi dari fragmen pARA dan pKAN-R. Kemudian
semua sampel ditambahkan loading dye untuk pewarna dan penambah bobot DNA
supaya DNA tidak berada di permukaan
Diambil DNA ladder dan semua sampel kemudian dilakukan Running elektroforesis pada
tegangan 130V dengan waktu 40 menit. Kecepatan migrasi DNA sangat dipengaruhi
oleh tegangan dan arus listrik yang diberikan oleh power supply ke tangki elektroforesis.
Fragmen D. Hasil percobaan pada DNA ladder (M) menunjukan plasmid multimer
berada di antara 10.000 - 8.000 bp; nicked diantara ukuran 6000-5000 bp; dan
supercoiled di antara 5.000 - 4.000 bp. Hasil praktikum menunjukkan hal yang berbeda
dengan ideal result.Beberapa hasil sampel bergeser sedikit dari ideal result, ada juga
yang tidak terbaca. Hal tersebut dikarenakan proses elektroforesis tidak berjalan dengan
baik. Kemungkinan ada kesalahan dalam pembuatan sampel yang akan dibaca.

VII. Kesimpulan
Digesti DNA plasmid dengan enzim endonuklease restriksi.
 Enzim yang digunakan adalah BamHI dan HindIII pada plasmid pKAN-R dan pARA.
Tabung K+ dan A+ terdapat hasil fragmen DNA sedangkan pada tabung K- dan A-
tidak terdapat hasil fragmen DNA.
Kecepatan migrasi DNA sangat dipengaruhi oleh tegangan dan arus listrik yang
diberikan oleh power supply ke tangki elektroforesis.
DNA ladder (M) menunjukan plasmid multimer berada di antara 10.000 - 8.000 bp;
nicked diantara ukuran 6000-5000 bp; dan supercoiled di antara 5.000 - 4.000 bp.
Pada Elektroforesis Gel hasil menunjukkan hal yang berbeda dengan ideal result.
Beberapa hasil sampel bergeser sedikit dari ideal result, ada juga yang tidak
terbaca. Hal tersebut dikarenakan proses elektroforesis tidak berjalan dengan baik.
Kemungkinan ada kesalahan dalam pembuatan sampel yang akan dibaca.

VIII. Daftar pustaka

Klug, W. S. & M. R. Cummings. 1994. Concepts of genetics. 4th ed. Prentice. Hall,
Englewood cliffs.
Marks, D.B., A.D. Marks & C.M. Smith. 2000. Biokimia Kedokteran Dasar. Jakarta:
EGC.
Stansfield,William D. et. al., 2006. Biologi Molekuler Dan Sel, Jakarta: Erlangga.
IX. Lampiran Lembar Hasil
LEMBAR HASIL
DIGESTI DAN ELEKTROFORESIS GEL

A. Digesti Plasmid dengan Enzim Restriksi

1. Bacalah Context dan jawablah pertanyaan di bawah ini dengan singkat!
a. Apa tujuan dari simulasi ini?
Jawab:
menghasilkan dua fragmen DNA: satu fragmen mengandung gen yang
diinginkan, dan fragmen lainnya adalah tulang punggung plasmid yang dapat
digunakan untuk mengekspresikan protein dalam sel bakteri.
b. Apa fungsi dari Enzim Restriksi, sebutkan contohnya.
Jawab :
Enzim Restriksi endonuklease mengenali urutan nukleosida spesifik dan
memotong DNA pada posisi diantara atau diluar sekuen yang dikenalinya.
c. Jelaskan yang anda ketahui mengenai plasmid pKAN dan pARA-R?
Jawab:
Plasmid pKAN-R membawa gen rfp, promotor untuk mengontrol ekspresi gen
(pBAD), dan gen yang membuat bakteri resisten terhadap antibiotik kanamisin
(kanR).
Plasmid pARA mengandung gen yang membuat bakteri resisten terhadap
antibiotik ampisilin (ampR) dan aktivator arabinosa (araC) yang mengaktifkan
promotor pBAD saat bakteri tumbuh di hadapan arabinosa.
d. Pada simulasi ini, plasmid apa yang ingin di-digesti?
Jawab:
plasmid pKAN dan plasmid pARA-R.
2. Bacalah Material dan jawablah pertanyaan di bawah ini
a. Sebutkan alat-alat yang dibutuhkan untuk melakukan digesti plasmid
Jawab:
Alat :
Mikro pipet dengan ukuran (P2, P20, P200, P1000), Tip Box (P2, P20, P200,
P1000), Tube dengan label (A+, A-, K+, K-), Microcentrifuge, Trash, Lemari es,
Baskom berisi es, Floating tube rack, dan Waterbath.
 3. Pada section Result bacalah Result secara keseluruhan, bandingkan actual
result (hasil simulasi anda) dengan ideal result (hasil yang ideal),
screenshoot hasil anda (actual result) ,dan tarik kesimpulan.

Menunjukkan bahwa actual result dan ideal result sama.

B. Gel Electrophoresis
1. Bacalah Context dan jawablah pertanyaan di bawah ini dengan singkat!
a. Apa tujuan dari simulasi ini?
Jawab:
Mahasiswa mampu menggunakan elektroforesis gel untuk memverifikasi
ukuran plasmid rekombinan.
b. Apa yang dimaksud dengan DNA loading dye dan DNA Ladder?
Jawab:
  DNA loading dye ditambahkan ke setiap sampel untuk memvisualisasikan
seberapa cepat gel bekerja. Ini mencegah sampel dari migrasi tanpa sengaja
ke gel secara keseluruhan dan hilang di buffer sekitar yang mengalirkan arus.
 DNA ladder adalah campuran dari fragmen DNA dengan ukuran yang diketahui
yang dapat digunakan untuk memperkirakan ukuran dalam pasangan basa dari
setiap plasmid atau fragmen dengan panjang yang tidak diketahui. DNA ini
digunakan sebagai pembanding.
c. Apa fungsi gel electrophoresis?
Jawab:
Elektroforesis gel digunakan untuk menentukan apakah gen yang diinginkan
dan semua komponen yang diperlukan telah berhasil dimasukkan dalam
plasmid rekombinan.
2. Bacalah Material dan jawablah pertanyaan di bawah ini
a. Sebutkan alat-alat yang dibutuhkan untuk melakukan elektroforesis gel.
Jawab :
Mikro pipet dengan ukuran (P2, P20, P200, P1000), Tip Box (P2, P20, P200,
P1000), Tube dengan label (gK-, gK+, gA-, gA+, gLIG), Agarose gel, Gel
rektrophoresis box, Power supply, Powe supply leads, Microcentrifuge, dan
Trash.

3. Pada section Result bacalah Result secara keseluruhan, bandingkan actual

result (hasil simulasi anda), dan ideal result (hasil yang ideal), screenshoot
hasil anda (actual result) ,dan tarik kesimpulan
Actual result menunjukkan letak pita yang tidak sama dengan ideal result

Surakarta,

Praktikan

NURUN NADA ABHAR