LAPORAN PRAKTIKUM GENETIKA II

ISOLASI DNA GENOMIK PROKARIOTA DAN EUKARIOTA

OLEH

NAMA : Syukria Hayati Musfira

NIM : 18032094

KELAS : Biologi D 18

DOSEN : 1. Dr. Yuni Ahda, S. Si, M. Si

2. Afifatul Achyar, S.Si, M. Si

ASISTEN : 1. Masnaini Siregar

2. Oswal Yuselman

JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI PADANG
2020
 Isolasi DNA Genomik Prokariota dan Eukariota

A. Tujuan Pratikum
1. Praktikan memahami prinsip kerja isolasi DNA
2. Praktikan mengetahui prosedur kerja isolasi DNA dari kultur bakteri (prokariota)
3. Praktikan mengetahui prosedur kerja isolasi DNA dari jaringan hewan (eukariota)

B. Waktu dan Tempat

Hari/Tanggal : Senin, 19 Oktober 2020
Waktu : 13.20 - 15.50 WIB
Tempat : Pratikum Daring Genetika II, FMIPA UNP

C. Dasar Teori

Deoxyribonucleic acid atau DNA merupakan senyawa kimia yang paling penting
dalam makhluk hidup. DNA merupakan senyawa yang mengandung informasi genetik
makhluk hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya. Keseluruhan DNA dalam suatu sel
akan membentuk genom. Genom meliputi bagian gen yang fungsional maupun non-
fungsional dalam sel organisme. DNA genom meliputi gen danintergen (Suryo, 2004).

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk
mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat
pada nukleus, mitikondria, dan kloroplas. Perbedaan ketiganya adalah DNA nukleus
berbentuk linier dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA
mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon.
Selain itu DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-
sifat yang berasal dari garis ibu. Sedangkan DNA nukleus memiliki pola pewarisan sifat dari
kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot tidak memiliki protein
histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linier dan memiliki
protein histon (Syafaruddin, 2011).

Pada umumnya identifikasi bakteri konvensional dilakukan dalam waktu yang cukup
lama (3-4 hari) dengan mengamati pertumbuhan bakteri serta sifat biokimia dari bakteri
tersebut. Saat ini sudah dikembangkan metode PCR (Polymerase Chain Reaction) untuk
mempercepat identifikasi bakteri, sehingga dapat mempersingkat waktu identifikasi bakteri.
Prinsip pemeriksaan dengan PCR adalah perbanyakan DNA target secara in vitro. Syarat
identifikasi menggunakan teknik PCR memerlukan DNA yang murni. Kelebihan identifikasi
bakteri menggunakan metode PCR selain dapat mempersingkat waktu juga memiliki
sensitifitas dan selektifitas tinggi sehingga pemeriksaan lebih akurat. Untuk menunjang
identifikasi PCR, tahapan pra analitik yang harus dilalui yaitu isolasi DNA (Wasdili, 2018).

1
 Teknik dan metode isolasi DNA saat sudah banyak dikembangkan namun teknik
tersebut masih bersifat universal bagi tanaman atau hewan dan mikroorganisme. Teknologi
terbaru telah dikembangkan teknik isolasi DNA dalam paket miniprep kit DNA extraction
untuk tanaman sudah dilengkapi dengan bahan dan kolom pembersih polisakarida (Porebski
et al. 1997; Isaac 2002).

Metode yang dapat digunakan untuk menentukan jumlah dan kualitas DNA adalah
spektrofotometri, elektroforesis, fluorometri dan luminometri. Uji kualitas DNA
menggunakan spektrofotometri adalah dengan mengukur DNA murni hasil isolasi pada
panjang gelombang 260 nm, dimana DNA menyerap cahaya paling kuat. Perhitungan
kemurnian yang paling umum adalah dengan menentukan rasio absorbansi dari panjang
gelombang 260 nm dibagi dengan absorbansi dari panjang 280 nm. Kualitas DNA juga dapat
dilihat dari hasil elektroforesis gel agarosa 1% (Wasdili, 2018).

2
D. Alat dan Bahan

Alat
1. Mikropipet berbagai ukuran
2. Bunsen
3. Oose
4. Heatblock/waterbath
5. Vortex
6. Stopwatch
7. Refrigerated-centrifuge
8. Pisau bedah steril
9. Gunting bedah steril
10. Micropestle steril
11. Nanophotometer
12. Wadah limbah
13. Botol limbah khusus
phenol-chloroform
Bahan
1. Kultur bakteri
2. Jaringan hewan (daging sapi)
3. ddH2O steril atau buffer TE pH 8 steril
4. Ribozol (phenol)*
5. Chloroform*
6. Ethanol Absolut
7. 0,1 M Sodium Citrate, 10 % ethanol
8. Ethanol 75%
9. 8 mM NaOH
10. Microtube 1,5 ml steril
11. Tips berbagai ukuran
12. Alkohol semprot
13. Tisu
14. Aluminium foil

E. Cara Kerja
a. Isolasi DNA dari Kultur Bakteri (Prokariota) Menggunakan Metode Boiling (Heat
Treatment)
 Siapkan heatblock/waterbath lalu atur suhu 95-100oC.
 Bersihkan area kerja dengan alkohol 70% dan siapkan peralatan untuk cuplik
koloni bakteri secara aseptik.
 Cuplik 1-2 koloni bakteri menggunakan tips steril/oose dari kultur bakteri, lalu
masukkan ke dalam microtube 1,5 ml steril yang sudah diisi dengan ddH2O atau
buffer TE pH 8 steril sebanyak 100-500 μl.
 Inkubasi di dalam heatblock/waterbath selama 10 menit. 5. Sentrifugasi pada
kecepatan 2.000 rpm selama 5 menit.
 Pisahkan supernatan yang mengandung DNA dari pellet bakteri ke dalam
microtube steril menggunakan mikropipet. Hati-hati jangan sampai pellet bakteri
ikut terbawa.
 Ukur konsentrasi dan kemurnian DNA menggunakan Nanophotometer.
 Simpan sampel DNA pada suhu -20oC.

b. Isolasi DNA dari Jaringan Hewan (Eukariota) Menggunakan Metode Phenol-

Chloroform
No. Tahapan Prosedur Kerja
1. Homogenisasi  Siapkan refrigerated-centrifuge, atur suhu menjadi 4oC.
sampel/Lisis sel  Timbang sampel jaringan hewan 50-100 mg, masukkan
3
 ke dalam microtube 1,5 ml steril.
 Tambahkan 200 μl Ribozol (Phenol)*
 Homogenisasi sampel dengan ribozol dengan bantuan
gunting bedah dan micropestle steril
 Setelah homogen, tambahkan 800 μl Ribozol (Phenol)*
2. Fase Pemisahan  Inkubasi pada suhu ruang selama 5-10 menit.
 Tambahkan 200 μl Chloroform*, pastikan microtube
tertutup dengan aman.
 Kocok microtube dengan tangan selama 15 detik
 Inkubasi pada suhu ruang selama 2-3 menit
 Sentrifugasi pada kecepatan 12.000 xg; suhu 2-8oC;
selama 15 menit
 Hasil sentrifugasi akan terbentuk 3 fase yaitu:
- Fase phenol-chloroform (fase organik) yang
berwarna merah muda pada bagian bawah
- Interphase yang berwarna putih (mengandung
DNA)
- Fase aqueous yang tidak berwarna pada bagian
atas (mengandung RNA)
 Pisahkan fase aqueous ke microtube lain
menggunakan mikropipet 100 μl dengan hati-hati (jangan
sampai tercampur lagi).
3. Presipitasi DNA  Pastikan fase aqueous sudah tidak ada pada sampel
 Tambahkan 300 μl ethanol absolut untuk
menghomogenkan interphase dan fase organik, dengan
cara membolak-balikkan microtube.
 Inkubasi pada suhu ruang selama 3 menit
 Sentrifugasi pada kecepatan 2.000 xg; suhu 2-8oC;
selama 5 menit.
 Pisahkan/buang supernatan yang mengandung phenol-
ethanol
4. Pencucian DNA  Cuci DNA dengan menambahkan 0,1 M Sodium
Citrate/10% ethanol sebanyak 1 mL ke pellet pada
microtube.
 Inkubasi pada suhu ruang selama 30 menit. Selama
inkubasi bolak-balik microtube secara berkala setiap 5-
10 menit.
 Sentrifugasi pada kecepatan 2.000 xg; suhu 2-8oC;
selama 5 menit.
 Buang supernatan
 Ulangi tahap pencucian DNA (1-4)
4
  Resuspensi pellet DNA dengan Ethanol 75% sebanyak 1
mL
 Inkubasi pada suhu ruang selama 10-20 menit.
Selama inkubasi bolak-balik microtube secara berkala
setiap 5-10 menit.
 Sentrifugasi pada kecepatan 2.000 xg; suhu 2-8oC;
selama 5 menit.
 Buang supernatan dengan hati-hati, jangan sampai pellet
DNA ikut terbuang
5. Rehidrasi DNA  Kering-anginkan microtube dengan posisi terbalik dan
tutup dibuka di atas kertas tisu selama 10-15 menit
 Larutkan DNA dengan 8 mM NaOH (pH ~9) sebanyak
50 μl (untuk 50 mg sampel)
 Jika ada endapan yang tidak larut, sentrifugasi pada
kecepatan 12.000 xg; suhu 2-8oC; selama 10 menit
 Pindahkan supernatan yang mengandung DNA ke
microtube steril baru.
 Sesuaikan pH menjadi 7-8 dengan menambahkan 50 μl
buffer TE pH 8 (untuk 50 mg sampel)
6. Pengukuran  Nyalakan alat Nanophotometer sesuai SOP
konsentrasi dan  Pipet 2 μL Buffer TE sebagai blanko, lalu bersihkan
kemurnian DNA dengan tisu
dengan  Pipet 2 μL sampel DNA, lalu ukur konsentrasinya
Nanophotometer  Apa kriteria suatu sampel DNA memiliki kemurnian
yang baik? (rasio angka yang muncul berkisar 1,6-2,1)
 Simpan sampel DNA pada suhu -20 oC.

5
F. Hasil Pengamatan

Hasil Isolasi DNA Prokariota Hasil Isolasi DNA Eukariota

Hasil uji kemurnian Eukariota, rasio yang

Hasil uji kemurnian Prokariota
didapatkan dari uji ini adalah 1,205. Dimana ini
menunjukkan 40,300 (ini hanya
berarti isolasi DNA masih belumlah murni.
konsentrasinya, bukan rasio)
Angka yang diterima adalah 1,6 – 2,1

6
G. Pembahasan

Isolasi DNA merupakan tahap awal atau tahap pra analitik yang harus dilakukan
sebelum melakukan PCR. Tahap isolasi DNA berhubungan dengan kualitas dan kuantitas
DNA serta berperan penting dalam keberhasilan PCR. Secara umum tahap isolasi DNA
terdiri dari 3 tahap, yaitu pembuatan sel lisat bakteri, pengikatan DNA bakteri, dan Elusi
DNA. Tahap pembuatan sel lisat dengan menambahkan proteinase K dan RNase A.

Proteinase K berfungsi untuk melisiskan sel atau jaringan, sedangkan RNase A

berfungsi untuk mendegradasi keberadaan RNA dan meminimalkan kontaminan RNA dalam
sampel. Setelah lisis sel tahap selanjutnya adalah pengikatan DNA, DNA akan berikatan
dengan silika pada kolom dengan kondisi yang sesuai. Tahap terakhir dari isolasi DNA
adalah elusi DNA. Elusi DNA merupakan proses ekstraksi DNA dari fase padat spin kolom
dengan menambahkan bufer elusi.

Untuk proses isolasi DNA itu sendiri baik DNA tumbuhan, hewan, bakteri maupun
virus prinsipnya sama, tak berbeda. Namun, karena faktor perbedaan struktur dan komponen
sel tersebut, maka terjadi modifikasi pada bahan dan teknik isolasi DNA pada masing-
masing objek.

Pada pratikum ini, kita mengisolasi DNA dari 2 tipe makhluk hidup, yaitu Prokariota
dan Eukariota. Untuk prokariota, bahan yang digunakan adalah bakteri E.Coli yang sudah
dibiakkan, sementara untuk eukariota bahan yang digunakan adalah daging sapi.
Sebagaimana yang disebutkan diatas, prinsip isolasi kedua bahan ini sama, namun metode
dan teknik nya berbeda. Dimana pada prokariota kita menggunakan metode Boiling (Heat
Treatment), sedangkan untuk daging sapi kita menggunakan metode Phenol-Chloroform.

Metode boiling, dengan menginkubasi bakteri di dalam heatblock membuat dinding

bakteri hancur sehingga DNA bisa terpapar keluar sel, selanjutnya sampel disentrifugasi
untuk memisahkan protein dari DNA sehingga terbentuk lapisan pelet (protein) dan
supernatan(DNA dan RNA).

Metode Phenol-Chloroform kita gunakan untuk mengisolasi DNA eukariota, dimana

Phenol berfungsi untuk lisis sel, sementara Chloroform berfungsi pada fase pemisahan DNA
dari komponen-komponen lain. Namun selain 2 zat ini kita juga menggunakan zat lain
seperti ethanol, sodium sitrat, dan lainnya. Pada fase pemisahan nantinya akan terbentuk 3
lapisan. Paling atas itu lapisan aqueous yang mengandung RNA, lapisan Interphase yang
mengandung DNA, dan paling bawah fase organik yang mengandung Phenol.

Kemudian, pada saat uji kemurnian DNA. Pada prokariota didapatkan konsentrasi
40,300. Dan pada Eukariota dengan konsentrasi 7483,3 didapatkan rasio kemurniannya
1,205. Sementara kualitas DNA yang memiliki kriteria baik apabila tingkat kemurnian
7
berada pada rentang 1,6 – 2,1. Oleh karena itu, sampel DNA yang kita pratikumkan masih
belumlah murni, sebab angka 1,2 berada di bawah 1,6. Ini artinya pada sampel DNA masih
mengandung Phenol dan pelarut sisa isolasi DNA. Apabila berada diatas angka 2,1 itu
artinya sampel DNA mengandung kontaminan seperti protein dan komponen lain sel, atau
pada saat proses lisis sel tidak sempurna.

Kemurnian DNA dipengaruhi oleh faktor teknis dalam melakukan isolasi DNA.
Faktor teknis yang dapat mempengaruhi hasil isolasi DNA adalah proses pengeringan dari
etanol karena etanol dapat menjadi salah satu kontaminan, suhu dan waktu inkubasi, serta
jumlah sel bakteri sebelum isolasi DNA, karena setiap metode isolasi memiliki batas
maksimal pengikatan DNA yang berhubungan dengan jumlah sel bakteri, sehingga penting
untuk menentukan jumlah sel bakteri terlebih dahulu sebelum isolasi dengan
membandingkan absorban pada panjang gelombang 650 nm antara suspensi bakteri dan
standar Mc Farland.

8
H. Kesimpulan
1. Baik isolasi DNA pada tumbuhan, hewan, bakteri maupun virus memiliki prinsip yang
sama, namun mengalami modifikasi dalam pelaksanaan dan tekniknya.
2. Tiga prinsip isolasi DNA adalah : lisis sel, memisahkan DNA dari komponn-komponen
lain, dan pemurnian DNA.
3. Isolasi pada sel prokariota (bahan: bakteri E.Coli)digunakan metode boiling dengan suhu
tinggi untuk me-lisis dinding bakteri agar DNA terpapar.
4. Sedangkan pada sel eukariota yang diwakili daging sapi metode isolasi DNA nya
menggunakan Phenol-Chloroform.
5. Terdapat beberapa tahapan untuk mengisolasi DNA diantaranya: Homogenisasi sampel
(lisis sel), fase pemisahan, presipitasi DNA, pencucian DNA, rehidrasi DNA, Uji
kemurnian DNA menggunakan Nanophotometer.
6. Suatu sampel DNA dikatakan memiliki kemurnian yang baik apabila berada di kisaran
rasio 1,6 - 2,1.
7. Bila berada di bawah rasio 1,6 tersebut berarti sampel DNA masih mengandung fenol dan
pelarut sisa isolasi DNA, dan bila berada diatas angka 2,1 itu artinya sampel DNA
mengandung kontaminan seperti protein dan komponen lain sel, atau pada saat proses lisis
sel tidak sempurna.

9
 DAFTAR PUSTAKA

Bhau, B.S., et al. 2015. Development of An effective and efficient DNA isolation method for
Cinnamomum species, Food Chemistry.

Ghatak, Souvik., Muthukumaran, Rajendra., Nachimuthu, Senthil. 2013. A simple method of

genomic DNA extraction from human sample PCR-RFLP analysis. Journal of
Biomolecular Techniques, 24(4), 224-231.

Isaac, and D.S. Ingram (Eds.). Molecular Tool for Screening Biodiversity. Chapman and Hall,
London Schlink K, Reski R. 2002. Preparing high-quality DNA from Moss
(Physcomitrella patens). Plant Mol Biol Rep. 20: 423a-423f

Lister, H. 2013. Cell and DNA. National Institute of Health. Depertemen of Health and Human
Service. USA Invitrogen. 2012. User Guide PureLink Genomic DNA. Life
Technologies. USA

Porebski, S., L.G. Baily, and B.R. Baum. 1997. Modification of a CTAB DNA extraction
protocol for plants containing high polysaccharide and polyphenol components. Plant
Mol. Biol. Rep. 15: 8- 15.

Suryo, 2004. Genetika Strata 1. Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta.

Syafaruddin., Randriani, Enny., Santoso, Joko. 2011. Efektivitas dan efisiensi teknik isolasi dan
purifikasi DNA pada jambu mete. Journal of Industrial and Beverage Crops.

Wasdili, F. A. Q., Tintin, G. 2018. Penentuan Kualitas Isolasi DNA Salmonella typhimurium
Dengan Metode Spektrofotometri Dan Elektroforesis. Prosiding Pertemuan Ilmiah
Nasional Penelitian & Pengabdian Masyarakat (PINLITAMAS 1) Dies Natalis ke-16
STIKES Jenderal Achmad Yani Cimahi PINLITAMAS 1 | Vol 1, No.1 | Oktober 2018 |
ISSN 2654-5411

Widyastuti, Dyah. 2016. Isolasi DNA kromosom Salmonella sp. dan visualisasinya pada
elektroforesis gel agarosa, Seminar Nasional Pendidikan Biologi dan Saintek II,
Searang, 311-317

Yang, A and C, Yen. 2012. PCR optimization of BOX-AIR PCR for microbial source tracking of
Escherichia coli in waterways. Journal of Experimental Microbiology and Immunology,
16, 85- 89.

10