LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI

" Isolasi DNA Buah”

Dosen Pengampuh : Miftah Khairani, M.Pd

Disusun Sebagai Salah Satu Tugas Mandiri

Yang Diwajibkan Dalam Mengikuti Perkuliahan

Praktikum Bioteknologi

Nama : Lailatul Husna

NIM : 0310171014
Kelas : Tadris Biologi-1
Semester : VI (Enam)

PROGRAM STUDI TADRIS BIOLOGI

FAKULTAS ILMU TARBIYAH DAN KEGURUAN
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SUMATERA UTARA
TAHUN 2020
I. JUDUL PRAKTIKUM : Isolasi DNA Buah

II. TUJUAN :
a) Mengetahui cara atau metode mengisolasi DNA pada buah
b) Mengetahui keefektifan deterjen dan buah pada percobaan isolasi DNA
c) Mengetahui gen yang terdapat dalam makhluk hidup, guna mempermudah
dalam mempertahankan keanekaragaman hayati dan memperoleh bibit unggul
melalui persilangan

III. KAJIAN TEORI

Isolasi DNA adalah proses pengeluaran DNA dari tempatnya berada (ekstraksi atau lisis)
biasanya dilakukan dengan homogenasi dan penambahan buffer ekstraksi atau buffer lisis untuk
mencegah DNA rusak (Yuwono, 2008).
Pada sel eukariotik termasuk tanaman dan hewan bagian terbesar dari DNA berada pada
nukleus yaitu organel yang dipisahkan dari sitoplasma dengan membran. Nukleus terdiri dari 90
% keseluruhan DNA seluler. Sisa DNA adalah organel lain seperti mitokondria dan kloroplas.
Karena DNA terdapat pada nukleus, maka perlu adanya metode pelisisan sel sampai pemanenan
sel. Dimana metode tersebut merupakan bagian dari metode isolasi DNA (Elrod, 2007).
Pemisahan DNA dari materi seluler lainnya merupakan hal yang signifikan dan
mengharuskan penyallinan DNA menjadi RNA dan translasi RNA menjadi protein berlangsung
dalam kompartemen( ruang ) yang berbeda yaitu secara berturut-turut dalam nucleus dan
sitoplasma ( Elrod, 2007 ).
Terdapat organel-organel bermembran ganda di dalam sitoplasma, termasuk mitokondria
baik pada tumbuhan maupun hewan. Oleh karena itu perlu dilakukan isolasi DNA pada tanaman
dan hewan untuk mengetahui dan mempelajari DNA dari tanaman dan hewan tersebut. Sel
eukariotik memiliki DNA lebih banyak, lengkap dengan komponen-komponen lain. DNA
tanaman dan hewan tersimpan dalam nucleusyang terbungkus oleh membran. Isolasi DNA
merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi
dan presipitasi.Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat
molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian
bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan
menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada
bagian bawah. Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu
komponen dari campuran (Albert, 1994).
DNA pada makhluk hidup dapat diisolasi secara sederhana. Pengisolasian DNA secara
sederhana dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti
baik secara mekanik maupun secara kimiawi. Isolasi DNA merupakan suatu teknik yang
digunakan untuk memperoleh DNA murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam
jaringan. Pemecahan dinding sel secara mekanik dapat dilakukan dengan pemblenderan atau
penggerus menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan secara kimiawi dapat dilakukan dengan
pemberian detergen. Penambahan sabun cair dan garam dapur adalah untuk melisiskan membran
inti untuk mengeluarkan isi inti sel yang berisi DNA (Rachmat, 2012).
Isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain: preparasi ekstrak sel,
pemurnian DNA dari ekstrsk sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan
dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil
yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi
tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sample
buah, maka kadar air pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda-beda
pula. Semakin tinggi kadar air, maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit,
sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit (Kirsman, 2010).
Penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat menyebabkan rusaknya membrane sel,
melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen dengan protein dan lemak pada
membrane membentuk senyawa “lipid protein-deterjen kompleks”. Senyawa tersebut dapat
terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga
dengan deterjen, sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia (Kirsman, 2010).
Prinsip – prinsip dalam mengisolasi DNA (Tohib, 2012) :
1. Melisis sel secara fisik, dengan cara penggerusan.
2. Pemecahan dinding sel.
3. Pemecahan membran sel.
4. Pemisahan DNA dari bahan yang lain.
 Dalam isolasi DNA, bahan yang kita gunakan biasanya berupa jaringan tumbuhan atau
jaringan hewan, untuk itu langkah pertama yang harus kita lakukan adalah memecahkan jaringan
menjadi sel-sel yang mandiri. Proses dilakukan secara mekanik atau fisik dengan menumbuk
atau menggerus bahan yang akan kita gunakan dengan mortar atau blender. Kedua adalah
memecahkan dinding sel dan membran sel lapisan pembungkus DNA. struktur utama pembentuk
membran dan dinding sel adalah lemak, untuk itu kita gunakan deterjen dan garam dapur. Kedua
bahan ini digunakan untuk melubangi dan merusak sel sehingga isi inti sel (DNA) bisa keluar
(Tohib, 2012).
Tahap selanjutnya adalah pemisahan DNA dari bahan yang lain. Pemisahan dilakukan
dengan menggunakan ethanol/alkohol dingin berkonsentrasi 90-95%. Ethanol/Alkohol tidak
melarutkan DNA dan berat jenis alkohol yang lebih ringan dari air membuat DNA naik dan
melayang-layang di permukaan (Tohib, 2012).
CTAB atau Cetyl trimethylammonium bromide merupakan sejenis deterjen yang dapat
mendegradasi dinding sel, denaturasi protein, memisahkan karbohidrat, merusak membran sel
dan melarutkan DNA. Apabila dinding sel terdegradasi maka semua isi sel dapat keluar termasuk
DNA dan dilepaskan ke dalam buffer ekstraksi.Dalam proses isolasi DNA tanaman, penambahan
senyawa pereduksi seperti merchaptoetanol dapat mencegah proses oksidasi senyawa fenolik
sehingga menghambat aktivitas radikal bebas yang dihasilkan oleh oksidasi fenol terhadap asam
nukleat. Merchaptoetanol juga berfungsi untuk melindungi RNA dari senyawa quinon,
disulphide, peroksida, poliphenoksidase, dan protein. Proses pemansan pertama bertujuan untuk
melarutkan CTAB dan mercaptoetanol. Sedangkan pemanasan yang kedua bertujuan untuk
memdegradasi protein dan dinding sel (Tohib, 2012).
Klorofrom dan isoamilalkohol (CIAA) berfungsi untuk mengekstrak dan dan
mengendapkan komponen polisakarida di dalam buffer ektraksi yang mengkontaminasi larutan
DNA. Pemberian isopropanol dan etanol dilakukan agar terjadi dehidrasi DNA sehingga terjadi
presipitasi. Setelah pemberian etanol, pellet yang dipeoleh dikeringanginkan. Hal ini bertujuan
untuk mengeringkan pellet dari sisa-sisa buffer maupun etanol.Tahapan terakhir dari ektraksi ini
adalah penambahan buffer TE. Buffer TE tris electrophoresisberfungsi untuk melarutkan DNA
yangdihasilkan dan menjagaDNA agar tidak mudah rusak. Dalam buffer TE mengandung EDTA
atau Ethylene Diamine Tetra Acid yang berfungsi sebagai senyawa pengkelat yang mengikat ion
Magnesium, yaitu kofaktor yang diperlukan untuk altivtas berbagai enzim nuclease. Metode
ekstraksi DNA dengan CTAB akan menghasilkan pita DNA yang berukuran tebal dan dapat
memisahkan DNA dari polisakarida karena adanya perbedaan karakteristik kelarutan
(differensial of solubility). Disamping deperoleh fragmen DNA, dengan metode CTAB juga
akan diperoleh RNA dengan pita tipis yang terletak jauh berada di bawah pita DNA. Keberadaan
pita RNA tergantung bahan yang diekstraksi (Asris, 2010).

IV. ALAT DAN BAHAN

Alat Bahan
Beaker Gelas Buah Strawberry
Pengaduk Garam dapur (NaCl)
Pisau Aquades
Penyaring (Tissue/kapas) Etanol 96%
Spatula Sabun cair (Liquid the soap)
Tabung reaksi dan rak tabung reaksi
Gelas kimia
Pipet Tetes
Gelas Ukur
Corong saring

V. LANGKAH KERJA
1. Sabun Liquid dilarutkan ke dalam 60 ml aquades, diaduk perlahan selama 15 menit dan
jangan sampai berbusa.
2. Ambil 100 gr daging buah ditambah 100 ml aquades, dimaukan ke dalam plastik dan
hancurkan sampai daging buah lumat.
3. Lalu dicampurkan maing- masing 4 ml larutan sabun dengan 4 ml jus buah.
4. Menambahkan 1 spatula garam dapur kemudian diaduk selama 10 menit sampai
diperoleh campuran yang homogen
5. Lalu, saring campuran yang dihasilkan pada point sebelumnya sebanyak 2 kali
6. 6 ml hasil penyaringan pada point diatas dimasukan kedalam tabung reaksi dan
menambahkan 5 ml etanol 96% dingin
 7. Amati proses timbulnya DNA, meliputi waktu yang diperlukan,bentuk, warna, srta
banyak sedikitnya DNA yang terbentuk.

VI. HASIL PENGAMATAN

VII. PEMBAHASAN
Isolasi DNA merupakan tahap terpenting dalam analisis biologi molekuler. Teknik-teknik
isolasi DNA yang telah dikembangkan sangat mahal dan memerplukan waktu yang lama.
(Listanto,1996)
 DNA dapat diisolasi dari berbagai sel atau jaringan baik hewan, tumbuhan maupun
manusia. Isolasi DNA merupakan teknik awal dalam pemanfaatan DNA untuk berbagai
tujuan. Sebenarnya telah ada metode standar dalam mengisolasi DNA, misalnya teknik atau
metode yang dikemukakan oleh Sambrook (1989). Isolasi DNA dari sel maupun jaringan
eukariotik, misalnya dari jaringan tumbuhan maupun hewan dilakukan melalui tahap
penghancuran sel (lisis), penghilangan RNA dan protein serta pemurnian DNA. isolasi DNA ini
membutuhkan alat-alat canggih dan bahan-bahan yang cukup mahal, misalnya EDTA
(Etilendiamin tetra asetat ) yang berfungsi sebagai merusak sel dengan cara mengikat ion
Magnesium yang berfungsi mempertahankan integritas sel, SDS ( Sodium dodesil sulfat ) yang
dapat melarutkan membrane sel, mendenaturasi protein, enzim proteinase K yang mendegradasi
protein, RNAse mendegradasi RNA serta NaCl dan chloroform untuk memurnikan DNA.
Modifikasi teknik isolasi DNA telah dilakukan pada beberapa laboratorium,
misalnya pada takaran bahan-bahan yang digunakan atau penguraian/ penggantian jenis
bahan yang digunakan sesuai denga sel/ jaringan sumber DNA. Teknik/ metode isolasi
DNA yang sangat sederhana adalah metode Kitchen Preparation. Metode isolasi ini
memanfaatkan bahan- bahan yang biasanya digunakan ibu rumah tangga yaitu sabun cuci
(cair, bubuk atau krim) untuk menggantikan bahan utama yang berfungsi untuk melisis sel,
ekstrak buah nanas sebagai sumber enzim protease serta garam dapur.
Isolasi DNA metode Kitchen Preparation menggunakan detergen sebagai alternative
pengganti EDTA dan SDS, garam dapur sebagai pengganti NaCl analitik dan jus nanas
sebagai pengganti enzim protease. Sedangkan bahan yang akan dilihat DNA nya adalah
strowberi, hal ini dikarenakan strowberi mudah dihancurkan. Selain itu, strowberi
matang menghasilkan enzim pectinase dan selulase yang membantu memecah dinding sel.
Strowberi yang umum dibudidayakan adalah octoploid dengan delapan set genom. Hal ini
sangat baik untuk menunjukkan ekstraksi DNA karena memiliki delapan dari setiap jenis
kromosom yang juga dikatakan bahwa strowberi memiliki DNA yang berlimpah.
Perbedaan Isolasi DNA Kasar dengan Isolasi DNA Buffer Ekstraksi

Isolasi DNA dengan Buffer

Isolasi DNA kasar Ekstraksi

Memecahkan dinding sel dan membrane sel Memecahkan dinding sel dan
lapisan pembungkusan DNA dengan membrane sel dengan detergen
menggunakan detergen dan garam dapur. modifikasi CTAB dan
mercaptoetanol

Proses pemanasan pertama pertama

bertujuan untuk melarutkan CTAB
Tidak ada pemanasan pada proses ini. dan mercaptoetanol.

Kloroform dan isoamilalkohol

Tidak ada pengendapan komponen
polisakarida
Tidak ada penambahan buffer TE
Diambil larutan supernatan yang
bercampur dengan kontaminan lainnya.
Ekstraksi DNA dengan kitchen preparation
akan menghasilkan DNA kasar yang
menggumpal dan belum murni (masih banyak
Karena adanya perbedaan karakteristik
zat lain yang terkandung)
(CIAA) berfungsi untuk
mengekstrak dan mengendapkan
komponenpolisakarida di dalam
buffer ekstraksi yang
mengkontaminasilarutan DNA
Buffer TE berfungsi untuk
melarutkan DNA yang dihasilkan
dan menjaga DNA agar tidak mudah
rusak
Supernatant yang diambil
kontaminannya sangat sedikit
Ekstraksi DNA dengan CTAB akan
menghasilkan pita DNA yang
berukuran tebal dan dapa
tmemisahkan DNA dari polisakarida
kelarutan (differentsial of solubility)

TAHAPAN ISOLASI DNA DAN TUJUAN LANGKAH KERJA

Dalam praktikum isolasi DNA menggunakan metode kasar (Kitchen Preparation ), langkah
pertama yang kami lakukan adalah menyiapkan buah yang akan digunakan sebagai objek
pengamatan (strowberry) setelah buah disiapkan, langkah selanjutnya adalah mengambil masing-
masing 100 gr daging buah untuk dihaluskan menggunakan dan jangan lupa menambahkan
aquades sebagai pelarut, agar buah mudah untuk dihancurkan dan diambil ekstraknya.
Sementara itu, untuk mempersingkat waktu larutkan sabun cair (liquid) kedalam 60 ml
aquades, diaduk perlahan selama 15 menit dan usahakan jangan sampai berbusa, hal ini
bertujuan untuk mempermudah peroses pengamatan munculnya gelembung-gelembung DNA
sekaligus untuk melisis sel pada buah. Deterjen yang sudah dilarutkan tadi kemudian masing-
masing dicampur dalam 4 ml jus buah yang sudah diblender, sehingga ada 3 buah tabung
raksi yang diamati dengan detergen yang berbeda-beda dalam setiap tabungnya. Kemudian
Tambahkan 1 spatula garam dapur kedalam tiap- tiap tabung reaksi dan diaduk selama 10
menit samapai diperoleh campuran yang homogen.
Penambahan garam dapur bertujuan untuk memudahkan pemisahan benang-benang
DNA dari larutan dan untuk mengendapkan kotoran- kotorannya sehingga benang-
benang DNA tersebut akan mudah diamati. Langkah brikutnya adalah melakukan
penyaringan hasil campuran pada point sebelumnya sebanyak 2 kali untuk memisahkan
kotoran yang mengendap dengan sari buah. 6 ml hasil Penyringan pada tersebut kemudian
ditambahkan 5 ml etanol 96% dingin. Etanol ini berfungsi untuk menggumpalkan DNA. Dan
langkah akhir adalah melakukan pengamatan proses timbulnya benang- benang DNA, mulai
dari warna, bentuk dan jumlah DNA yang dihasilkan.
Ditinjau dari faktor penambahan garam ke dalam larutan detergen pada proses isolasi
DNA, garam digunakan untuk melarutkan DNA, karena ion Na+ yang dikandung oleh
garam mampu memblokir (membentuk ikatan) dengan kutub negatif fosfat DNA, yaitu
kutub yang bisa menyebabkan molekul-molekul saling tolak mnolak satu sama lain sehinggga
pada saat ion Na+ membentuk ikatan dengan kutub negatif fosfat DNA, DNA akan
terkumpul (Dollard, 1994, dalam Jamilah, 2005: 21). Dari pernyataan tersebut, nampak bahwa
selain digunakan untuk menghilangkan protein dan karbohidrat dan menjaga kesetabilan
pH lysing buffer, garam juga membantu proses pemekatan DNA.Konsentrasi DNA yang
terpresipitasi tergantung dari beberapa hal, antara lain: keenceran sumber DNA yang
digunakan dan suhu ethanol. Semakin encer filtrat, maka DNA yang terpresipitasi akan
semakin sedikit. Sementara semakin dingin ethanol, DNA yang terpresipitasi semakin pekat.
menambahkan bahwa semakin encer filtrat, maka DNA yang terpresipitasi akan
semakin sedikit.
VIII. KESIMPULAN
Isolasi DNA pada dasarnya dapat dilakukan dengan merusak dinding dan membrane sel
dan juga membrane inti. Perusakan ini dapat dilakukan dengan pemblenderan, penggerusan
atau yang lainnya. Namun dalam praktikum kali ini digunakan dengan cara pemblenderan.
DNA dapat diisolasikan dari sumber DNA berupa buah dengan penambahan larutan
sabun cair serta garam untuk membantu presipitasi DNA.

Hasil isolasi DNA sangat dipengaruhi oleh jenis buah. Lapisan filtrasi buah selalu
berada di bagian bawah karena filtrasi ini cenderung untuk mengendap. Lapisan alcohol
umumnya berada di bagian tengah karena masa jenisnya lebih ringan. Sedangkan lapisan DNA
umumnya berada di bagian atas karena DNA sangat ringan dan cenderung mengambang.
 DAFTAR PUSTAKA

Albert, B., 1994. Biologi Molekuler Sel Edisi Kedua. PT. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.

Asris., 2010. Definisi Isolasi DNA dan Manfaat Isolasi DNA.http://asris07. Student.ipb.ac.id.
Diakses pada tanggal 17 Maret 2014, pada pukul 23.00 WITA.

Elrod, S., 2007. Genetika Edisi Keempat. Erlangga. Jakarta.

Kirsman, 2010.Isolasi DNA Buah. http://kirsman83.weebl..com. Diakses pada tanggall 17 Maret

2014, pada pukul 23.00 WITA.

Rachmat, 2012. Isolasi DNA. http://rachmatyusuf.blogspot.com. Diakses pada tanggal 17 Maret

2014, pada pukul 23.00 WITA.

Suryo, 2004. Genetika Strata 1. Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta.

Tohib, 2012. Macam Metode Isolasi DNA. http://www.tohib.web.id. Diakses pada tanggal 17
Maret 2014, pada pukul 23.00 WITA.

Yuwono, T., 2008. Biologi Molekuler. Erlangga. Jakarta.