LAPORAN PRAKTIKUM

MK BIOTEKNOLOGI TANAMAN

PENGUJIAN KUALITAS DAN KUANTITAS EKSTRAKSI DNA DARI BERBAGAI

SAMPEL DAUN PADI

KELAS A

KELOMPOK 6

Anisa Puspita Rachman

150510170030

PROGRAM STUDI AGROTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS PADJADJARAN
DESEMBER, 2019
 BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Kualitas produk pangan dilihat dari berbagai aspek komersial menjadi
faktor penting yang dipertanyakan ketika melakukan pemasaran ke ranah
pasar global. Aspek yang dapat berpotensi dalam peningkatan kualitas produk
meliputi rasa, aroma dan non-transgenik. Aroma dan rasa dari padi memiliki
potensi menjadi daya tarik minat konsumen agar dapat meningkatkan selera
makan. Pemuliaan tanaman merupakan metode yang tepat dalam menggali
potensi genetik suatu tanaman untuk memaksimalkan ekspresi dari potensi
tersebut pada suatu kondisi lingkungan tertentu (Stoskopf et al. 1993). Selain
itu, pemuliaan tanaman padi dilakukan melalui perakitan varietas unggul baru
yang berdaya hasil tinggi, berkualitas, serta resisten terhadap kendala biotik
dan abiotik (Shivanna & Sawhney 1997).
Perakitan varietas unggul dapat menjadi solusi alternatif dalam
mendapatkan varietas padi yang memiliki sifat aromatik dengan cara
mengintroduksikan gen aroma padi (badh2 termutasi) dari varietas aromatik ke
varietas non-aromatik. Dalam mendeteksi keragaman genetik pada sampel
bagian tanaman dapat menggunakan marka molekuler dengan beberapa
tahapan prosedur kerja yang diawali dengan mengisolasi DNA atau
mengekstraksi DNA tanaman yang diinginkan. Prinsip dasar dari isolasi DNA
yaitu memecah dinding membran sel (lisis) dan memisahkan DNA dari
komponen bahan lain di dalam tanaman seperti protein, lemak, dan karbohidrat
dengan menggunakan cetyl trimetil ammonium bromide (CTAB) dan sodium
dodesyl sulfat (SDS) (Wijiastuti, 1989). Pengujian kuantitas dan kualitas DNA
hasil isolasi dilakukan dengan mesin Spectrophotometer (Rayleigh UV-9200).
Pengujian ini dilakukan untuk mengetahui konsentrasi dan kemurnian DNA
(Sambrook &Russel, 1989). Amplifikasi PCR dilakukan menggunakan mesin
PCR Thermocycler (Eppendorf).
Analisis kualitas DNA dapat dilihat dari pita elektroforegram DNA hasil PCR
dengan mengamati ketebalan dan ketajaman pitanya. Selain itu, kualitas DNA
juga ditentukan dengan analisis kemurnian DNA hasil isolasi pada kedua
metode yang dilakukan menggunakan metode spektrofotometri UV-Vis 45
dengan melihat rasio Absorbansi λ260/Absorbansi λ280. Kualitas DNA yang
baik akan menghasilkan pita yang relatif lebih tebal dan tajam serta memiliki
nilai rasio kemurnian di antara 1,8-2,0. Apabila nilai rasio absorbansi <1,8
menunjukkan bahwa terdapat kontaminasi protein dan polisakarida pada
sampel uji (Rosilawati, 2002). Namun jika DNA hasil isolasi terkontaminasi oleh
fenol rasio A260/A280 lebih besar dari 2,0 dikarenakan fenol memiliki serapan
maksimal di panjang gelombang 270 nm dan mampu memberi sumbangan
kecil serapan di panjang gelombang 260 nm (Wirajana et al., 2013).
Sifat aroma padi dikendalikan oleh gen fgr (fragrance) yang terletak pada
kromosom 8. Gen fgr (fragrance) memiliki tiga daerah gen pengkode protein,
yaitu 3-metilkrotonil-KoA (Mccc2), karbonat anhidrase (Cah), dan betain
aldehid dehidrogenase (BADH). Betain aldehid dehydrogenase (BADH)
merupakan gen pengendali sifat aroma padi yang terekspresi pada seluruh
bagian padi kecuali akar. Berdasarkan hasil penelitian Bradbury et al. (2005)
gen yang mengkode betain aldehida dehidrogenase (badh) memiliki
polimorfisme di daerah pengkode pada genotip tanaman. Gen badh2 disandi
oleh kromosom nomor 8 yang bertanggung jawab mengendalikan karakter
aroma pada padi. Gen badh2 terdapat pada spesies padi aromatik maupun
padi non aromatik. Adapun sekuen dan nama primer yang berhasil digunakan
dalam membedakan amplifikasi gen DNA padi aromatik dan nonaromatik
adalah External Sense Primer (ESP), External Antisense Primer (EAP), Internal
Fragrant Antisense Primer (IFAP), dan Internal Nonfragrant Sense Primer
(INSP).
Tahap seleksi pada pengujian ini sangat diperlukan agar dapat
menentukan karakter aromatik yang diinginkan. Adapun beberapa metode
seleksi yang berkembang yaitu pada tingkat gametofit dan sporofit (Ottaviano
dan Sari-Gorla, 1993), seleksi secara in vitro (Wenzel dan Foroughi-Webr,
1993), dan seleksi tingkat molekuler (Arus dan Morino-Gonzales, 1993). Teknik
molekuler sangat bervariasi tergantung cara pelaksanaan untuk mendapatkan
data maupun tingkatan target data yang diinginkan sesuai kemudahan
pelaksanaan, kapabilitas sumber daya manusia, fasilitas dan peralatan serta
kecukupan finansial (Karp et al., 1997).
1.2 Tujuan Praktikum
Mahasiswa mampu melakukan identifikasi dan seleksi sampel genotipe hasil
persilangan piramidisasi generasi F2 menggunakan marka yang bertautan
dengan karakter aromatik.
 BAB II BAHAN DAN METODE

2.1 Isolasi DNA

Alat dan bahan:
a) Mortal, pestel, spatula, gunting dan tissue.
b) Larutan CTAB: 2% CTAB, 100mM Tris-Cl (pH 8.0), 20 mM EDTA (pH 8.0), 1.4 M
NaCl

c) 10% SDS (sodium dodesyl sulfat)

d) Isopropanol, chloroform, ethanol 70%, buffer TE

e) Sampel isolasi DNA

Gambar 1. Sampel isolasi DNA

Prosedur pengerjaan isolasi DNA metode CTAB yaitu:

1. Melakukan sterilisasi alat-alat isolasi (mortal, pestel, spatula, dan gunting)
dengan menggunakan alkohol 70%, kemudian mengeringkan dengan
tissue.
2. Memotong sampel kecil-kecil sebanyak kurang lebih 0.5 gram dalam
mortal.
3. Menggerus sampel dalam mortar steril yang diberi buffer ekstraksi
sebanyak 1000 μL yang terdiri dari larutan CTAB 900 μL, lalu gerus sampai
halus
4. Menambahkan larutan SDS 100 μL ke sampel yang sudah halus, lalu
campur sampai merata secara perlahan-lahan.
5. Memasukkan hasil gerusan ke dalam tabung mikro 2 mL, kemudian
diinkubasi di dalam waterbath pada suhu 65 ˚C selama 15 menit sambil
dilakukan pengocokan perlahan setiap lima menit.
6. Melakukan pemurnian DNA melalui penambahan CIA (cloroform isoamil
alkohol = 24:1) sebanyak 700 μL ke dalam tabung, kemudian dikocok
hingga merata.
 7. Melakukan sentrifugasi pada suspensi dengan kecepatan 10000 rpm
selama 10 menit.
8. Mengambil dan memindahkan supernatan ke tabung mikro 1,5 ml.
9. Melakukan pemekatan DNA dengan penambahan isopropanol sebanyak
700 μL ke dalam supernatan dan dicampur perlahan.
10. Melakukan sentrifugasi sampel pada kecepatan 10000 rpm selama 10
menit.
11. Mencuci pelet yang diperoleh dengan 100 μL etanol 70%, kemudian
diamkan selama 30 menit dalam suhu ruang.
12. Melakukan sentrifugasi kembali pada campuran selama 5 menit pada
kecepatan 10000 rpm suhu 4°C.
13. Pelet selanjutnya dikeringkan anginkan pada suhu ruangan selama 24 jam
hingga alkohol mengering.
14. Pelet yang telah kering dilarutkan dalam bufer TE yang mengandung
ribonuklease sebanyak 100 μL dan didiamkan pada suhu 4°C selama satu
hari sebelum digunakan untuk kegiatan selanjutnya.

2.2 Elektroforesis
2.2.1 Pembuatan Agarose
1. Pembuatan agarose dilakukan dengan mempertimbangkan ukuran PCR
product yang diharapkan. Semakin pendek basa DNA yang diperoleh,
maka semakin rapat dan tinggi konsentrasi agarose yang dibuat. Misalnya:
untuk DNA dengan ukuran 500bp, maka dapat dibuat gel agarose dengan
konsentrasi 0,8%.
2. Membuat 0,8 % gel agarose dengan volume total 100 ml dan menimbang
agarose sebanyak 1 gr.
3. Memasukan agarose ke dalam labu erlenmeyer lalu menambahkan 0,5x
TBE buffer yaitu sebanyak 100 ml, aduk-aduk kemudian masukan kedalam
microwave selama 10 menit atau sampai agarose larut (sampai sudah tidak
terlihat adanya gumpalan agarose).
4. Sesudah tercampur dan gel agarose sudah dingin kira-kira suam-suam
kuku, dituangkan ke dalam tray elektroforesis.
5. Pasang sisirnya dan biarkan agarose sampai memadat, sesudah padat
cabut perlahan-lahan sisirnya.
2.2.2 Pengisian Tangki Elektroforesis
1. Mempersiapkan 0,5x TBE buffer dengan volume total 2000 ml. Memasukan
200 ml 5x TBE buffer ke dalam tabung erlemeyer lalu menambahkan
aquades steril hingga volume mencapai 2.000 ml, lalu memasukan ke
dalam tangki elektroforesis.
2. Kemudian memasang tray yang berisi gel agarose ke dalam tangki
elektroforesis.

2.3 PCR
Prosedur pengerjaan uji kuantifikasi dan kualitas DNA menggunakan
spectrophotometer yaitu:
1. Mempersiapkan komponen reaksi MyTaq™ Red Mix Bioline.

Gambar 2. Komponen reaksi MyTaq™ Red Mix Bioline

 Nuclease free water berfungsi untuk melarutkan campuran koktail di

dalam tabung Eppendorf.
 Template (DNA) berfungsi sebagai media pembentukan molekul
DNA yang akan diamplifikasi.
 Primer Forward untuk menandai ujung depan untai DNA.
 Primer Reverse untuk menandai dari ujung belakang DNA.
 MyTaq™ Red Mix Bioline merupakan pewarna merah yang dapat
meningkatkan kontras visual antara reagen dengan bejana reaksi.
2. Mencampurkan semua komponen yang dibuat ke dalam tabung sesuai
urutan pipetting. Kemudian setelah semuanya tercampur mikrotabung
disentrifugasi dalam waktu singkat sekitar 1 menit.
3. Memasukkan sampel dalam mesin PCR. Kemudian mengatur program
PCR dan primer yang akan digunakan sebagai berikut:
 Gambar 3. Tahapan PCR (kiri) dan primer yang digunakan (kanan)

 Pre denaturasi dilakukan selama 1-3 menit pada suhu 94°C untuk
menginisiasi tahapan pemisahan DNA untaian ganda menjadi untaian
tunggal.
 Denaturasi berlangsung pada suhu 93°C – 100°C selama beberapa
menit (biasanya sekitar 3-5 menit). Pemisahan untaian ini diperlukan
agar oligunukleotida primer dapat menempel, karena primer tidak akan
dapat menempel pada DNA cetakan yang masih dalam bentuk untaian
ganda.
 Annealing dilakukan pada suhu sekitar 50°C - 60°C, proses ini
memerlukan waktu sekitar 2-3 menit, tergantung dari enzim yang
digunakan tetapi sekarang memungkinkan hanya 1-4 detik yaitu
dengan menggunakan KOD-Dash polymerase. Pada suhu yang tepat
molekul primer akan menempel pada daerah DNA yang komplementer,
molekul primer yang menempel tersebut berfungsi sebagai molekul
awal dalam proses polimerase DNA. Nukleotida-nukleotida baru akan
ditempelkan di ujung primer tersebut sesuai dengan urutan nukleotida
pada DNA cetakan.
 Extention merupakan proses pemanjangan primer lengkap untuk
sintesis DNA untaian ganda yang dilakukan pada suhu 72°C dengan
menggunakan Taq polymerase selama 2-5 menit.
 Final Extention dilakukan pada suhu 74°C selama 5 menit yang
berguna untuk mengisi setiap ujung untaian DNA yang baru disintesis.
2.2.3 Loading DNA ke sumur elektroforesis dan Running Elektroforesis
1. Terlebih dahulu membersihkan sumur gel agarose dengan menggunakan
siringe
2. Loading sampel 6 μl hasil PCR dan menambahkan 1 μl loading dye ke
dalam sumur gel agarose.
3. Running elektroforesis pada 90 volt selama 60 menit
2.4 Visualisasi DNA
Setelah running elektroforesis selesai, masukan agarose pada UV
transiluminator/gel documentation. Gambar gel diambil dan disimpan dalam
format file JGP/TIF/PNG. Pengamatan dilakukan dengan melihat pola pita DNA
yang terbentuk.

2.5 Analisis Data

2.5.1 Kualitas DNA menggunakan gel elektroforesis
Analisis data dilakukan dengan melihat hasil visualisasi gel elektroforesis uji
kualitas DNA.
 BAB III HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1 Isolasi DNA

Isolasi DNA dari sampel daun padi varietas cek PTB-33 pada tube 1 memiliki
supernatan yang lebih sedikit dibandingkan dengan tube 2 yang terlihat jelas
memiliki bobot supernatan lebih banyak seperti pada gambar 4. Setelah dilakukan
pemekatan DNA dengan penambahan isopropanol sebanyak 700 μL, kemudian
disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 10000 rpm akan didapatkan
pellet pada masing-masing tube. Pellet pada tube 2 jumlahnya banyak dan
terdapat kontaminan. Sedangkan pellet pada tube 1 jumlahnya lebih sedikit
dibandingkan tube 2 dan tidak terdapat kontaminan.

Gambar 4. Supernatan (kiri) dan pellet (kanan) dari sampel daun padi varietas cek PTB-33

3.2 Uji Kualitas DNA dengan Elektroforesis

Agarose yang telah dilakukan running
elektroforesis, kemudian dimasukkan ke
dalam UV transiluminator/gel documentation
untuk mendapatkan gambar gel dalam bentuk
JGP/TIF/PNG. Gambar gel yang dihasilkan
menunjukkan pola pita DNA yang terbentuk.
Pola pita DNA kelompok 6 hanya satu yang
menghasilkan visual pola pita yang relatif
tebal dan tajam yaitu pada pellet tube 2,
Gambar 5. Visualisasi DNA kelas
sedangkan pola pita dari pellet tube 1 memiliki
A
visualisasi pola pita yang lebih tipis dan adanya kontaminan mengakibatkan pola
pita tersebut tertarik ke kutub yang berlawanan dikarenakan adanya komponen
yang memiliki massa lebih berat dibandingkan pellet.
3.3 Seleksi Aromatik
Berdasarkan hasil visualisasi DNA dengan menggunakan UV
transiluminator/gel documentation setiap kelas memiliki jumlah loading dye pada
agarose yang berbeda dikarenakan pembagian jumlah kelompok yang tidak sama
di setiap kelasnya. Dilihat dari hasil visualisasi DNA yang didapatkan masih
banyak terdapat kontaminan RNA, smear dan juga DNA murni tidak muncul.
Kontaminan RNA terjadi karena komponen RNA seperti lemak, protein dan
karbohidrat terbawa pada saat pippeting pellet dari supernatant untuk dipindahkan
ke tabung Eppendorf sehingga menyebabkan DNA menjadi tidak murni. Adanya
pola pita DNA yang terdapat smear disebabkan oleh DNA yang didapatkan
terpotong pada saat pemipetan yang berulang sehingga ukuran pita-pita DNA
tidak sama. Permasalahan tidak adanya DNA pada agarose kemungkinan besar
dikarenakan jumlah pellet dari hasil isolasi DNA sedikit atau bahkan tidak ada
sehingga pola pita DNA tidak terbaca. Berikut tabel data seleksi aromatik dari hasil
visualisasi DNA setiap kelas dengan varietas PTB-33 dengan varietas lainnya:

Tabel 1. Data seleksi aromatik dari hasil visualisasi DNA

Kelas Hasil Visualisasi DNA Keterangan
1. Kontaminan : 6
2. DNA murni : 3
3. DNA murni terdapat smear : 5
A 4. Loading dye kosong : -

1. Kontaminan : 1
2. DNA murni : 6
3. DNA murni terdapat smear : 3
4. Loading dye kosong : 6
B
 1. Kontaminan : -
2. DNA murni : 1
3. DNA murni terdapat smear : 13
C 4. Loading dye kosong : -

1. Kontaminan : 16
2. DNA murni : -
3. DNA murni terdapat smear : 6
D 4. Loading dye kosong : -

1. Kontaminan : 1
2. DNA murni : 10
3. DNA murni terdapat smear : 13
E 4. Loading dye kosong : -

1. Kontaminan : 2
2. DNA murni : -
3. DNA murni terdapat smear : 20
4. Loading dye kosong : 2
F
 1. Kontaminan : 13
2. DNA murni : -
3. DNA murni terdapat smear : 10

G 4. Loading dye kosong : 1

Jika dibandingkan dengan hasil varietas padi lainnya

BAB IV KESIMPULAN
 DAFTAR PUSTAKA

https://www.bioline.com/mytaq-red-mix.html
https://www.addgene.org/protocols/pcr/