Metode Isolasi DNA Cell Lysis Buffer SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate)

1. Sebanyak 100 mg sampel daging dihaluskan menggunakan mortar dan stamper.

2. Sampel dimasukkan kedalam ependorf 1,5 mL, ditambahkan 200 µL aquadest pada
suhu 75oC dan diinkubasi pada suhu 75oC selama 30 menit di waterbath.
3. Ditambahkan 400 µL cell lysis buffer SDS 1% dan 20 µL proteinase-K, lalu divortex
selama 1 menit .
4. Sampel yang telah tercampur diinkubasi pada suhu 57 oC selama 3 jam dan disentrifus
selama 1 menit dengan kecepatan 13.000 rpm.
5. Supernatan yang terbentuk dimasukkan ke dalam ependorf 1,5 mL baru dan
ditambahkan 400 µL kloroform, lalu campuran divortex selama 30 detik.
6. Campuran disentrifus selama 30 detik dengan kecepatan 13.000 rpm.
7. Lapisan atas yang terbentuk pada campuran dimasukkan ke dalam ependorf 1,5 mL
baru dan ditambahkan 800 µL etanol 96%, lalu diinkubasi pada suhu -20oC selama 1
jam di freezer.
8. Campuran disentrifus selama 3 menit dengan kecepatan 13.000rpm, supernatant yang
terbentuk dibuang.
9. Pellet DNA ditambahkan 500 µL etanol 70%, lalu disentrifus selama 1 menit dengan
kecepatan 13.000 rpm.
10. Supernatan yang terbentuk dibuang, pellet DNA dikeringkan pada suhu ruang selama
5 menit.
11. Pellet DNA yang telah kering ditambahkan 50 µL buffer TE dan diresuspensi.
12. Simpan DNA yang berupa larutan pada suhu -20oC hingga dilakukan PCR pada tahap
selanjutnya.

Pembahasan Tambahan Untuk Laporan Akhir

(Silahkan diambil yang penting dan disesuaikan bahasanya dengan pembahasan mahasiswa)

Isolasi DNA menggunakan buffer SDS 1% mengikuti metode isolasi Zheng, et al., (1995)
dalam Utami, et al., (2012) dilakukan dengan modifikasi pada sampel yang digunakan dan
penggunaan proteinase-K. Penggunaan SDS (Sodium Dodecyl Sulphate) yang merupakan
deterjen akan membuat sel mengalami lisis dengan pengikatan lemak dan protein yang berada
di membrane sel, semua isi sel akan keluar saat membrane sel terbuka (Kamaliah, 2017).
Kation divalent yang merupakan aktivator DNAse akan terikat akibat penambahan EDTA yang
merupakan agen pengkhelat, sehingga menyebabkan terputusnya ikatan fosfodiester pada
DNA (Rahmawati, 2012). Proteinase-K yang ditambahkan pada modifikasi isolasi untuk
membersihkan DNA dari protein (Radulovici et al., 2010). Faatih (2009) menyatakan bahwa
agar komponen DNA dalam sitoplasma sel dapat keluar dan diisolasi perlunya penambahan
reagen pelisis seperti proteinase-K. Larutan kloroform digunakan untuk presipitasi protein
(Utami et al., 2013). Sedangkan etanol absolut digunakan sebagai presipitasi DNA dan etanol
70% digunakan sebagai pencuci pellet untuk menghilangkan kelebihan garam (Syafarudin &
Santoso, 2020). Presipitasi dilakukan dua kali dengan tujuan memperkecil kontaminasi protein
pada DNA (Hidayat, 2016). Inkubasi pada suhu -20oC setelah penambahan etanol absolut
merupakan perlakuan setelah presipitasi DNA yang bertujuan untuk mengendapkan DNA
(Syafarudin & Santoso, 2020). Penambahan kloroform menyebabkan terbentuknya 3 lapisan
yaitu lapisan atas fase air, lapisan tengah protein, dan lapisan bawah fase organik (kloroform)
yang disebabkan karena perbedaan masa jenis. Nilai masa jenis kloroform yaitu 1.4474 g/mL
lebih besar dari masa jenis air 1 g/mL, menyebabkan kloroform berada dilapisan bawah dan
air dilapisan atas (Hidayat, 2016). Lapisan atas fase air mengandung DNA bebas dari
kontaminan protein, dikarenakan DNA dan air memiliki sifat yang sama yaitu polar
(Murtiyaningsih, 2017).

Balia, R. L., Suryaningsih, L., & Putranto, W. S., 2014, Pengujian Pemalsuan Bakso dengan
Daging Babi Melalui Pendekatan Enzimatis Dan Molekuler Pada UKM di Kawasan
Pendidikan Jatinangor Kabupaten Sumedang. Jurnal Aplikasi Ipteks Untuk Masyarakat, 3(2),
70–72.
Fibriana, F., Widianti, T., Retnoningsih, A., & Susanti., 2012, Deteksi Daging Babi Pada
Produk Bakso di Pusat Kota Salatiga Menggunakan Teknik Polymerase Chain Reaction.
Biosaintifika: Journal of Biology & Biology Education, 4(2). Terdapat di:
https://doi.org/10.15294/ biosaintifika.v4i2.3928.
Hidayat, R., 2016, Perbandingan Methode KIT komersial dan SDS untuk Isolasi DNA Babi
dan DNA Sapi Pada Simulasi Cangkang Kapsul Keras untuk Deteksi Kehalalan Menggunakan
Real-Time PCR (Polymerase Chain Reaction). UIN Syarif Hidayatullah Jakarta, 13.