LAPORAN RESMI PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI
(Isolasi DNA Kromosom)

Disusun Oleh:
Nama : Fahdilah Cahya Ningrum
NIM : K4320028
Kelas :A
Kelompok : 3

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI

FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN
UNIVERSITAS SEBELAS MARET
SURAKARTA
2021
 Laporan Resmi Praktikum
Mikrobiologi

I. JUDUL : Isolasi DNA

II. TUJUAN :
Mahasiswa dapat melakukan isolasi DNA kromosom pada bakteri.

III. PRINSIP KERJA :

1. Memasukan 1 ml suspense Nutrient Broth ke dalam tabung mikro.
2. Melakukan sentrifugasi tabung mikro selama 10 menit.
3. Membuang supernatan dari tabung mikro.
4. Menyuspensikan pellet TE 565 µl lalu mengocoknya.
5. Menambahkan 30 ml 10% SDS (Sodium Dodecyl Sulfat) dan 3 µl
proteinase K kemudian mengocoknya hingga tercampur.
6. Mengingkubasi pada waterbath dengan suhu 37°C selama 1 jam.
7. Menambahakan 0,7 ml fenol : kloroform : asoamilalkohol (25 : 24 : 1)
kemudian mengocoknya.
8. Memasukan larutan ke dalam sentrifuge selama 5 menit.
9. Memindahkan 1000 ml supernatan ke dalam tabung mikro baru
menggunakan pipet mikro.
10. Menambahkan 0,6 ml isopropanol ke dalam cairan supernatan kemudian
mengocok dengan cara membolak-balik lalu menyentrifugasi selama 2-4
menit.
11. Membuang supernatan lalu menambahkan 1 ml etanol 70% dingin
dilanjutkan sentrifugasi selama 2-4 menit.
12. Membuang kembali supernatan dan mengeringkannya pada pallet DNA
selama 3-4 jam.
13. Menambahkan 10 ml TE kemudian dilarutkan dan disimpan di kulkas
semalaman.
14. Mengeluarkan tabung mikro dari kulkas, kemudian di amati apakah
terbentuk benang-benang putih atau tidak.
IV. PENGERTIAN ISOLASI DNA
DNA merupakan senyawa yang mengandung informasi genetik makhluk hidup dari satu
generasi ke generasi selanjutnya. Keseluruhan DNA dalam suatu sel akan membentuk genom.
Genom meliputi bagian gen yang fungsional maupun non-fungsional dalam sel organisme.
DNA genom meliputi gen danintergen (Suryo, 2004). DNA adalah asam nukleat yang
mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh
bentuk kehidupan secara seluler.
Isolasi DNA merupakan salah satu teknik dasar dalam biologi molekuler yang dapat
dikembangkan menjadi penelitian-penelitian yang kompleks mengenai informasi genetik
yang dimiliki oleh suatu organisme.Informasi pada DNA disimpan dalam bentuk basa
nukleotida yaitu adenine (A), guanine (G), cytosine (C), dan timin (T).Setiap sekuen basa
nukleotida mengandung informasi genetik yang berperan dalam perkembangan dan
pengaturan organisme (Lister, 2013).
Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein,
lemak, dan karbohidrat. Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis),
ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian
DNA. Prinsip isolasi DNA pada berbagai jenis sel atau jaringan pada berbagai organisme pada
dasarnya sama namun memiliki modifikasi dalam hal teknik dan bahan yang digunakan.
Bahkan beberapa teknik menjadi lebih mudah dengan menggunakan kit.

V. MACAM-MACAM TEKNIK ISOLASI DNA

Isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain: preparasi ekstrak sel,
pemurnian DNA dari ekstrsk sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan
dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan
hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam
konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan
dengan sample buah, maka kadar air pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil
yang berbeda-beda pula. Semakin tinggi kadar air, maka sel yang terlarut di dalam ekstrak
akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit (Kirsman, 2010).
Penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat menyebabkan rusaknya membrane sel,
melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen dengan protein dan lemak pada
membrane membentuk senyawa “lipid protein-deterjen kompleks”. Senyawa tersebut dapat
terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga
 dengan deterjen, sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia (Kirsman, 2010).
Prinsip – prinsip dalam mengisolasi DNA (Tohib, 2012):
1. Melisis sel secara fisik, dengan cara penggerusan.
2. Pemecahan dinding sel.
3. Pemecahan membran sel.
4. Pemisahan DNA dari bahan yang lain.

VI. FUNGSI LARUTAN KIMIA

Dalam isolasi DNA, bahan yang kita gunakan biasanya berupa jaringan tumbuhan atau
jaringan hewan, untuk itu langkah pertama yang harus kita lakukan adalah memecahkan
jaringan menjadi sel-sel yang mandiri. Proses dilakukan secara mekanik atau fisik dengan
menumbuk atau menggerus bahan yang akan kita gunakan dengan mortar atau blender. Kedua
adalah memecahkan dinding sel dan membran sel lapisan pembungkus DNA. struktur utama
pembentuk membran dan dinding sel adalah lemak, untuk itu kita gunakan deterjen dan garam
dapur. Kedua bahan ini digunakan untuk melubangi dan merusak sel sehingga isi inti sel
(DNA) bisa keluar (Tohib, 2012).
Tahap selanjutnya adalah pemisahan DNA dari bahan yang lain. Pemisahan dilakukan dengan
menggunakan ethanol/alkohol dingin berkonsentrasi 90-95%. Ethanol/Alkohol tidak
melarutkan DNA dan berat jenis alkohol yang lebih ringan dari air membuat DNA naik dan
melayang-layang di permukaan (Tohib, 2012).
CTAB atau Cetyl trimethylammonium bromide merupakan sejenis deterjen yang dapat
mendegradasi dinding sel, denaturasi protein, memisahkan karbohidrat, merusak membran sel
dan melarutkan DNA. Apabila dinding sel terdegradasi maka semua isi sel dapat keluar
termasuk DNA dan dilepaskan ke dalam buffer ekstraksi.Dalam proses isolasi DNA tanaman,
penambahan senyawa pereduksi seperti merchaptoetanol dapat mencegah proses oksidasi
senyawa fenolik sehingga menghambat aktivitas radikal bebas yang dihasilkan oleh oksidasi
fenol terhadap asam nukleat. Merchaptoetanol juga berfungsi untuk melindungi RNA dari
senyawa quinon, disulphide, peroksida, poliphenoksidase, dan protein. Proses pemansan
pertama bertujuan untuk melarutkan CTAB dan mercaptoetanol. Sedangkan pemanasan yang
kedua bertujuan untuk memdegradasi protein dan dinding sel (Tohib, 2012).
Klorofrom dan isoamilalkohol (CIAA) berfungsi untuk mengekstrak dan dan mengendapkan
komponen polisakarida di dalam buffer ektraksi yang mengkontaminasi larutan DNA.
Pemberian isopropanol dan etanol dilakukan agar terjadi dehidrasi DNA sehingga terjadi
 presipitasi. Setelah pemberian etanol, pellet yang dipeoleh dikeringanginkan. Hal ini
bertujuan untuk mengeringkan pellet dari sisa-sisa buffer maupun etanol.Tahapan terakhir
dari ektraksi ini adalah penambahan buffer TE. Buffer TE tris electrophoresisberfungsi untuk
melarutkan DNA yangdihasilkan dan menjagaDNA agar tidak mudah rusak. Dalam buffer TE
mengandung EDTA atau Ethylene Diamine Tetra Acid yang berfungsi sebagai senyawa
pengkelat yang mengikat ion Magnesium, yaitu kofaktor yang diperlukan untuk altivtas
berbagai enzim nuclease. Metode ekstraksi DNA dengan CTAB akan menghasilkan pita DNA
yang berukuran tebal dan dapat memisahkan DNA dari polisakarida karena adanya perbedaan
karakteristik kelarutan (differensial of solubility). Disamping deperoleh fragmen DNA,
dengan metode CTAB juga akan diperoleh RNA dengan pita tipis yang terletak jauh berada
di bawah pita DNA. Keberadaan pita RNA tergantung bahan yang diekstraksi (Asris, 2010).

VII. PEMBAHASAN
GAMBAR KETERANGAN
1. Memasukkan 1 ml suspensi nutrient
broth ke dalam tabung mikro.

2. Melakukan sentrifugasi tabung

mikro selama 30 detik.

3. Membuang supernatan dari tabung

mikro.
4. Menyuspensikan pellet TE 565 𝜇l
lalu mengocoknya.

5. Menambahkan 30 𝜇l 10% SDS dan 3

𝜇l proteinase K kemudian
mengocoknya hingga tercampur.

6. Menginkubasi pada waterbath

dengan suhu 37o selama 1 jam.

7. Menambahkan 0,7 ml fenol :

kloroform : isomilalkohol (25:24:1)
kemudian mengocoknya.

8. Memasukkan larutan kedalam

sentrifuge selama 5 menit.

9. Memindahkan 1000 𝜇l supernatan ke

dalam tabung mikro baru
menggunakan pipet mikro.
10. Menambahkan 0,6 ml isopropanol ke
dalam cairan supernatan kemudian
mengocok dengan cara membolak-
balik lalu menyentrifugasi selama 10
menit.

11. Membuang supernatan lalu

menambahkan 1 ml etanol 10%
dengan dilanjutkan sentrifugasi
selama 3 menit. (sentrifugasi di tahap
ini dilakukan 2 kali karena yang
pertama masing ada endapan pada
tabung mikro)

12. Membuang kembali supernatan dan

mengeringkannya pada pellet DNA
selama 3-4 jam.
 13. Menambahkan 10 𝜇l TE kemudian
dilanjutkan dan disimpan di dalam
kulkas semalaman.

VIII. FAKTOR PENYEBAB KEGAGALAN ISOLASI DNA

1. Kegagalan tersebut bisa jadi disebabkan karena stok bakteri yang ada tidak viable lagi
(Yuwono, 2008).
2. Pada saat pengambilan bakteri, yang pertama itu cuma keambil medianya saja, dan tidak
ada bakterinya.
3. Pada saat pembuangan supernata itu, supernata nya masih ada sisa.
Pada saat sentrifugasi tidak kepisah.

IX. KESIMPULAN
Tahapan isolasi DNA kromosom Faktor kegagalan isolasi DNA
1) Memasukan 1 ml suspense Nutrient Broth ke 1) Stok bakteri yang ada
 dalam tabung mikro. tidak viable lagi.
2) Melakukan sentrifugasi tabung mikro selama 10 2) Saat pengmambilan
menit. bakteri, hanya terambil
3) Membuang supernatan dari tabung mikro. medianya saja, tidak ada
4) Menyuspensikan pellet TE 565 µl lalu bakterinya.
mengocoknya. 3) Supernata tidak
5) Menambahkan 30 ml 10% SDS (Sodium Dodecyl seluruhnya terbuang.
Sulfat) dan 3 µl proteinase K kemudian
mengocoknya hingga tercampur.
6) Mengingkubasi pada waterbath dengan suhu
37°C selama 1 jam.
7) Menambahakan 0,7 ml fenol : kloroform :
asoamilalkohol (25 : 24 : 1) kemudian
mengocoknya.
8) Memasukan larutan ke dalam sentrifuge selama 5
menit.
9) Memindahkan 1000 ml supernatan ke dalam
tabung mikro baru menggunakan pipet mikro.
10) Menambahkan 0,6 ml isopropanol ke dalam
cairan supernatan kemudian mengocok dengan
cara membolak-balik lalu menyentrifugasi
selama 2-4 menit.
11) Membuang supernatan lalu menambahkan 1 ml
etanol 70% dingin dilanjutkan sentrifugasi
selama 2-4 menit.
12) Membuang kembali supernatan dan
mengeringkannya pada pallet DNA selama 3-4
jam.
13) Menambahkan 10 ml TE kemudian dilarutkan
dan disimpan di kulkas semalaman.
14) Mengeluarkan tabung mikro dari kulkas,
kemudian di amati apakah terbentuk benang-
benang putih atau tidak.
X. DAFTAR PUSTAKA
Anonim. (2000). DNA extraction from bacteria.
Faatih, M. (2009). Isolasi dan digesti DNA kromosom.
Lister, H. (2013). Cells and DNA.National Institute of Health.Department of Health and
Human Services. USA.
Muhammad, B. N., Fadli, Z., & Risandiansyah, R. (2020). Perbandingan Isolasi DNA Bakteri
Escherichia coli dengan Metode Heat Treatment dan Filter Based Kit Berdasarkan
Nilai Limit of Detection dan Limit of Quantification. Jurnal Kedokteran
Komunitas, 8(2).
SITI ZAINATUN W, Z. E. Z. E. N. (2017). ISOLASI DNA. MATA KULIAH.
Wasdili, F. A. Q., & Gartinah, T. (2018). Penentuan Kualitas Isolasi DNA Salmonella
Typhimurium Dengan Metode Spektrofotometri dan Elektroforesis. Prosiding PIN-
LITAMAS 1, 1(1), 578-582.
Widyastuti, D. A. (2017). Isolasi DNA Kromosom Salmonella sp. dan visualisasinya pada
elektroforesis gel agarosa. In Seminar Nasional Pendidikan Biologi dan Saintek (pp.
311-317).
XI. LAMPIRAN
1. Abstrak jurnal
2. Dokumentasi
XII. LEMBAR PENGESAHAN

Surakarta, 28 November 2021

Asisten Praktikum Praktikan

(Bagus Nur Wibisono) (Fahdilah Cahya .N.)

NIM. K4319023 NIM. K4320028