ISOLASI DNA BUAH

I. TUJUAN

Tujuan dari praktikum ini adalah:

• Mengetahui cara/metode yang benar untuk memisahkan (mengisolasi)

DNA dari buah-buahan berdaging lunak.

• Mengetahui pengaruh kandungan air yang terdapat pada suatu buah

terhadap hasil isolasi DNA.

I. DASAR TEORI

Pada dasarnya, sel mengandung dua asam nukleat yaitu DNA dan
RNA. DNA terletak pada kromosom, dijumpai di nukleus, mitokondria dan
kloroplas. Sedangkan RNA dijumpai di nukleus, sitoplasma, dan ribosom.

DNA ada dalam setiap sel makhluk hidup. DNA adalah materi
genetik yang diwarisi organisme dari orang tuanya. Suatu molekul DNA
sangat panjang dan umumnya terdiri atas ratusan bahkan ribuan gen. DNA
tersusun atas 3 komponen utama, yaitu suatu molekul organic yang disebut
basa nitrogen,suatu pentose (gula berkarbon lima), dan gugus fosfat.
(Campbell et al., 2002: 82-83). Zat ini disebut cetak biru kehidupan karena
memiliki peranan yang sangat penting, yaitu sebagai pembawa informasi
hereditas yang menentukan struktur protein dan proses metabolisme lain.
DNA bisa mengalami denaturasi dan renaturasi. Banyak hal yang
mempengaruhi proses tersebut, antara lain suhu yang tinggi, pH ekstrim,
kandungan elektrolit Na+ atau K+ dan komposisi basa C-G. (Elrod, 2007:
271)

Untuk mendapatkan DNA murni dari suatu sel dalam jaringan tubuh
makhluk hidup dapat dilakukan suatu teknik isolasi DNA. Isolasi DNA dapat
dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis maupun
bagian tanaman dapat menimbulkan masalah berbeda, antara lain karena
adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang
dapat menghambat pemurnian DNA dan juga mempengaruhi enzim-enzim
 seperti polimerase, ligase, endonuklease restriksi, atau enzim untuk
kegiatan molekuler lain yang dapat menyebabkan DNA tidak dapat
digunakan untuk aplikasi penelitian. (Carboni, 2007)

Isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain:

preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrsk sel dan presipitasi DNA.
Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi
pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang
berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida
dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika
isolasi DNA dilakukan dengan sampel buah, maka kadar air pada masing-
masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda-beda pula.
(Sweeney, 2008)

II. BAHAN DAN ALAT

III.1. Bahan

• Buah-buahan berdaging lunak (pisang,mangga,alpukat,

tomat,papaya, dll.)
• Garam dapur
• Detergen cair
• Aquadest
• Etanol absolute dingin

III.2. Alat

•
• Sumpit mie
• Kain kassa
• Gelas kimia 2
• Garpu
• Pengaduk / spatula
• Tabung reaksi dan rak tabung

I. CARA KERJA
 1. Membersihkan buah lalu mengupas buah.
2. Memotong buah menjadi bagian-bagian yang lebih kecil lalu melumatkan
(menggerus) buah tersebut di dalam gelas kimia menggunakan garpu.
3. Menambahkan 3 gram garam ke dalam gerusan buah tadi.
4. Menambahkan cairan deterjen ke dalam gelas kimia dengan
perbandingan 1 : 1
5. Menambahkan 50-100 mL aquades ke dalam gelas kimia, aduk perlahan
sampai homogeny, dan didiamkan selama 5-10 menit.
6. Menyaring gerusan buah tadi ke dalam gelas kimia yang baru dengan
menggunakan saringan halus
7. Menuangkan hasil saringan buah tadi ke dalam tabung reaksi sampai ±
¼ tabung.
8. Menambahkan etanol absolute dingin secara perlahan ke dalam tabung.
9. Menarik / mengambil massa putih yang terbentuk di dalam tabung
setelah diberi etanol absolute dingin tadi.
10. Mengamati hasil percobaan.

I. HASIL

Setelah diekstraksi dan didiamkan selama 15 menit, maka larutan pada

tabung reaksi terlihat membentuk tiga lapisan, yang dapat dilihat pada gambar
berikut :

Kumpulan DNA

Ethanol

Ekstrak buah

Terlihat adanya tiga lapisan pada tabung, lapisan paling bawah yang
berwarna kuning kehijauan ialah ekstrak buah yang masih tersisa setelah
disaring, lapisan di tengah ialah ethanol, sedangkan yang paling atas adalah
kumpulan benang-benang DNA berwarna putih. Pada gambar, belum terlihat
jelas warna putih pada massa DNA, karena massa putih tersebut baru terlihat
pada sekitar menit ke-30 setelah pencampuran ethanol absolute dingin.

II. ANALISIS

Pada praktikum kali ini, kita mempelajari cara yang tepat untuk melihat
DNA suatu organisme dengan mengisolasinya dari lokasi awalnya, yaitu di
dalam nukleus. Dalam proses isolasi DNA, umumnya terdapat tiga tahapan
yang harus dilakukan oleh seorang peneliti, yaitu :

1. Melisis/menghancurkan sel dengan cara mekanik maupun kimiawi, karena

untuk mengekstraksi DNA, dinding sel(jika ada), membran sel, dan
membran nukleus(pada eukariot) harus dihancurkan terlebih dahulu
sehingga DNA dapat keluar dan terlihat massanya.
2. Purifikasi(pemurnian larutan). Ketika sel telah lisis, seluruh komponen sel
akan bercampur satu sama lain. Sebagian besar proses manipulasi DNA
mengharuskan agar DNA terpisah dan bebas dari protein dan RNA. Di
laboratorium, peneliti juga akan memperhatikan untuk menginaktivasi enzim
internal sel yang dapat mendegradasi/ menghancurkan DNA. Mereka
kemungkinan menggunakan enzim pencerna protein, pemanasan,
penambahan bahan kimia tertentu atau larutan organik seperti fenol untuk
menonaktifkan enzim dan menghilangkan protein dari nukleus. Namun, kita
tidak melakukannya pada percobaan ini, karena kita tidak akan
menggunakan DNA yang diperoleh untuk tujuan eksperimen khusus.
3. Presipitasi, yaitu pemisahan DNA dari larutan, dengan cara
mencampurkannya dengan suatu bahan tidak dapat melarutkannya(DNA)
sehingga ia dapat memisah/terpresipitasi.( Anonim A, 2005)
Sekarang mari kita analisis satu-persatu tahapan percobaan yang telah
kita lakukan untuk mengetahui tujuan sebenarnya pelaksanaan seluruh tahapan
dalam proses isolasi DNA ini.
1. Pemilihan bahan. Bahan yang digunakan dalam praktikum ini ialah irisan
daging buah yang lunak, pemilihan buah dengan daging buah yang lunak
tak lain ialah untuk mempermudah proses pelumatan, karena dalam
praktikum ini kita tidak menggunakan blender sebagai alat untuk
 menghaluskan bahan dan hanya menggerusnya dengan bantuan garpu
saja.
2. Penghalusan/pelumatan buah. Sel tumbuhan memiliki sistem proteksi
berupa dinding sel dan membran sel Dinding sel tersusun dari
polisakarida. Untuk mengisolasi DNA, maka hal pertama yang dilakukan
adalah mendegradasi dinding sel yang merupakan struktur paling luar dari
sel tumbuhan dengan cara menggerus bagian buah yang dijadikan
sampel hingga lumat dan sehalus mungkin. Selain itu, penggerusan juga
bertujuan untuk memisahkan sel yang satu dengan lainnya sehingga
memberikan hasil yang lebih baik pada proses ekstraksi selanjutnya.
(Carboni, 2007)
3. Penambahan garam.. Untuk mengekstraksi DNA, maka DNA yang
terdapat di dalam nukleus perlu diuraikan dari protein-protein lain yang
mengikatnya. Penambahan garam, khususnya dengan konsentrasi tinggi
(> 1 M) dapat memisahkan nuclear protein (khususnya protein histon
sehingga gulungan DNA dapat terurai dan terlihat sebagai gumpalan
benang putih di permukaan larutan) dan juga memisahkan
karbohidrat(polisakarida) yang terkandung dalam esktrak. Penambahan
garam juga dapat membantu proses presipitasi DNA. Ion Na+ dari NaCl
akan memasuki membran sel secara difusi dan memasuki nukleus melalui
pori-pori nukleus. Ion Na+ pada garam dapat mengikat ion fosfat- pada
DNA, sehingga molekul-molekul yang memiliki muatan yang sama(negatif)
dan bersifat polar kini tidak lagi saling tolak menolak karena tidak lagi
bermuatan (netral) atau nonpolar. Proses tersebut mempermudah
pemekatan dan pengumpulan massa DNA pada proses presipitasi DNA.
(Weising et al., 2005: 90)
4. Penambahan larutan detergen. Kini DNA di dalam nukleus menjadi
terurai. Namun, untuk dapat keluar dari sel, membran sel harus
didegradasi terlebih dahulu. Membran sel tersusun atas fosfolipid, protein,
glikogen, dan kolesterol. Komponen-komponen membran sel tersebut ada
yang bersifat hidrofilik(glikoprotein, protein ekstrinsik, ‘kepala’ fosfolipid)
dan hidrofobik(kolesterol, sebagian protein intrinsik, ‘ekor’ fosfolipid)
(Kimball, 1983: 89). Oleh karena itulah diperlukan deterjen yang dapat
 mendegradasi membran sel melalui mekanisme khusus. Sisi hidrofilik
pada deterjen akan mengikat sisi protein yang bersifat hidrofilik dan sisi
hidrofobik detergen akan mengikat lipid dan sisi hidrofobik protein
sehingga membentuk senyawa “lipid protein-deterjen kompleks”. Peristiwa
inilah menyebabkan interaksi polar yang menyatukan membran sel,
sehingga membran sel pun terdegradasi/lisis. ( Ilustrasinya dapat dilihat
pada gambar 1.1 di bawah ini.

Hydrofob part

Hydrophylic part
(Intrinsic protein)

Gambar 1.1 sisi hidrofobik pada molekul detergen akan mengikat sisi hidrofobik protein(dan
komponen hidrofobik lain pada membran sel), demikian pula dengan sisi hidrofilik, sehingga
terbentuklah lipid-protein-detergen kompleks.
( Genetech Foundation for Biomedical Sciences, 2001)

5. Penambahan aquades dan pengadukan. Untuk mempercepat proses

penghancuran membran sel, maka setelah detergen dituang, perlu
dilakukan homogenisasi antara gerusan buah dan larutan detergen. Oleh
karena itu, campuran kedua keduanya lalu ditambahkan aquades dan
diaduk perlahan. Warna larutan pun berubah, yang tadinya kuning khas
warna mangga menjadi hijau kekuningan, tanda bahwalarutan telah
homogen.
6. Penyaringan larutan. Setelah dihomogenkan, maka larutan harus
disaring dengan mengunakan kasa. Fungsi proses filtrasi ini ialah untuk
mengumpulkan larutan yang kaya akan DNA dan untuk memisahkannya
dari sisa-sisa sel dan jaringan lainnya pada buah yang kemudian akan
dibuang. Untuk mempermudah proses penyaringan, maka larutan terlebih
dahulu didiamkan selama 5-10 menit agar molekul dengan massa
terbesar dapat mengendap di dasar.
7. Penambahan ethanol absolute dingin. Setelah disaring, larutan
tersebut dituang ke dalam tabung reaksi hingga ¼ tinggi tabung. Ethanol
absolute dingin sejumlah 5 mL dituangkan secara perlahan melewati
dinding sel agar larutan yang berbagai komponenenya mulai terpisah tidak
menyatu kembali. Setelah beberapa saat, maka akan segera terlihat
bahwa ethanol berada di atas lapisan atas, sementara filtrat berada di
dasar, hal ini terjadi karena ethanol memiliki densitas(kerapatan) yang
lebih kecil dibandingkan air. Kemudian, setelah diamati selama ± 15-30
menit, terlihat adanya kumpulan benang-benang putih yang melayang-
layang ke permukaan tabung reaksi. Kumpulan benang-benang putih
tersebut ialah DNA yang terpresipitasi dari filtrat. DNA dapat memisah dari
larutan campuran (ethanol+filtrat) karena DNA tidak larut dalam ethanol.
(Kalumuck, 2000). Berikut adalah penjelasan atas peristiwa presipitasi
DNA :
DNA bersifat polar, karena adanya muatan negatif dari gugus rangka
fosfatnya. Sifat polar ini, berdasarkan prinsip “like dissolve like” (sejenis
terlarut dalam sejenis), membuat DNA larut dalam air yang juga memiliki
sifat polar yang tinggi. Sifat polar air dibuktikan dengan tingginya nilai
konstanta dielektriknya, yaitu 80,1(pada suhu 20°C), yang berarti bahwa
kekuatan listrik antara dua muatan dalam larutan yang mengandung air
jauh berkurang jika dibandingkan dengan kekuatan yang terjadi di ruang
hampa atau di udara. Daya listrik pada ikatan ion pada Kristal NaCl akan
melemah saat terlarut dalam air, sehingga membiarkan ion Na+ yang
dilindungi oleh pelindung hidrasi (hydration shell)tersebar dalam air.
Mekanisme yang sama terjadi antara muatan negatif fosfat DNA.
Walaupun ion positif juga ada dalam larutan, kekuatan listrik yang relatif
lemah mencegahnya untuk membentuk ikatan ion yang stabil dengan
fosfat pada DNA dan memisahkannya dari larutan.
Ethanol memiliki tingkat polar yang lebih rendah daripada air,
konstanta dielektriknya adalah 24.3(pada suhu 25°C). Artinya,
penambahan ethanol pada larutan akan mengacaukan ‘penyaringan’
muatan oleh air. Jika ethanol dalam jumlah memadai ditambahkan , maka
daya tarik antara fosfat dan beberapa ion positif yang terlarut (contohnya
 ion Na+ dari NaCl yang telah ditambahkan sebelumnya) menjadi cukup
kuat untuk membentuk ikatan ion yang stabil dan mempresipitasikan/
memisahkan DNA. Hal ini umumnya terjadi jika jumlah ethanol telah
mencapai 64% dari volume larutan, dan mekanisme tersebut
mengharuskan adanya ion positif yang terlarut. Biasanya Na , NH4+, atau
+

Li+ memegang peranan ini, namun karena sebelumnya kita telah

menambahkan NaCl pada ekstrak buah, maka kemungkinan Na+ lah yang
memegang peranan terbesar dalam proses ini.(Anonim B, 2009)
Suhu ethanol yang dingin berperan dalam mempermudah proses
pemekatan DNA, semakin dingin suhu ethanol, maka DNA yang
mengumpul dan terpresipitasi akan semakin banyak. Walau DNA yang
terkumpul sangat banyak, kita tidak akan dapat melihat DNA dalam
susunan double helix, walaupun dengan mikroskop elektronik sekalipun,
karena susunan double helix DNA hanyalah gambaran mikrograf saja.

Pada percoban kali ini, diperlukan waktu 30 menit untuk dapat melihat
DNA. Ini disebabkan karena menggunakan buah mangga yang memiliki kadar
air yang relatif tinggi. Kadar air dalam buah mempengaruhi waktu yang
digunakan dalam presipitasi DNA. Semakin tinggi kadar air dalam buah,
semakin lama pula waktu yang diperlukan dalam mempresipitasi DNA. Ini
disebabkan karena buah yang memiliki kadar air yang banyak, memiliki sel-sel
yang lebih sedikit dibanding dengan kadar air yang dikandungnya. Buah yang
memiliki kandungan air yang lebih sedikit memiliki jumlah sel yang lebih banyak
sehingga DNA yang dihasilkan lebih banyak dan lebih cepat terlihat massanya
di permukaan tabung.

I. KESIMPULAN

Untuk mengisolasi DNA pada buah, diperlukan langkah-langkah

sistematis, yaitu menghancurkan dinding sel dengan penggerusan bahan,
melisiskan membran sel dan membran nukleus dengan pencampuran detergen,
serta presipitasi DNA dengan penambahan ethanol absolut dingin dan bantuan
ion Na+ dari NaCl (Kristal garam). DNA akan terlihat sebagai massa benang-
benang putih yang perlahan naik ke permukaan tabung. Kadar air pada buah
mempengaruhi waktu dan banyaknya DNA yang terpresipitasi. Semakin banyak
kadar air maka semakin lama waktu yang dibutuhkan, dan jumlah DNA yang
terpresipitasi semakin sedikit.