Isolasi Dna Sederhana

ISOLASI DNA SEDERHANA
Dosen pengampu: Luisa Diana Handoyo, M. Si.

Oleh:
1. Margaretha Bertie Riyani 101434011
2. Evi Lianawati 101434013
3. Treresia Winda S. 101434015
4. Yolanda Endear G. M. S. 101434019

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI
FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2012

A. Acara Praktikum
Judul praktikum : Isolasi DNA Sederhana
Hari, tanggal : Jumat, 14 September 2012
Waktu : Pukul 14.20 16.20 WIB
Tempat : Laboratorium Biologi Universitas Sanata Dharma

B. Tujuan Praktikum
Tujuan yang ingin dicapai dalam praktikum ini adalah mahasiswa mampu mempraktikkan
cara mengisolasi DNA secara sederhana.

C. Dasar Teori
DNA merupakan persenyawaan kimia yang paling penting pada makhluk hidup, yang
membawa keterangan genetik dari sel khususnya atau dari makhluk dalam keseluruhannya
dari satu generasi ke generasi berikutnya. Molekul DNA terdapat pada nukleus, mitokondria,
plastida dan sentriol. Molekul DNA pada nucleus memiliki bentuk sebagai benang lurus dan
tidak bercabang, sedangkan DNA yang terletak pada mitokondria dan plastida berbentuk
lingkaran (Suryo, 2012 : 59).
DNA pada makhluk hidup dapat diisolasi secara sederhana. Pengisolasian DNA
secara sederhana dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan
membran inti baik secara mekanik maupun secara kimiawi. Isolasi DNA merupakan suatu
teknik yang digunakan untuk memperoleh DNA murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari
suatu sel dalam jaringan.
Pemecahan dinding sel secara mekanik dapat dilakukan dengan pemblenderan atau
penggerus menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan secara kimiawi dapat dilakukan
dengan pemberian detergen. Penambahan sabun cair dan garam dapur adalah untuk
melisiskan membran inti untuk mengeluarkan isi inti sel yang berisi DNA.
Setelah menunggu beberapa saat terjadi presipitasi pada lapisan atas bukan lapisan
bawah, yang menunjukkan bahwa DNA tidak larut dalam etanol tetapi larut dalam air. Ketika
molekul DNA terlarut, mereka tersebar dalam larutan sehingga tidak terlihat. Ketika molekul
tersebut berpindah kedalam larutan yang bukan pelarut meraka akan berkumpul/
menggumpal sehingga dapat dilihat. Presipitat DNA terlihat seperti serabut-serabut putih
yang terkumpul diatas permukaan larutan karena masa jenis etanol lebih kecil dari pada masa
jenis air. Etanol yang digunakan harus benar-benar dingin dan berasal dari lemari pendingin,
hal ini bertujuan untuk menyempurnakan presipitasi. Apabila etanol yang digunakan kurang
dingin, maka mengakibatkan pembentukan presipitat kurang sempurna.

D. Alat, Bahan dan Cara Kerja
1. Alat

a. Gelas plastik
b. Beker glass
c. Pipet tetes
d. Saringan biasa
e. Kain penyaring
f. Kertas saring
g. Blender
h. Corong glass
i. Tabung reaksi
j. Rak tabung reaksi
k. Spatula
l. Gelas ukur
m. Timbangan
n. Stopwatch
o. Pisau

2. Bahan
a. Buah-buahan (melon, semangka, tomat, nanas, jeruk, dan strawberry)
b. Detergen bubuk
c. Akuades
d. Garam dapur (NaCl)
e. Etanol absolut dingin

3. Cara Kerja
a. Buah dibersihkan dari kulitnya dan ditimbang sebanyak 250 gram.
b. Kemudian buah tersebut dimasukkan ke dalam blender dan ditambah 250 ml akuades,
diblender selama 1 menit.
c. Jus buah yang telah diblender disaring sebanyak tiga kali. Penyaringan pertama
menggunakan penyaring biasa, penyaringan kedua menggunakan kain penyaring, dan
penyaringan ketiga menggunakan kertas saring.
d. Air hasil saringan (alikot) dimasukkan ke dalam beker glass.
e. Larutan garam dan detergen dibuat dengan mencampurkan 1 (satu) sendok detergen
ditambah 2 (dua) spatula NaCl lalu ditambah dengan 56 ml akuades, diaduk selama 15 menit
hingga larut. Pengadukan dilakukan secara perlahan agar tidak ada buih yang dihasilkan dari
pengadukan.
f. Alikot yang sudah siap dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 2 ml, kemudian
ditambah dengan larutan detergen-garam. Lalu diaduk secara perlahan agar tidak
menghasilkan buih selama sekitar 3 menit.
g. Setelah 3 menit, alikot yang telah tercampur dengan larutan detergen-garam ditambahkan
dengan etanol absolut dingin tetes demi tetes sebanyak 6 ml melalui dinding tabung reaksi.
h. Waktu pembentukan dan ketebalan benang-benang DNA dicatat pada masing-masing jus
buah.

E. Hasil Percobaan
Hasil yang diperoleh dari percobaan dapat dilihat pada tabel di bawah ini:
Tabel 1. Hasil penghitungan waktu dan pengukuran ketebalan benang-benang DNA pada beberapa
jenis buah yang terbentuk.
No. Nama Buah Waktu (detik) Ketebalan (cm)
1. Melon 10,76 0.3
2. Nanas 9 0.5
3. Jeruk 7 4.4 dengan gumpalan di bagian atas
4. Strawberry 77 1.6
5. Tomat 9 0.5
6. Semangka 10 0.3
Dimana waktu merupakan waktu pembentukan benang-benang DNA yang dihitung sejak
pertama kali diteteskan etanol absolut dingin.

F. Pembahasan
Berdasarkan hasil percobaan pada tabel 1, diperoleh hasil bahwa setiap buah memiliki
waktu yang berbeda-beda dalam pembentukan molekul DNA dan ketebalan DNA yang
terbentuk. Saat penetesan etanol ke tabung reaksi yang berisi alikot melon, dibutuhkan waktu
10,76 detik untuk terbentuknya benang-benang DNA. Sementara pada alikot nanas dan tomat
membutuhkan waktu 9 detik untuk pembentukan benang DNA. Waktu untuk pembentukan
benang DNA yang tersingkat terjadi pada buah jeruk, yaitu hanya membutuhkan waktu
selama 7 detik. Buah semangka membutuhkan waktu 10 detik untuk membentuk benang-
benang DNA. Dan buah strawberry memiliki waktu yang paling lama untuk membentuk
benang-benang DNA, yaitu selama 77 detik.
Ketebalan DNA yang terbentuk pun bervariasi, mulai dari yang tipis sampai yang
tebal. Lapisan DNA yang paling tebal berada pada alikot buah jeruk dengan ketebalan 4,4
cm, tetai terdapat gumpalan berwarna kuning di bagian atas lapisan benang DNA. Sementara
pada alikot buah lain tidak terjadi gumpalan seperti pada alikot buah jeruk. Ketebalan benang
DNA pada buah semangka dan melon sama, yaitu hanya 0,3 cm. Sementara pada buah nanas
dan tomat ketebalan benang DNA memiliki angka yang lebih besar, yaitu 0,5 cm. Dan pada
buah semangka diperoleh ketebalan benang DNA sepanjang 1,6 cm.
Buah dengan kadar air tinggi akan menghasilkan isolat yang berbeda jika
dibandingkan dengan buah berkadar air rendah (kaya serat). Semakin tinggi kadar air maka
sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi
juga akan sedikit. Suatu sumber menyatakan bahwa dalam proses pembuatan sumber DNA
untuk isolasi DNA hendaknya jangan terlalu encer karena semakin encer sumber DNA, DNA
yang terpresipitasi akan semakin sedikit. Karena sel yang lisis di dalam air tentunya lebih
sedikit jika dibandingkan dengan sumber DNA yang lebih kental (Anonim, 2005). Namun,
masalah pengaruh keenceran terhadap hasil isolasi DNA dapat diatasi dengan pengurangan
jumlah Akuades yang digunakan sehingga walaupun sumber DNA yang digunakan adalah
buah dengan kadar air tinggi, tetap dapat diperoleh ekstrak yang cukup kental.
Dengan adanya garam (kation kovalen seperti Na+) dan pada suhu dibawah 20 C
atau kurang, ethanol absolut akan mempresipitasikan asam nukleat polimerik dengan baik.
Pemekatan ini dilakukan dengan penambahan ethanol pada lapisan atas sampel sehingga
terjadi pesipitasi DNA pada perbatasan kedua larutan. Dalam proses ini ion Na+ akan
memblokir (membentuk ikatan) dengan kutub negatif ion fosfat DNA. Kutub tersebut bisa
menyebabkan molekul-molekul saling tolak menolak satu sama lain sehingga pada saat ion
Na+ membentuk ikatan dengan kutub negatif fosfat DNA, DNA akan berkumpul. garam juga
berperan penting, yaitu untuk menghilangkan protein dan karbohidrat karena garam dapat
menyebabkan keduanya terpresipitasi, dan bersama-sama dengan detergent,

G. Kesimpulan
1. DNA dapat diisolasikan dari sumber DNA berupa buah dengan penambahan larutan
deterjen dan etanol serta garam untuk membantu presipitasi DNA.
2. Hasil isolasi DNA sangat dipengaruhi oleh jenis buah. Terbukti dari hasil pengamatan, pada
masing-masing buah didapatkan hasil yang berbeda.
3. Semakin encer alikot, DNA yang terpresipitasi akan semakin sedikit. Karena sel yang lisis
di dalam air tentunya lebih sedikit jika dibandingkan dengan sumber DNA yang lebih kental.

Daftar Pustaka

http://zuzoqu.wordpress.com/tag/genetika/, diakses pada 17 September 2012
http://mubtadiahc.blogspot.com/2012/04/isolasidna-dengan-metode-kitchen.html, diakses
pada 16 September 2012

laporan isolasi DNA buah
A. Tujuan
Adapun tujuan dari praktikum ini adalah untuk mengetahui DNA buah berdaging
lunak.
B. Dasar Teori
Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya
ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan
campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul
besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas
tabung. Deoxyribo nucleic acid (DNA) merupakan senyawa kimia yang paling penting dalam
makhluk hidup. DNA merupakan senyawa yang mengandung informasi genetik makhluk
hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya (Suryo, 2004).
Keseluruhan DNA dalam suatu sel akan membentuk genom. Genom meliputi bagian
gen yang fungsional maupun non-fungsional dalam sel organisme. DNA genom meliputi gen
dan intergen. Penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat menyebabkan rusaknya
membrane sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen dengan protein
dan lemak pada membrane membentuk senyawa lipid protein-deterjen kompleks. Senyawa
tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik,
demikian juga dengan deterjen, sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia (Chambell,
2002).
Ketika mendengar kata DNA, seolah kita berhadapan dengan sesuatu yang begitu
abstrak dan sangat kecil. Apalagi jika berbicara tentang isolasi DNA, sering terpikirkan
sebuah proses yang sangat rumit dengan alat-alat yang sangat canggih. Padahal tidak
selamanya isolasi DNA demikian, beberapa teknik isolasi DNA sederhana terbukti efektif
untuk mengisolasi DNA, bahkan selain prosedurnya yang sederhana, bahan-bahan yang
dipakaipun mudah didapatkan dari lingkungan sekitar.DNA (Deoxyribose Nucleic Acid)
adalah master molecul (molekul utama) yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan
untuk proses metabolisme dalam setiap organisme. DNA ini tersusun atas 3 komponen utama
yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida.
Molekul DNA ini terikat membentuk kromosom, dan ditemukan di nukleus, mitokondria dan
kloroplas. (Arhan, 2009).
Penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat dilakukan karena deterjen dapat
menyebabkan rusaknya membran sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik
deterjen dengan protein dan lemak pada membran membentuk senyawa lipid protein-
deterjen kompleks. Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki
ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga dengan deterjen, sehingga dapat membentuk
suatu ikatan kimia (Istianti, 1999).
menyatakan bahwa isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara
lain: preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrsk sel dan presipitasi DNA. Meskipun
isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian
tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol
dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika
isolasi DNA dilakukan dengan sampel buah, maka kadar air pada masing-masing buah
berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda-beda pula. Semakin tinggi kadar air, maka sel
yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga
akan sedikit (Achmad, 2010).
C. Metode Praktikum
1. Waktu dan Tempat
Adapun waktu dan tempat pelaksanaan praktikum ini adalah :
Hari/Tanggal : Senin , 18 November 2013
Pukul : 08.00 10.00 WITA
Tempat : Laboratorium Genetika Lantai II
Fakultas Sains dan Teknologi
Universitas Islam Negeri Alauddin Makassar
Samata-Gowa.

2. Alat dan Bahan
a. Alat
Adapun alat yang digunakan pada praktikum ini adalah gelas kimia, lumping, mortal,
corong, gelas ukur, tabung reaksi, pisau dan batang pengaduk.
b. Bahan
Adapun bahan yang digunakan adalah buah pisang, buah semangka, buah mangga, etanol
absolut, deterjen, NaCl, kapas dan kain saring.
3. Cara Kerja
Adapun cara kerja yang dilakukan pada praktikum ini adalah sebagai berikut :
a. Mengupas buah dan memotong menjadi 4 bagian lalu melumat buah menggunakan mortal
dan lumpang.
b. Menambahkan 10 gram NaCl kedalam gelas kimia
c. Menambahkan cairan deterjen sebanyak 10 ml
d. Menambahkan 50 ml aquadest kedalam gelas kimia tadi dan mengaduk secara perlahan
hingga homogen
e. Menyaring buah tadi kedalam gelas kimia baru
f. Menuang buah yang telah disaring kedalam tabung reaksi sekitar seperempat tabung reaksi.
g. Menambhakan etanol absolut dingin dengan cara mengalirkan melalui dinding tabung
reaksi secara perlahan
h. Mengamati perubahan yang terjadi.

D. Hasil dan Pembahasan
1. Hasil Pengamatan
Adapun hasil yang diperoleh dari pengamatan yang dilakukan adalah :
a. Buah Pisang
Keterangan:
1. Ekstrak DNA
2. Etanol
3. Sari buah

b. Buah Mangga
Keterangan :
1. Ekstrak DNA
2. Etanol
3. Sari buah

c. Buah Semangka
Keterangan :
1. Ekstrak DNA
2. Etanol
3. Sari buah

2. Pembahasan
Isolasi DNA pada dasarnya dapat dilakukan dengan menggunakan berbagai macam
sumber DNA yang dapat diperoleh dari hewan maupun tumbuhan. Upaya untuk
mengeluarkan DNA dari sel dilakukan dengan merusak dinding dan membran sel dan juga
membran inti. Cara yang digunakan untuk merusak membran-membran tersebut sangat
beraneka ragam, misalnya dengan pemblenderan atau penggerusan dengan mortal dan pistil.
Selain perusakan secara fisik, membran dan dinding sel dapat pula dirusak dengan
menggunakan senyawa-senyawa kimia. Perusakan dinding sel dan membran sel pada
praktikum isolasi DNA kali ini dilakukan dengan cara penggerusan. DNA yang didapatkan
dalam pengamatan kali ini adalah DNA yang berupa benang-benang halus.
Pengisolasian DNA secara sederhana dapat dilakukan dengan memecahkan dinding
sel, membran plasma dan membran inti baik secara mekanik maupun secara kimiawi. Isolasi
DNA merupakan suatu teknik yang digunakan untuk memperoleh DNA murni, yaitu tanpa
protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan. Pemecahan dinding sel secara mekanik dapat
dilakukan dengan pemblenderan atau penggerus menggunakan mortal dan pastle. Sedangkan
secara kimiawi dapat dilakukan dengan pemberian detergen, penambahan sabun cair dan
garam dapur adalah untuk melisiskan membran inti untuk mengeluarkan isi inti sel yang
berisi DNA.
Berdasarkan pengamatan yang dilakukan dimana bahan-bahan yang digunakan
dihancurkan. Proses penghancuran dilakukan untuk merusak membran sel, dinding sel dan
membran inti sehingga DNA bisa keluar dari sel dan masuk ke larutan. Selanjutnya
dimasukkan NaCl (garam dapur) sebanyak 3 gram ke dalam buah tersebut yang telah
dihancurkan sebelumnya. NaCl yang diberikan berfungsi sebagai bahan penetral pada gula
fosfat DNA, menyebabkan protein dan karbohidrat terpresipitasi ke dalam larutan yang
kemudian tersaring pada proses penyaringan, serta berperan sebagai lysing buffer, yakni
menjaga pH larutan agar tetap konstan, sehingga diharapkan tidak terjadi denaturasi DNA.
Kemudian ditambahkan deterjen cair, proses pemberian deterjen cair ini disebut dengan
proses lisis yaitu proses untuk meluruhkan membran sel pada nukleus. Tujuan diberikannya
deterjen cair yaitu untuk merusak membran sel dan membran inti sehingga DNA yang
diinginkan dapat dikeluarkan dari dalam sel, untuk mengurangi kontaminan dan
mengurangi browning.
Setelah dilakukan proses penghancuran dan lisis, maka larutannya ditambahkan air
dan dihomogenkan serta didiamkan. Pada saat pengadukan harus pelan-pelan karena deterjen
mudah sekali berbusa. Busa yang ditimbulkan oleh deterjen akan mengganggu pengamatan,
karena DNA yang berhasil diisolasi nampak tipis, dan dapat dipastikan lapisan DNA tersebut
akan tertutupi jika terdapat banyak buih. Setelah itu larutan tersebut disaring ke gelas kimia
baru, adanya proses penyaringan dilakukan agar komponen sel selain DNA tidak
mengkontaminasi DNA yang hendak diisolasi. Lalu dituang ke tabung reaksi dan diberikan
larutan etanol dingin dengan tujuan untuk memperitifikasi DNA. Ethanol yang dingin akan
mempercepat proses tersebut.
E. Kesimpulan
Adapun kesimpulan dari praktikum ini yaitu isolasi DNA merupakan metode untuk
memisahkan DNA dari sel, baik dari inti, mitokondria maupun kloroplas.Isolasi DNA pada
dasarnya dapat dilakukan dengan merusak dinding dan membran sel dan juga membran inti.
Perusakan ini dapat dilakukan dengan pemblenderan, penggerusan atau yang lainnya. DNA
dapat diisolasikan dari sumber DNA berupa buah dengan penambahan larutan deterjen,
etanol serta garam untuk membantu presipitasi DNA.
.

Daftar Pustaka
ArhanIsolasi DNA, Blog Arhan, http://endikdenibiotransmitther.blogspot.com.
(20 November 2013).
Achmad, Wendy. Isolasi DNA. Bandung 2010.
Istanti, Biologi Sel. Malang: jurusan Biologi FMIPA UM. 1999.
Neil, Campbell. Biologi. Jakarta : Erlangga. 2002.

Suryo. Genetika Strata 1. Yogyakarta : UGM Press. 2004.
Diposkan oleh Ibnul Buqhoriis di 21.01
Kirimkan Ini lewat EmailBlogThis!Berbagi ke TwitterBerbagi ke FacebookBagikan ke
Pinterest

GENETIKA
ISOLASI DNA
OLEH
KELOMPOK V
NAMA : LIA ALLO LAYUK
STAMBUK : 10270013
PRODI : BIOLOGI
KELAS : A
ASISTEN :

FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN
UNIVERSITAS VETERAN REPUBLIK INDONESIA
MAKASSAR
2012/2013

BAB I
PENDAHULUAN

A. LATAR BELAKANG

Ketika mendengar kata DNA, seolah kita berhadapan dengan sesuatu yang begitu
abstrak dan sangat kecil. Apalagi jika berbicara tentang isolasi DNA, sering terpikirkan
sebuah proses yang sangat rumit dengan alat-alat yang sangat canggih.Padahal tidak
selamanya isolasi DNA demikian, beberapa teknik isolasi DNA sederhana terbukti efektif
untuk mengisolasi DNA, bahkan selain prosedurnya yang sederhana, bahan-bahan yang
dipakaipun mudah didapatkan dari lingkungan sekitar. Sangat cocok untuk praktikum
pengenalan DNA pada siswa MTs/SMP juga MA/SMA. Berikut ini pembahasan tentang
isolasi DNA secara sedasar teori. DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) adalah master molecul
(molekul utama) yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses
metabolisme dalam setiap organisme (Jamilah, 2005). DNA ini tersusun atas 3 komponen
utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen dan fosfat yang tergabung membentuk
nukleotida (Istanti, 1999).
DNA dapat mengalami denaturasi dan renaturasi. Selain itu DNA juga bisa diisolasi.
Zubaidah (2004) dalam Jamilah (2005) menyatakan bahwa isolasi DNA dapat dilakukan
melauli tahapan-tahapan antara lain: preparasi esktrak sel, pemurnian DNA dari ekstrak sel
dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan
tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini
karena adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat
menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sampel buah,

B. TUJUAN
Untuk mengetahui cara/metode mengisolasi DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) jaringan
tumbuhan dengan metode sederhana.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

DNA pada makhluk hidup dapat diisolasi secara sederhana. Pengisolasian DNA secara
sederhana dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran
inti baik secara mekanik maupun secara kimiawi. Isolasi DNA merupakan suatu teknik yang
digunakan untuk memperoleh DNA murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam
jaringan.
Pemecahan dinding sel secara mekanik dapat dilakukan dengan pemblenderan atau
DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) adalah master molecul (molekul utama) yang
mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap
organisme (Jamilah, 2005). DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula
deoksiribosa, basa nitrogen dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida (Istanti, 1999).
kloroplas. DNA yang menyusun kromosom ini merupakan nukleotida rangkap yang tersusun
heliks ganda (double helix), dimana basa nitrogen dan kedua benang polinukleotida saling
berpasangan dalam pasangan yang tetap melalui ikatan hidrogen dan antara nukleotida yang
satu dengan nukleotida yang lain dihubungkan dengan ikatan fosfat. DNA terdapat di dalam
setiap sel makhluk hidup dan disebut sebagai cetak biru kehidupan karena molekul ini
berperan penting sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan struktur protein dan
proses metabolisme lain (Jamilah, 2005).
menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sampel buah, maka kadar
air yang pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda pula. Buah
dengan kadar air tinggi akan menghasilkan isolat yang berbeda jika dibandingkan dengan
buah berkadar air rendah. Semakin tinggi kadar air maka sel yang terlarut di dalam ekstrak
akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit.
Proses isolasi DNA diawali dengan proses ekstraksi DNA. Hal ini bertujuan untuk
memisahkan DNA dengan partikel lain yang tidak diinginkan. Proses ini harus dilakukan
dengan hati-hati, sehingga tidak menyebabkan kerusakan pada DNA. Untuk mengeluarkan
DNA dari sel, dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan
membran inti baik dengan cara mekanik maupun secara kimiawi. Cara mekanik bisa
dilakukan dengan pemblenderan atau penggerus menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan
secara kimiawi dapat dengan pemberian yang dapat merusak membran sel dan membran inti,
salah satunya adalah deterjen.
menyebabkan rusaknya mebran sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik
suatu ikatan kimia (Machmud, 2006).

BAB III
METODOLOGI PRAKTIKUM

A. Waktu & tempat :
Waktu : Senin, 27 mei 2013
Pukul : 09.00 11.30 WITA
Tempat : Laboratorium Biologi Universitas Veteran Republik Indonesia

B. Alat & bahan :

Alat

Bahan

- Tabung Reaksi
- Pisau
- Pipet 5 ml
- Garpu
- Gelas beaker 250 ml
- Mortal
- Saringan / tapisan
- Corong
- Gelas ukur
- Gelas kenlia 100 ml tambah analik
- Batang Pengaduk

- Es serut
- NaCl 3 gram
- Detergen
- Etanol 95 100 % dingin( dari 20C
)
- Tumbuhan ( buah pisang )

C. Cara kerja

1. Pilihlah buah yang masak dan potong dengan pisau, keluarkan isinya dengan
menggunakan garpu dan simpan dalam gelas beaker 250 ml. Tumbuk sampai halus dengan
menggunakan mortal.
2. Tambahkan 3 gram NaCl yang telah dilarutkan, kemudian tambahkan 10 ml detergen,
buat sampai volume 100 ml dengan menambahkan air.
3. Campurkan dan aduk dengan garpu sampai benar benar tercampur kemudian
disaring dan disimpan cairan yang telah di saring tersebut.
4. Biarkan beberapa menit kemudian di isi sebanyak 6 ml cairan tersebut kedalam
tabung reaksi
5. Tambahkan 9 ml etanol dingin pada bagian bawah tabung reaksi dan tunggu beberapa
menit untuk presipitasi DNA sampai terdapat dua bagian yang terpisah etanol dan bagian
yang berwarna putih.
6. Bagian putih dipindahkan ke tabung reaksi yang lainnya, bagian itu merupakan DNA
hasil ekstraksi.

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

A. HASIL
Gambar hasil pengamatan
A B keterangan
:

a.2

b.2
a.1 c.2
a.1
b.1

a.2
b.2
c.2

d.2
busa
ekstrak pisang dan
larutan NaCl &
sabun sunlight
larutan etanol & es
busa
hasil isolasi DNA
berupa bentuk DNA
ekstrak pisang dan
larutan NaCl &
sabun sunlight

b.1
d.2

a. Sebelum dicamur larutan b. Setelah dicampur etanol
Etanol dan es dan es

Tabel hasil pengamatan isolasi DNA pada buah pisang
No. Buah Perlakuan
Hasil Pengamatan
Warna Bentuk Waktu Jumlah
1. pisang
Sabun
sunlight
Keruh ke-orangean Benang yang
menggumpal
65 s +++++

B. PEMBAHASAN

Praktikum ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh buah dan deterjen
terhadap kualitas DNA yang dihasilkan dalam proses isolasi. Buah yang digunakan dalam
proses isolasi DNA ini adalah buah pisang. Sedangkan jenis deterjen yang dipakai adalah
deterjen sunlight. Hal yang pertama kami lakukan yaitu, menyiapkan buah yang akan di
tumbuk.
Isolasi DNA pada dasarnya dapat dilakukan dengan menggunakan berbagai macam
sumber DNA yang dapat diperoleh dari hewan maupun tumbuhan. Upaya untuk
mengeluarkan DNA dari sel dilakukan dengan merusak dinding dan membrane sel dan juga
membran inti. Cara yang digunakan untuk merusak membran-membran tersebut sangat
beraneka ragam, misalnya dengan pemblenderan atau penggerusan dengan mortal dan pistil.
Selain perusakan secara fisik, membrane dan dinding sel dapat pula dirusak dengan
menggunakan senyawa-senyawa kimia. Perusakan dinding sel dan membrane sel pada
praktikum isolasi DNA kali ini dilakukan dengan cara penggerusan. DNA yang didapatkan
dalam pengamatan kali ini adalah DNA yang berupa benang-benang halus.
Apabila dilihat dari sumber DNA yang digunakan untuk pengisolasian ini, macam
buah yang digunakan menunjukkan perbedaan yang nyata. Masing-masing buah untuk
sumber DNA menghasilkan DNA yang berbentuk benang-benang halus berwarna sesuai
dengan warna asal buah tersebut. Kelima macam buah yang digunakan dalam proses
pengisolasian DNA kali ini adalah jenis buah yang memiliki kadar air yang tinggi. Tidak ada
perbedaan yang ditunjukkan untuk perlakuan variasi jenis buah ini. Suatu sumber
menyatakan bahwa dalam proses pembuatan sumber DNA untuk isolasi DNA hendaknya
jangan terlalu encer karena semakin encer sumber DNA, DNA yang terpresipitasi akan
semakin sedikit. Karena sel yang lisis di dalam air tentunya lebih sedikit jika dibandingkan
dengan sumber DNA yang lebih kental (Anonim, 2005). Namun, masalah pengaruh
keenceran terhadap hasil isolasi DNA dapat diatasi dengan pengurangan jumlah air yang
digunakan sehingga walaupun sumber DNA yang digunakan adalah buah dengan kadar air
tinggi, tetap dapat diperoleh ekstrak yang cukup kental.
Membran sel pada setiap organisme dapat mengalami kerusakan yang disebabkan
oleh pengaruh senyawa-senyawa kimia. Senyawa kimia yang mampu merusak membrane
ataupun dinding sel antara lain lisozim yang mampu mempengaruhi kerja senyawa polimerik
sehingga kekakuan sel tidak lagi dapat terjaga. Selain itu, ada pula senyawa EDTA
(etilendiamintetraasetat) yang berfungsi untuk menghilangkan ion Mg
2+
yang penting untuk
mempertahankan struktur selubung sel serta menghambat enzim yang dapat merusak DNA.
Dalam proses isolasi DNA, deterjen berfungsi menggantikan senyawa-senyawa kimia
tersebut di atas. Deterjen mengandung sodium dodesil sulfat (SDS) yang dapat menyebabkan
hilangnya molekul lipid pada membran sel sehingga struktur membrane akan rusak dan
melisiskan isi sel.
Pada Pengisolasian DNA menggunakan garam dapur dengan tujuan untuk
memekatkan DNA. Hal ini dapat terjadi karena ion Na
+
yang dikandung oleh garam mampu
membentuk ikatan dengan kutub negative pada ikatan fosfat DNA. Saat ion Na
+
garam
berikatan dengan fosfat, pada saat itulah DNA akan berkumpul. Sedangkan penambahan
alcohol pada permukaan larutan betujuan untuk melakukan presipitasi sehingga DNA yang
telah terkumpul tadi mampu memisah dari larutan dan terbentuklah lapisan-lapisan yang
dapat diidentifikasi unsur penyusunnya.
Paraf asistensi

( )

BAB V
PENUTUP

A. Kesimpulan
Berdasarkan hasil pengamatan dan pembahasan, maka dapat diambil kesimpulan,
bahwa :
1. Cara pengisolasian DNA dilakukan dengan cara mekanik dan kimiawi. Cara mekanik
dengan alat-alat yang berfungsi untuk menghancurkan membran sel. Sedangkan secara
kimiawi dengan penambahan-penambahan reagen, yaitu detergent, NaCl, danalkohol dingin
96%.
2.Tahap-tahap dalam isolasi DNA ada tiga. Tahap pertama dari isolasi DNA adalah
penghancuran dinding sel dengan cara memblender bahan, Tahap kedua isolasi DNA adalah
melisiskan sel dengan menambahkan detergent dan garam ke dalam campuran. Pemberian
detergent berfungsi untuk membuka atau memecah membran sel (baik membran sitoplasma
maupun membran nukleus. Tahap ketiga adalah pemurnian DNA. Cara ini dilakukan dengan
manambahkan alkohol dingin 96%. Alkohol berfungsi untuk memisahkan DNA dengna
molekul-molekul lain,seperti protein.

B. Saran

Dalam melakukan praktikum.Sebaiknya praktikan serius dalam melakukan
praktikum.Sebaiknya asisten mendampingi masing-masing kelompok saat praktikum.

DAFTAR PUSTAKA

Arhan. 2009. Laporan Pratikum isolasi DNA.
http://endikdenibiotransmitther.blogspot.com/2009/01/praktikum-isolasi-dna-buah.html)
http://endikdenibiotransmitther.blogspot.com/2009/01/praktikum-isolasi-dna-buah-pisang-
dan.html
Istanti, Annie. 1999. Biologi Sel. Malang: jurusan Biologi FMIPA UM.
Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Deterjen, Penambahan Garam dan Ekstrak Nanas
(Ananas Comusus) terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah sebagai Topik
Praktikum Mata Kuliah Genetika. Skripsi tidak diterbitkan. Malang: Program Sarjana
Biologi.

Ketika mendengar kata DNA, seolah kita berhadapan dengan sesuatu yang begitu abstrak dan
sangat kecil. Apalagi jika berbicara tentang isolasi DNA, sering terpikirkan sebuah proses
yang sangat rumit dengan alat-alat yang sangat canggih.Padahal tidak selamanya isolasi DNA
demikian, beberapa teknik isolasi DNA sederhana terbukti efektif untuk mengisolasi DNA,
bahkan selain prosedurnya yang sederhana, bahan-bahan yang dipakaipun mudah didapatkan
dari lingkungan sekitar. Sangat cocok untuk praktikum pengenalan DNA pada siswa
MTs/SMP juga MA/SMA. Berikut ini pembahasan tentang isolasi DNA secara sederhana

DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) adalah master molecul (molekul utama) yang mengkode
semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap organisme
(Jamilah, 2005).
DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen dan fosfat
yang tergabung membentuk nukleotida (Istanti, 1999). Molekul DNA ini terikat membentuk
kromosom, dan ditemukan di nukleus, mitokondria dan kloroplas. DNA yang menyusun
kromosom ini merupakan nukleotida rangkap yang tersusun heliks ganda (double helix),
dimana basa nitrogen dan kedua benang polinukleotida saling berpasangan dalam pasangan
yang tetap melalui ikatan hidrogen dan antara nukleotida yang satu dengan nukleotida yang
lain dihubungkan dengan ikatan fosfat. DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup dan
disebut sebagai cetak biru kehidupan karena molekul ini berperan penting sebagai
pembawa informasi hereditas yang menentukan struktur protein dan proses metabolisme lain
(Jamilah, 2005).
Proses isolasi DNA diawali dengan proses ekstraksi DNA. Hal ini bertujuan untuk
memisahkan DNA dengan partikel lain yang tidak diinginkan. Proses ini harus dilakukan
dengan hati-hati, sehingga tidak menyebabkan kerusakan pada DNA. Untuk mengeluarkan
DNA dari sel, dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan
membran inti baik dengan cara mekanik maupun secara kimiawi. Cara mekanik bisa
dilakukan dengan pemblenderan atau penggerus menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan
secara kimiawi dapat dengan pemberian yang dapat merusak membran sel dan membran inti,
salah satunya adalah deterjen.
menyebabkan rusaknya mebran sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik
suatu ikatan kimia (Machmud, 2006).

Alat dan Bahan Isolasi DNA Sederhana
Alat
I. Beaker glass atau gelas aqua
II. Pisau
III. Pengaduk
IV. Penyaring
V. Mesin blender
VI. Spatula
VII. Tabung reaksi dan rak tabung
Bahan
I. Berbagai jenis buah
II. Deterjen
III. Aquades
IV. Garam dapur
V. Etanol 96% dingin
Prosedur Kerja
1. Melarutkan deterjen, sabun cair dan sabun krim ke dalam 56 mL aquades, diaduk pelan
selama 15 menit.
2. 100 gram daging buah ditambah 100 mL aquades dimasukkan ke dalam mesin blender,
kemudian diblender selama 1 menit.
3. 4 mL masing-masing larutan sabun dicampurkan dengan masing-masing 4 mL jus buah
4. Menambahkan 1 spatula garam dapur kemudian diaduk selama 10 menit sampai diperoleh
campuran yang homogen.
5. Menyaring campuran yang dihasilkan pada poin sebelumnya sebanyak dua kali
6. 6 mL hasil penyaringan pada point dia atas dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan
menambahkan 9 mL etanol 96% dingin
7. Mengamati proses timbulnya DNA, meliputi waktu yang diperlukan, warna, serta banyak
sedikitnya DNA yang terbentuk

Sumber:
Artikel ini dirangkum dari kegiatan praktikum kelas Genetika di S1 Pendidikan Biologi Universitas
Negeri Malang.
Anonim. 2005. DNA Extraction from Wheat Germ. (Online),
(The University of Utah).www.gslc.genetics.utah.edu Diakses tanggal 31 Maret 2007
Anonim. Tanpa tahun. Isolation of DNA from Strawberry and
Rashberries, (Online).www.science.projects.com Diakses tanggal 31 Maret 2007
Istanti, Annie. 1999. Biologi Sel. Malang: jurusan Biologi FMIPA UM.
Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Deterjen, Penambahan Garam dan Ekstrak Nanas (Ananas
Comusus) terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah sebagai Topik Praktikum
Mata Kuliah Genetika. Skripsi tidak diterbitkan. Malang: Prtogram Sarjana Biologi.
Machmud, Wildan. 2006. Penentuan Lc50 48 Jam Deterjen dan Pengaruhnya terhadap Mortalitas
Larva Ikan Mas (Cyprus carpio) Ras Punten dengan Tipe Ploidi yang Berbeda. Skripsi tidak
diterbitkan. Malang: Program sarjana Biologi.

Laporan Praktikum Biologi Molekuler "ISOLASI DNA"

BAB I
PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Mempelajari DNA bukanlah hal yang mudah karena DNA itu terlalu kecil (tidak mungkin
bisa dilihat dengan mata telanjang) dan konsep-konsep mengenai DNA cukup abstrak. Kerja
laboratorium berikut ini memungkinkan anda untuk bekerja dengan DNA secara kongrit
dengan mengisolasi DNA total dengan menggunakan peralatan dasar dan juga metode yang
sama dengan yang digunakan para Ilmuwan (Dollard, 1994).
Dan merupakan bagian Vital dalam setiap makhluk hidup karena DNA memberikan suatu
karakteristik individual bagi setiap sel. Sangatlah menrik untuk melihat percobaan ini
dilakukan dengan menggunakan peralatan yang sederhana, meskipun untuk keperluan lanjut,
tentu membutuhkan peralatan yang lebih memadai (Anonim b, 2005 ).
Proses isolasi DNA dari suatu sel merupakan langkah awal bagi banyak prosedur
laboratorium dalam bioteknologi. Seorang ilmuwan harus mampuh memisahkan DNA dari
molekul lain yang tidak diinginkan dalam sel dengan sangat cermat dan hati-hati sehingga
DNA tidak rusak atau terpotong-potong. Prosedur yang akan dilakukan berikut ini adalah
modifikasi dari preparasi Marmur yang telah dilakukan secara luas di laboratoium
bioteknologi (Dollard, 1994 )

B. Rumusan
Apa itu DNA dan seperti apa Teknik analisis biologi molekuler?
Mengapa dilakukan uji isolasi DNA pada buah pisang ?
Bagaiman melihat adanya Isolasi DNA pada ekstrat buah yang sudah di campurkan
dengan detergent dan etanol?

C. Tujuan Praktikum
Kegiatan Praktikum Ini Bertujuan untuk mengisolasi DNA dari Buah Pisang dan
Semangka.

D. Manfaat
Bisa Melihat dengan mata telanjang bagaimana bentuk DNA, dan Selain kita bisa
mengetahui secara rinci apa dan seperti apa itu isolasi DNA, kita juga bisa blajar dari
praktikum ini cara-cara memberikan praktikum pada siswa yang nantinya akan menjadi siswa
kita,pada saat kita menjadi Guru.

BAB II
LANDASAN TEORI

A. DNA

DNA pada makhluk hidup dapat diisolasi secara sederhana. Pengisolasian DNA secara
sederhana dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran
inti baik secara mekanik maupun secara kimiawi. Isolasi DNA merupakan suatu teknik yang
digunakan untuk memperoleh DNA murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam
jaringan. Pemecahan dinding sel secara mekanik dapat dilakukan dengan pemblenderan atau


DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) adalah master molecul (molekul utama) yang
mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap
organisme (Jamilah, 2005). DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula
deoksiribosa, basa nitrogen dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida (Istanti, 1999).
kloroplas.

DNA yang menyusun kromosom ini merupakan nukleotida rangkap yang tersusun heliks
ganda (double helix), dimana basa nitrogen dan kedua benang polinukleotida saling
berpasangan dalam pasangan yang tetap melalui ikatan hidrogen dan antara nukleotida yang
satu dengan nukleotida yang lain dihubungkan dengan ikatan fosfat. DNA terdapat di dalam
setiap sel makhluk hidup dan disebut sebagai cetak biru kehidupan karena molekul ini
berperan penting sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan struktur protein dan
proses metabolisme lain (Jamilah, 2005).


B. Teknik Analisis Biologi Molekuler
Sejak akhir 1950-an dan awal 1960-an, ahli biologi molekuler telah belajar untuk
mengkarakterisasi, mengisolasi, dan memanipulasi komponen molekul sel dan organisme.
Komponen-komponen ini mencakup DNA, repositori informasi genetik; RNA, kerabat dekat
DNA yang fungsinya melayani sebagai berkisar dari copy pekerjaan sementara DNA untuk
fungsi struktural dan enzimatik aktual serta bagian fungsional dan struktural dari aparat
translasi, dan protein, jenis struktural dan enzimatik utama dari molekul dalam sel. Ada
beberapa macam teknik analisis biomol antara lain :
1) Ekspresi kloning
Salah satu teknik yang paling dasar biologi molekuler untuk mempelajari fungsi protein
adalah kloning ekspresi. Dalam teknik ini, DNA coding untuk suatu protein bunga kloning
(menggunakan PCR dan / atau enzim restriksi) ke dalam sebuah plasmid (dikenal sebagai
vektor ekspresi). Plasmid ini mungkin memiliki elemen promotor khusus untuk mendorong
produksi protein yang menarik, dan mungkin juga memiliki penanda resistensi antibiotik
untuk membantu mengikuti plasmid.

Plasmid ini dapat dimasukkan ke dalam sel-sel bakteri baik atau hewan. Memperkenalkan
DNA ke dalam sel bakteri dapat dilakukan dengan transformasi (melalui penyerapan DNA
telanjang), konjugasi (melalui kontak sel-sel) atau dengan transduksi (melalui vektor virus).
Memperkenalkan DNA ke dalam sel eukariotik, seperti sel hewan, dengan cara fisik atau
kimia yang disebut transfeksi. Beberapa teknik transfeksi berbeda tersedia, seperti transfeksi
kalsium fosfat, elektroporasi, injeksi dan transfeksi liposom. DNA juga dapat diperkenalkan
ke dalam sel eukariotik menggunakan virus atau bakteri sebagai pembawa, yang terakhir ini
kadang-kadang disebut bactofection dan khususnya menggunakan Agrobacterium
tumefaciens. Plasmid dapat diintegrasikan ke dalam genom, menghasilkan transfeksi stabil,
atau mungkin tetap independen dari genom, yang disebut transfeksi sementara. Dalam kedua
kasus, DNA coding untuk suatu protein yang menarik sekarang di dalam sel, dan protein
sekarang dapat dinyatakan.
Berbagai sistem, seperti promotor diinduksi dan spesifik sel-sinyal faktor, yang tersedia
untuk membantu mengekspresikan protein kepentingan di tingkat tinggi. Jumlah besar
protein kemudian dapat diekstrak dari sel bakteri atau eukariotik. Protein dapat diuji untuk
aktivitas enzimatik bawah berbagai situasi, protein dapat mengkristal sehingga struktur tersier
yang dapat dipelajari, atau, dalam industri farmasi, aktivitas obat baru terhadap protein dapat
dipelajari.
2) Polymerase chain reaction (PCR)
Reaksi berantai polimerase adalah teknik yang sangat serbaguna untuk menyalin
DNA. Secara singkat, PCR memungkinkan urutan DNA tunggal untuk disalin (jutaan kali),
atau diubah dengan cara-cara yang telah ditentukan. Sebagai contoh, PCR dapat digunakan
untuk memperkenalkan situs enzim restriksi, atau untuk bermutasi (mengubah) basa tertentu
DNA, yang terakhir adalah metode disebut sebagai "perubahan Cepat". PCR juga dapat
digunakan untuk menentukan apakah suatu fragmen DNA tertentu ditemukan di perpustakaan
cDNA. PCR memiliki banyak variasi, seperti PCR transkripsi terbalik (RT-PCR) untuk
amplifikasi RNA, dan, baru-baru ini, real-time PCR (QPCR) yang memungkinkan untuk
pengukuran kuantitatif molekul DNA atau RNA.
3) Gel elektroforesis
Elektroforesis gel adalah salah satu alat utama biologi molekuler. Prinsip dasarnya adalah
bahwa DNA, RNA, dan protein semuanya dapat dipisahkan melalui medan listrik. Dalam
elektroforesis gel agarosa, DNA dan RNA dapat dipisahkan berdasarkan ukuran dengan
menjalankan DNA melalui gel agarosa. Protein dapat dipisahkan berdasarkan ukuran dengan
menggunakan gel SDS-PAGE, atau berdasarkan ukuran dan muatan listrik mereka dengan
menggunakan apa yang dikenal sebagai elektroforesis gel 2D.
ISI
Isolasi DNA
Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsip isolasi DNA
yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran
berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar
akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung
(Mader, 1993).
Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti
protein, lemak, dan karbohidrat. Prisnsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni
penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan
protein, serta pemurnian DNA (Corkill dan Rapley, 2008; Dolphin, 2008). Menurut Surzycki
(2000), ada beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam proses isolasi DNA antara lain harus
menghasilkan DNA tanpa adanya kontaminan seperti protein dan RNA; metodenya harus
efektif dan bisa dilakukan untuk semua spesies metode yang dilakukan tidak boleh mengubah
struktur dan fungsi molekul DNA; dan metodenya harus sederhana dan cepat. Prisnsip isolasi
DNA pada berbagai jenis sel atau jaringan pada berbagai organisme pada dasarnya sama
namun memiliki modifikasi dalam hal teknik dan bahan yang digunakan. Bahkan beberapa
teknik menjadi lebih mudah dengan menggunakan kit yang diproduksi oleh suatu perusahaan
sebagai contoh kit yang digunakan untuk isolasi DNA pada tumbuhan seperti Kit Nucleon
Phytopure sedangkan untuk isolasi DNA pada hewan digunakan GeneJETTM Genomic DNA
Purification Kit. Namun tahapan-tahapan isolasi DNA dalam setiap langkahnya memiliki
protokol sendiri yang disesuaikan dengan keperluan. Penggunaan teknik isolasi DNA dengan
kit dan manual memiliki kelebihan dan kekurangan. Metode konvensional memiliki
kelebihan harga lebih murah dan digunakan secara luas sementara kekurangannya
membutuhkan waktu yang relatif lama dan hasil yang diperoleh tergantung jenis sampel.
Tahap pertama dalam isolasi DNA adalah proses perusakan atau penghancuran
membran dan dinding sel. Pemecahan sel (lisis) merupakan tahapan dari awal isolasi DNA
yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel (Holme dan Hazel, 1998). Tahap penghancuran sel
atau jaringan memiliki beberapa cara yakni dengan cara fisik seperti menggerus sampel
dengan menggunakan mortar dan pestle dalam nitrogen cair atau dengan menggunakan
metode freezing-thawing dan iradiasi (Giacomazzi et al., 2005). Cara lain yakni dengan
menggunakan kimiawi maupun enzimatik. Penghancuran dengan menggunakan kimiawi
seperti penggunaan detergen yang dapat melarutkan lipid pada membran sel sehingga terjadi
destabilisasi membran sel (Surzycki, 2000). Sementara cara enzimatik seperti menggunakan
proteinase K seperti untuk melisiskan membran pada sel darah (Khosravinia et al., 2007)
serta mendegradasi protein globular maupun rantai polipeptida dalam komponen sel (Brown,
2010; Surzycki (2000).

BAB III
METODE PRAKTIKUM

Judul : Isolasi DNA
Tujuan : Untuk mengetahui jenis detergen dan buah yang memberikan hasil isolasi terbaik serta
pengaruh kombinasi detergen, penambahan garam serta ekstark Nanas terhadap kualitas
presipitat DNA (Untuk mengisolasi DNA dari Buah Pisang dan Semangka )
Waktu Pelaksanaan : Sabtu, 30 November 2013 (Pukul 09.00 14.30 )

Tempat : Laboratorium Biologi ,FMIPA UNIMA.
a. Alat dan Bahan
Peralatan yang digunakan dalam praktikum ini adalah :
1. Alat-alat untuk ekstraksi
Pisau
Blender
Gelas ukur
Waskom/Mangkuk
Pengaduk/sendok spatula
Gelas air mineral

2. Alat-alat untuk Filtrasi
Saringan
Kain (sapu tangan )
Waskom/Mangkuk

3. Alat-alat untuk isolasi DNA
Lemari es (freezer)
Tabung reaksi
Rak tabung reaksi
Pipet
Pipet 5 ml
Pipet 10 ml

Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah :
Buah pisang
Aquades
Detergen bubuk
Garam Dapur
Ethanol 90%
Kertas saring
Buah nanas untuk diekstrak

b. Prosedur Kerja
1. Membuat Ekstrat Nanas
Nenas di bersihkan terlebih dahulu,dan di pisahkan ke dalam Waskom tersendiri.
Nanas diblender sebanyak 200 gr dengan 200 ml aquades
Jus nanas di saring menggunakan saringan, kemudian di saring lagi menggunakan kain
rangkap dua,lalu di saring dengan dua lapis kertas saring.

2. Membuat larutan Detergent dan garam
Menyiapkan gelas air mineral berisi 56 ml aquades /aqua (6 gelas pertama )
Masing-masing di masukan 1 sdt detergent dan satu sendok spatula garam

Kemudian masing-masing larutan di aduk selama kurang lebih 15 menit.(pengadukan di
lakukan perlahan-lahan agar tidak menimbulkan banyak buih,jika terbentuk buih langsung di
ambil dengan pipet)

3. Menyediakan Sumber DNA
Buah pisang dan buah semangka di kupas terlebih dahulu, kemudian di timbang sebanyak
200 gr.

Pisang di potong kecil-kecil kemudian diblender dengan 200 ml aquades selama 1-3 menit
(sampai terbentuk bubur pisang yang lembut )

4. Mengekstrak DNA
Pisang yang sudah di blender dan semangka,di masukan ke dalam gelas berisi protocol
masing-masing 3 gelas (pisang 3,dan semangka 3 ) sebanyak dua sdt,dan di tambahkan satu
sendok spatula garam kemudian di aduk perlahan-lahan selama 10-15 menit.
Kemudian ke enam campuran (a) di saring menggunakan 2 lapis kain kemudian dengan dua
lapis kertas saring.
Filtrat kemudian di masukan ke dalam tabung reaksi
Tabung yang berisi filtrat di tambahkan 2 ml enzim (nanas)
Larutan pada tabung berisi enzim,di homogenkan dengan cara memiringkan tabung perlahan-
lahan.
Kemudian di tambahkan 9 ml ethanol 96% dingin ke dalam setiap tabung perlahan-lahan dari
tepi tabung.
Biarkan DNA terpresipitasi ke dalam alkohol (tabung jangan di guncang )

Mengamati hasil presipitasi.

BAB IV
HASIL PENGAMATAN

Hasil Pengamatan praktikum Isolasi DNA:

No Buah Perlakuan Hasil pengamatan
Warna Bentuk Waktu Jumlah
1.

Pisang Rinso (1)

Attack (2)

Sunlight
(3)
Keruh,
Kekuningan

Kuning
mudah

Putih susu
DNA Rusak

DNA Rusak

Gumpalan
berwarna
putih seperti
kabut dan
gelembung
kecil.
-

-

2
2. Semangka Rinso (4)

Attack (5)

Sunlight
(6)
Kuning
kecoklatan

Merah
muda

Hampir
mendekati
putih
bening
Benang yang
menggumpal
Gumpalan

Gumpalan
putih seperti
kabut

Gumpalan
putih seperti
kabut (tidak
terlalu
Nampak )

1

2

2

2
Tabung 1 : Tidak terdapat gumpalan ataupun bebang-banang. Karena DNA dinyatakan Rusak
Tabung 2 : Sama Halnya dengan tabung 1
Tabung 3 : Terbentuk 2 lapisan larutan. Larutan terlihat putih susu. Terlihat gelembung kecil sedikit.
DNA membentuk seperti gumpalan awan.
Tabung 4 : Terbentuk 2 lapisan larutan. Larutan terlihat berwarna bening dan kuning kecoklatan.
Terlihat gelembung kecil sedikit. DNA membentuk seperti gumpalan awan, ada juga yang
menyebar berbentuk benang yang sangat halus di larutan.
Tabung 5 : Terbentuk 2 lapisan larutan. Larutan terlihat berwarna merah muda. DNA membentuk
seperti gumpalan awan.
Tabung 6 : Terbentuk 2 lapisan larutan.Larutan hamper tidak terlihat.Tapi masi bisa di amati DNAnya
membentuk seperti gumpalan awan

Pertanyaan Diskusi
1. Mengapa buah pisang digunakan sbagai sumber energy?
Jawab : Karena buah pisang termasuk tumbuhan sel tumbuhan (eukariotik) yang di dalam sel
terdapat inti sel dan di dalam inti sel memiliki DNA.
2. Mengapa pemblenderan buah pisang tidak boleh dilakukan terlalu lama?Jelaskan!
Jawab : Agar DNA yang ada di dalamnya tidak hancur
3. Jelaskan Fungsi bahan-bahan berikut ini dalam proses isolasi DNA dan bagaimana
mekanisme kerjanya!
a. Detergent
b. Garam
c. Ekstrak nanas
d. Ethanol 96% dingin
Jawab :
a) Detergent ,berfungsi memisahkan membrane inti sel agar lipid lemak bisa terlepas dari
membran inti.
b) Garam, karena garam mengandung NaCL yang berfungsi menyatukan semua DNA yang
telah terurai dan membuat satu ikatan dengan garam.Dan akan terangkat sehingga terpisah
dari yang akan terkontaminasi.
c) Ekstrak Nanas, Sebagai Enzim karena nanas mengandung glimalin yang berfungsi sebagai
pengurai.sehingga protein menjadi lunak,dan terpisah dari membrane
d) Ethanol 96% dingin, Mempresipitasikan asam nukleat polimerik dengan baik untuk
meningkatkan konsentrasi DNA.

Tugas Individu
1. Apa yang dimaksud dengan DNA?
Jawab :
Asam deoksiribonukleat, lebih dikenal dengan DNA (bahasa Inggris:deoxyribonucleic acid),
adalah sejenis asam nukleat yang tergolong biomolekul utama penyusun berat
kering setiap organisme. Di dalam sel, DNA umumnya terletak di dalam inti sel.Secara garis
besar, peran DNA di dalam sebuah sel adalah sebagaimateri genetik; artinya, DNA
menyimpan cetak biru bagi segala aktivitas sel. Ini berlaku umum bagi setiap organisme. Di
antara perkecualian yang menonjol adalah beberapa jenis virus (dan virus tidak termasuk
organisme) seperti HIV (Human Immunodeficiency Virus).

2. Bagaimana Struktur DNA?
Jawab :
DNA terdiri atas dua utas benang polinukleotida yang saling berpilin membentuk heliks
ganda (double helix). Model struktur DNA itu pertama kali dikemukakan olehJames
Watson dan Francis Crick pada tahun 1953 di Inggris. Struktur tersebut mereka buat
berdasarkan hasil analisis foto difraksi sinar X pada DNA yang dibuat oleh Rosalind
Franklin. Karena yang difoto itu tingkat molekul, maka yang tampak hanyalah bayangan
gelap dan terang saja. Bayangan foto itu dianalisis sehingga mereka berkesimpulan bahwa
molekul DNA merupakan dua benang polinukleotida yang berpilin.
3. Apakah fungsih DNA?jelaskan
Jawab :
fungsi DNA adalah sebagai materi genetik; artinya, DNA menyimpan cetak biru bagi segala
aktivitas sel. Ini berlaku umum bagi setiap organisme.
4. Apa yang dimaksud dengan Keanekaragaman?
Jawab :
Keanekaragaman hayati adalah keanekaragaman makhluk hidup yang menunjukkan
keseluruhan variasi gen, spesies, dan ekosistem suatu daerah. Keanekaragaman hayati
ditunjukkan dengan adanya variasi makhluk hidup yang meliputi bentuk, penampilan, jumlah
serta ciri lain. Penyebabnya adalah faktor genetik (faktor yang bersifat relatif konstan atau
stabil terhadap morfologi (fenotip) organisme), dan factor lur (factor yang bersifat relatif labil
terhadap morfologi organisme).
Keanekaragaman hayati mencakup tiga tingkatan pengertian yang berbeda, yaitu
keanekaragaman gen, keanekaragaman jenis,dan keanekaragaman ekosistem.
1. Keanekaragaman Gen
Keanekaragaman gen adalah keanekaragaman individu dalam satu jenis makhluk hidup.
Gen adalah substansi terkecil/unit dasr yang membawa faktor keturunan. Gen terdapat di
dalam kromosom yang tersusun atas molekul rantai dobel heliks yang disebut DNA.

2. Keanekaragaman Jenis
Keanakaragaman jenis menunjukkan seluruh variasi yang terdapat pada makhluk hidup
antar jenis (interspesies) dalam satu marga. Keanekaragaman jenis lebih mudah diamati
daripada keanekaragaman gen.
perbedaan antarspesies makhluk hidup dalamsatu marga atau genus lebih mencolok shingga
lebih mudah diamati daripada perbedaan antarindividu dalam satu spesies. Misalnya nangka,
keluwih, dan sukun ketiganya termasuk dalam genus yang sama, yaitu Arthocarpus.

3. Keanekaragaman Ekosistem
Ekosistem adalah komunitas organic yang terdiri atas tumbuhan, hewan, dan mikroorganisme
bersama lingkungan fisik dan kimia tempat hidup atau habitatnya.Antara komunitas organik,
habitat, serta factor-faktor fisik dan kimia dalam suatu ekosistem selalu berinteraksi. Factor
fisik meliputi iklim, air, tanah, udara, cahaya, suhu, dan kelembapan. Factor kimia meliputi
tingkat keasaman, kandungan mineral, dan salinitas. Factor fisik dan kimia disbut komponen
abiotik.

BAB V
PENUTUP

A. Kesimpulan
1. DNA di tempeli oleh makromolekul-makromolekul seperti karbohidrat,lemak, protein dan
lain-lainnya, cara mudah memisahkan makromolekul adalah dengan menggunakan detergen.
2. Jenis detergen berpengaruh terhadapa hasil isolasi DNA pada buah, tingkat kualitas
detergen dalam membentuk DNA adala bervariasi tergantung dari jenis buah dan kandungan
air buah. Detergen bubuk berkualitas lebih baik pada buah dengan kadar air tinggi sedangkan
detergen cair berkualitas lebih baik pada buah dengan kadar air sedang dan rendah.
3. Detergen cair memiliki kualitas paling baik dalam kecepatan membentuk DNA sedangkan
detergen bubuk mempunyai kecepatan paling rendah dalam membentuk DNA.

B. Saran
Saat melakukan praktikum sebaiknya serius. Jangan main-main,agar hasilnya nantipun tidak
main-main.Dan sebaiknya,sebelum praktikum,ada baiknya sehari sebelum praktikum,alat-alat
yang akan di pakai di siapkan terlebih dahulu.Agar tidak membuang-buang waktu banyak.

DAFTAR PUSTAKA

http://deallia.blogspot.com/2013/09/laporan-pengamatan-isolasi-dna.html
http://biologiaja.blogspot.com/2012/05/isolasi-dna-buah-pisang.html
http://aisyatunnurlaelyshare.wordpress.com/science/isolasi-dna/
http://biology-community.blogspot.com/2012/08/isolasi-dna.html
http://www.news-medical.net/health/Molecular-Biology-Techniques-
%28Indonesian%29.aspx

PAGE VIEWS
KATEGORI
anatomy (2)
Artikel (7)
Astrobiology (1)
Biofisika (4)
Bioinformatika (3)
Biokimia (7)
Biologi Molekular (18)
Biologi SMA (28)
BioMath (1)
BioReligi (1)
BioSpiritual (2)
Bioteknologi (7)
Botani (2)
Connectome (1)
E-Book Biologi (97)
Ekspedisi (4)
Enzimology (3)
Evolusi (1)
filsafat (1)
Fisiologi Hewan (4)
Fisiologi Tumbuhan (7)
Forensik (1)
Genetika (8)
Global Warming (2)
Histologi (2)
Kesehatan (9)
Laboratorium (3)
Lingkungan (5)
Mikrobiologi (2)
Mikroteknik (7)
Nutrisi (1)
Rekayasa Genetika (2)
Virologi (5)
zoologi (6)

COPYRIGHT THIS BLOG

ISOLASI DNA
Kamis, Agustus 16, 2012 Biologi Molekular, Laboratorium 9 comments
Molekul DNA dalam suatu sel dapat diekstraksi atau diisolasi untuk berbagai macam
keperluan seperti amplifikasi dan analisis DNA melalui elektroforesis. Isolasi DNA
dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan
karbohidrat. Prisnsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi
atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA
(Corkill dan Rapley, 2008; Dolphin, 2008). Menurut Surzycki (2000), ada beberapa hal yang
perlu diperhatikan dalam proses isolasi DNA antara lain harus menghasilkan DNA tanpa
adanya kontaminan seperti protein dan RNA; metodenya harus efektif dan bisa dilakukan
untuk semua spesies metode yang dilakukan tidak boleh mengubah struktur dan fungsi
molekul DNA; dan metodenya harus sederhana dan cepat.

Prisnsip isolasi DNA pada berbagai jenis sel atau jaringan pada berbagai organisme pada
dasarnya sama namun memiliki modifikasi dalam hal teknik dan bahan yang digunakan.
Bahkan beberapa teknik menjadi lebih mudah dengan menggunakan kit yang diproduksi oleh
suatu perusahaan sebagai contoh kit yang digunakan untuk isolasi DNA pada tumbuhan
seperti Kit Nucleon Phytopure sedangkan untuk isolasi DNA pada hewan digunakan
GeneJETTM Genomic DNA Purification Kit. Namun tahapan-tahapan isolasi DNA dalam
setiap langkahnya memiliki protokol sendiri yang disesuaikan dengan keperluan. Penggunaan
teknik isolasi DNA dengan kit dan manual memiliki kelebihan dan kekurangan. Metode
konvensional memiliki kelebihan harga lebih murah dan digunakan secara luas sementara
kekurangannya membutuhkan waktu yang relatif lama dan hasil yang diperoleh tergantung
jenis sampel.

Tahap pertama dalam isolasi DNA adalah proses perusakan atau penghancuran membran dan
dinding sel. Pemecahan sel (lisis) merupakan tahapan dari awal isolasi DNA yang bertujuan
untuk mengeluarkan isi sel (Holme dan Hazel, 1998). Tahap penghancuran sel atau jaringan
memiliki beberapa cara yakni dengan cara fisik seperti menggerus sampel dengan
menggunakan mortar dan pestle dalam nitrogen cair atau dengan menggunakan metode
freezing-thawing dan iradiasi (Giacomazzi et al., 2005). Cara lain yakni dengan
menggunakan kimiawi maupun enzimatik. Penghancuran dengan menggunakan kimiawi
seperti penggunaan detergen yang dapat melarutkan lipid pada membran sel sehingga terjadi
destabilisasi membran sel (Surzycki, 2000). Sementara cara enzimatik seperti menggunakan
proteinase K seperti untuk melisiskan membran pada sel darah (Khosravinia et al., 2007)
serta mendegradasi protein globular maupun rantai polipeptida dalam komponen sel (Brown,
2010; Surzycki (2000).

Pada proses lisis dengan menggunakan detergen, sering digunakan sodium dodecyl sulphate
(SDS) sebagai tahap pelisisan membran sel. Detergen tersebut selain berperan dalam
melisiskan membran sel juga dapat berperan dalam mengurangi aktivitas enzim nuklease
yang merupakan enzim pendegradasi DNA (Switzer, 1999). Selain digunakan SDS, detergen
yang lain seperti cetyl trimethylammonium bromide (CTAB) juga sering dipakai untuk
melisiskan membran sel pada isolasi DNA tumbuhan (Bettelheim dan Landesberg, 2007).
Parameter keberhasilan dalam penggunaan CTAB bergantung pada beberapa hal. Pertama,
Konsentrasi NaCl harus di atas 1.0 M untuk mencegah terbentuknya kompleks CTAB-DNA.
Karena jumlah air dalam pelet sel sulit diprediksi, maka penggunaan CTAB sebagai pemecah
larutan harus dengan NaCl dengan konsentrasi minimal 1.4 M. Kedua, ekstrak dan larutan sel
yang mengandung CTAB harus disimpan pada suhu ruang karena kompleks CTAB-DNA
bersifatinsolublepada suhu di bawah 15C. Ketiga, penggunaan CTAB dengan kemurnian
yang baik akan menentukan kemurnian DNA yang didapatkan dan dengan sedikit sekali
kontaminasi polisakarida. Setelah ditambahkan CTAB, sampel diinkubasikan pada suhu
kamar. Tujuan inkubasi ini adalah untuk mencegah pengendapan CTAB karena CTAB akan
mengendap pada suhu 15C. Karena efektivitasnya dalam menghilangkan polisakarida,
CTAB banyak digunakan untuk purifikasi DNA pada sel yang mengandung banyak
polisakarida seperti terdapat pada sel tanaman dan bakteri gram negatif seperti Pseudomonas,
Agrobacterium, dan Rhizobium (Surzycki, 2000).

Dalam penggunaan buffer CTAB seringkali ditambahkan reagen-reagen lain seperti NaCl,
EDTA, Tris-HCl, dan 2-mercaptoethanol. NaCl berfungsi untuk menghilangkan polisakarida
sementara 2-mercaptoethanol befungsi untuk menghilangkan kandungan senyawa polifenol
dalam sel tumbuhan (Ranjan et al., 2010). 2-mercaptoethanol dapat menghilangkan polifenol
dalam sel tanaman dengan cara membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa polifenol yang
kemudian akan terpisah dengan DNA (Lodhi et al., 1994). Senyawa polifenol perlu
dihilangkan agar diperoleh kualitas DNA yang baik (Moyo et al., 2008). Polifenol juga dapat
menghambat reaksi dari enzim Taq polimerase pada saat dilakukan amplifikasi. Disamping
itu polifenol akan mengurangi hasil ektraksi DNA serta mengurangi tingkat kemurnian DNA
(Porebskiet al., 1997). Penggunaan 2-mercaptoethanol dengan pemanasan juga dapat
mendenaturasi protein yang mengkontaminasi DNA (Walker dan Rapley, 2008).

Konsentrasi dan pH dari bufer yang digunakan harus berada dalam rentang pH 5 sampai 12.
Larutan buffer dengan pH rendah akan mengkibatkan depurifikasi dan mengakibatkan DNA
terdistribusi ke fase fenol selama proses deproteinisasi. Sedangkan pH larutan yang tinggi di
atas 12 akan mengakibatkan pemisahan untai ganda DNA. Fungsi larutan buffer adalah untuk
menjaga struktur DNA selama proses penghancuran dan purifikasi sehingga memudahkan
dalam menghilangkan protein dan RNA serta mencegah aktivitas enzim pendegradasi DNA
dan mencegah perubahan pada molekul DNA. Untuk mengoptimalkan fungsi larutan buffer,
dibutuhkan konsentrasi, pH, kekuatan ion, dan penambahan inhibitor DNAase dan detergen
(Surzycki 2000).

Pada tahapan ekstraksi DNA, seringkali digunakan chelating agent seperti ethylenediamine
tetraacetic acid (EDTA) yang berperan menginaktivasi enzim DNase yang dapat
mendenaturasi DNA yang diisolasi, EDTA menginaktivasi enzim nuklease dengan cara
mengikat ion magnesium dan kalsium yang dibutuhkan sebagai kofaktor enzim DNAse
(Corkill dan Rapley, 2008). DNA yang telah diekstraksi dari dalam sel selanjutnya perlu
dipisahkan dari kontaminan komponen penyusun sel lainnya seperti polisakarida dan protein
agar DNA yang didapatkan memiliki kemurnian yang tinggi. Fenol seringkali digunakan
sebagai pendenaturasi protein, ekstraksi dengan menggunakan fenol menyebabkan protein
kehilangan kelarutannya dan mengalami presipitasi yang selanjutnya dapat dipisahkan dari
DNA melalui sentrifugasi (Karp, 2008). Bettelheim dan Landesberg (2007) menyebutkan
bahwa setelah sentrifugasi akan terbentuk 2 fase yang terpisah yakni fase organik pada
lapisan bawah dan fase aquoeus (air) pada lapisan atas sedangkan DNA dan RNA akan
berada pada fase aquoeus setelah sentrifugasi sedangkan protein yang terdenaturasi akan
berada pada interfase dan lipid akan berada pada fase organik (Gambar 1). Selain fenol, dapat
pula digunakan campuran fenol dan kloroform atau campuran fenol, kloroform, dan isoamil
alkohol untuk mendenaturasi protein. Ekstrak DNA yang didapat seringkali juga
terkontaminasi oleh RNA sehingga RNA dapat dipisahkan dari DNA ekstrak dengan cara
pemberian RNAse (Birren, et al., 1997; Clark, 2010).

Gambar 1. Asam nukleat berada pada lapisan air setelah disentrifugasi
pada tahapan ekstraksi (Clark, 2010). klik gambar untuk memperbesar.

Asam nukleat adalah molekul hidrofilik dan bersifat larut dalam air. Disamping itu, protein
juga mengandung residu hidrofobik yang mengakibatkan protein larut dalam pelarut organik.
Berdasarkan sifat ini, terdapat beberapa metode deproteinisasi berdasarkan pemilihan pelarut
organik. Biasanya pelarut organik yang digunakan adalah fenol atau kloroform yang
mengandung 4% isoamil alkohol. Penggunaan kloroform isoamil alkohol (CIA) berdasarkan
perbedaan sifat pelarut organik. Kloroform tidak dapat bercampur dengan air dan
kemampuannya untuk mendeproteinisasi berdasarkan kemampuan rantai polipeptida yang
terdenaturasi untuk masuk atau termobilisasi ke dalam fase antara kloroform air.
Konsentrasi protein yang tinggi pada fase antara tersebut dapat menyebabkan protein
mengalami presipitasi. Sedangkan lipid dan senyawa organik lain akan terpisah pada lapisan
kloroform (Clark, 2010).

Proses deproteinisasi yang efektif bergantung pada besarnya fase antara kloroform-air.
Proses ini dapat dilakukan dengan membentuk emulsi dari air dan kloroform. Hal ini hanya
dapat dilakukan dengan penggojogan atau sentrifugasi yang kuat karena kloroform tidak
dapat bercampur dengan air. Isoamil alkohol berfungsi sebagai emulsifier dapat ditambahkan
ke kloroform untuk membantu pembentukan emulsi dan meningkatkan luas permukaan
kloroform-air yang mana protein akan mengalami presipitasi. Penggunaan kloroform isoamil
alkohol ini memungkinkan untuk didapatkan DNA yang sangat murni, namun dengan ukuran
yang terbatas (20.00050.000 bp). Fungsi lain dari penambahan CIA ini adalah untuk
menghilangkan kompleks CTAB dan meninggalkan DNA pada fase aquoeus. DNA
kemudian diikat dari faseaquoeus dengan presipitasi etanol (Surzycki, 2000).

Setelah proses ekstraksi, DNA yang didapat dapat dipekatkan melalui presipitasi.Pada
umumnya digunakan etanol atau isopropanol dalam tahapan presipitasi. Kedua senyawa
tersebut akan mempresipitasi DNA pada fase aquoeus sehingga DNA menggumpal
membentuk struktur fiber dan terbentuk pellet setelah dilakukan sentrifugasi (Switzer,
1999).Hoelzel (1992) juga menambahkan bahwa presipitasi juga berfungsi untuk
menghilangkan residu-residu kloroform yang berasal dari tahapan ekstraksi.

Menurut Surzycki (2000), prinsip-prinsip presipitasi antara lain pertama, menurunkan
kelarutan asam nukleat dalam air. Hal ini dikarenakan molekul air yang polar mengelilingi
molekul DNA di larutan aquoeus. Muatan dipole positif dari air berinteraksi dengan muatan
negatif pada gugus fosfodiester DNA. Interaksi ini meningkatkan kelarutan DNA dalam air.
Isopropanol dapat bercampur dengan air, namun kurang polar dibandingkan air. Molekul
isopropanol tidak dapat berinteraksi dengan gugus polar dari asam nukleat sehingga
isopropanol adalah pelarut yang lemah bagi asam nukleat; kedua, penambahan isopropanol
akan menghilangkan molekul air dalam larutan DNA sehingga DNA akan terpresipitasi;
ketiga, penggunaan isopropanol dingin akan menurunkan aktivitas molekul air sehingga
memudahkan presipitasi DNA.

Pada tahapan presipitasi ini, DNA yang terpresipitasi akan terpisah dari residu-residu RNA
dan protein yang masih tersisa. Residu tersebut juga mengalami koagulasinamun tidak
membentuk struktur fiber dan berada dalam bentuk presipitat granular.Pada saat etanol atau
isopropanol dibuang dan pellet dikeringanginkan dalam tabung, maka pellet yang tersisa
dalam tabung adalah DNA pekat.Proses presipitasikembali dengan etanol atau isopropanol
sebelum pellet dikeringanginkan dapat meningkatkan derajat kemurnian DNA yang diisolasi
(Bettelheim dan Landesberg, 2007). Keller dan Mark (1989) menerangkan bahwa pencucian
kembali pellet yang dipresipitasi oleh isopropanol dengan menggunakan etanol bertujuan
untuk menghilangkan residu-residu garam yang masih tersisa. Garam-garam yang terlibat
dalam proses ekstraksi bersifat kurang larut dalam isopropanol sehingga dapat terpresipitasi
bersama DNA, oleh sebab itu dibutuhkan presipitasi kembali dengan etanol setelah presipitasi
dengan isopropanol untuk menghilangkan residu garam (Ausubel et al., 2003).

Setelah dilakukan proses presipitasi dan dilakukan pencucian dengan etanol, maka etanol
kemudian dibuang dan pellet dikeringanginkan, perlakuan tersebut bertujuan untuk
menghilangkan residu etanol dari pelet DNA. Penghilangan residu etanol dilakukan dengan
cara evaporasi karena etanol mudah menguap (Surzycki, 2000). Pada tahap pencucian
biasanya etanol dicampur dengan ammonium asetat yang bertujuan untuk membantu
memisahkan kontaminan yang tidak diinginkan seperti dNTP dan oligosakarida yang terikat
pada asam nukleat (Sambrook et al., 2001).

Setelah pellet DNA dikeringanginkan, tahap selanjutnya adalah penambahan buffer TE ke
dalam tabung yang berisi pellet dan kemudian disimpan di dalam freezer dengan suhu sekitar
-20C. Verkuil et al. (2008) menyatakan bahwa buffer TE dan penyimpanan suhu pada -20C
bertujuan agar sampel DNA yang telah diekstraksi dapat disimpan hingga waktu berminggu-
minggu. Keller dan Mark (1989) juga menjelaskan bahwa pelarutan kembali dengan buffer
TE juga dapat memisahkan antara RNA yang mempunyai berat molekul lebih rendah
dibandingkan DNA sehingga DNA yang didapatkan tidak terkontaminasi oleh RNA dan
DNA sangat stabil ketika disimpan dalam keadaan terpresipitasi pada suhu -20C.

Gambar 2. Proses pufrifikasi DNA dengan menggunakan metode silika dan kolom
kromatografi (a) proses pengikatan DNA ke silika dengan bantuan perubahan konsentrasi
garam, (b) DNA dielusi untuk memperoleh DNA (Brown, 2010). Klik gambar untuk
memperbesar.

Isolasi DNA juga dapat dilakukan dengan menggunakan kit yang sudah diproduksi oleh
beberapa perusahan untuk mempermudah dan mempercepat proses isolasi DNA. Kit isolasi
juga disesuaikan dengan kebutuhan oleh konsumen dan jenis sel yang akan digunakan.
Berikut adalah bagan contoh isolasi DNA tanaman dengan menggunakan Kit Nucleon
Phytopure yang disajikan pada Gambar 3.

Gambar 3. Bagan isolasi DNA dengan menggunakan kit phytopure.
Klik gambar untuk memperbesar.

ISOLASI GENOM DNA, ANALISIS SEQUEN DNA dan IDENTIFIKASI SEQUEN
DNA

BAB I
PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang
Perkembangan bioteknologi modern di awal tahun 1970-an telah membuka cakrawala
baru dunia ilmu pengetahuan dan teknologi. Berbagai disiplin ilmu bergerak bersama dalam
proses pengembangan teknik-teknik yang digunakan dalam penelitian biologi molekuler.
Kajian aktivitas terpadu antar ilmu-ilmu biologi, biokimia, genetika, mikrobiologi, teknik
kimia, komputasi, dan biofisika dengan menggunakan pendekatan biologi molekuler untuk
menghasilkan suatu barang dan jasa yang terkait dengan perkembangan IPTEK.
Bioteknologi berasal dari kata latin yaitu bio (hidup), teknos (teknologi = penerapan) dan
logos (ilmu). Bioteknologi adalah cabang biologi yang mempelajari pemanfaatan prinsip
ilmiah dan rekayasa terhadap organisme, proses biologis untuk meningkatkan potensi
organisme maupun menghasilkan produk dan jasa bagi kepentingan manusia.
DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel dengan
komponenkomponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan pasangan basa.
Pasangan basa pada DNA terdiri atas dua macam, yaitu basa purin dan pirimidin. DNA
memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel dengan komponenkomponennya, yaitu
gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan pasangan basa. Pasangan basa pada DNA
terdiri atas dua macam, yaitu basa purin dan pirimidin. Basa purin terdiri atas adenin (A) dan
guanin (G) yang memiliki struktur cincin ganda, sedangkan basa pirimidin terdiri atas sitosin
(C) dan timin (T) yang memiliki struktur cincin-tunggal. Ketika guanin berikatan dengan
sitosin, maka akan terbentuk tiga ikatan hidrogen, sedangkan ketika adenin berikatan dengan
timin maka hanya akan terbentuk dua ikatan hidrogen. Satu komponen pembangun (building
block) DNA terdiri atas satu gula pentosa, satu gugus fosfat dan satu pasang basa yang
disebut nukleotida.
Penggunaan PCR telah berkembang secara cepat seirama dengan perkembangan biologi
molekuler. PCR digunakan untuk identifikasi penyakit genetik, infeksi oleh virus, diagnosis
dini penyakit seperti AIDS, Genetic profiling in forensic, legal and bio-diversity
applications, biologi evolusi,Site-directed mutagenesis of genes dan mRNA Quantitation di
sel ataupun jaringan.

1.2. Tujuan Praktikum
1. Mengetahui cara mengekstraksi DNA secara sederhana
2. Melihat presipitasi DNA
3. Mengidentifikasi kekerabatan terdekat sekuen DNA isolate
4. Mengetahui cara membuat pohon filogenetik yang menunjukan tingkat kekerabatan
terdekat dengan mikroorganisme yang lain

1.3. Manfaat Praktikum
1. Praktikan dapat melakukan cara mengekstraksi dari DNA
2. Praktikan mempunyai kemampuan untuk mengidentifikasi dari kekerabatan terdekat sekuen
DNA isolate
3. Praktikan mempunyai kemampuan untuk teknik teknik membuat pohon filogenik yang
menunjukkan tingkat kekerabatan terdekat dengan mikroorganisme

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Pengertian DNA dan RNA
Asam nukleat adalah polinukleotida yang terdiri dari unit-unit mononukleotida, jika unit-
unit pembangunnya dioksinukleotida maka asam nukleat itu disebut dioksiribonukleat(DNA)
dan jika terdiri dari unit-unit mononukleotida disebut asam ribonukleat(RNA). DNA dan
RNA mempunyai sejumlah sifat kimia dan fisika yang sama sebab antara unit-unit
mononukleotida terdapat ikatan yang sama yaitu melalui jembatan fosfodiester antara posisi
3 suatu mononukleotida dan posisi 5 pada mononukleotida lainnya(Harpet, 1980).
DNA merupakan suatu polimer besar dengan property karakteristik fisik yang unik.
Eksploitasi ukuran dan struktur kimia DNA dapat dilakukan dengan isolasi dan purifikasi.
Sebagian besar teknik isolasi DNA memerlukan lisis sel, yang dilanjutkan dengan ekstraksi
protein dengan menggunakan larutan organic berbasis fenol dan presipitasi DNA dalam
ethanol. Kemurnian DNA dapat diketahui dengan menggunakan spektrofotometri dengan
menghitung ratio hasil pengamatan pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm = 1,8.
Keutuhan relative DNA dapat dilakukan dengan gel elektroforesis. Apabila purifikasi
diperlukan, metode kromatografi bisa digunakan atau dengan penambahan enzim RNase.
DNA ditemukan pada Tahun 1869 Oleh Johann Friedrich Miescher, seorang Ahli Biokimia
pertama kali Miescher mengekstrak sel-sel menggunakan darah putih dan memperoleh
campuran antara DNA dan protein-protein kromosom. Yang berikutnya ekstrak asam nukleat
adalah murni diperoleh menggunakan sperma ikan salmon. Uji kimiawi DNA menunjukkan
bahwa DNA tersebut ditemukan Miescher Yang bersifat asam banyak mengandung dan
fosfor.

Tiga Tahun sebelum Miescher menemukan DNA, Gregor Mendel telah mempublikasikan
Perkawinan Hasil percobaan kacang ercis Dan menghipotesiskan bahwa pewarisan genetik
dikendalikan faktor unit Oleh, Oleh materi butir Yang Ahli genetika disebut gen sekarang.
Asam-asam nukleat seperti asam dioksiribosa nukleat (DNA) dan asam ribonukleat (RNA)
memberikan dasar kimia bagi pemindahan keterangan di dalam semua sel. Asam nukleat
merupakan molekul makro yang memberi keterangan tiap asam nukleat mempunyai urutan
nukleotida yang unik sama seperti urutan asam amino yang unik dari suatu protein tertentu
karena asam nukleat merupakan rantai polimer yang tersusun dari satuan monomer yang
disebut nukleotida(Dage, 1992). Dua tipe utama asam nukleat adalah asam
dioksiribonukleat(DNA) dan asam ribonukleat(RNA). DNA terutama ditemui dalam inti sel,
asam ini merupakan pengemban kode genetik dan dapat memproduksi atau mereplikasi
dirinya dengan tujuan membentuk sel-sel baru untuk memproduksi organisme itu dalam
sebagian besar organisme, DNA suatu sel mengerahkan sintesis molekul RNA, satu tipe
RNA, yaitu messenger RNA(mRNA), meninggalkan inti sel dan mengarahkan tiosintesis dari
berbagai tipe protein dalam organisme itu sesuai dengan kode DNA-nya(fessenden, 1990).
Meskipun banyak memiliki persamaan dengan DNA, RNA memiliki perbedaan dengan
DNA, antara lain yaitu(Poedjiati, 1994):
1. Bagian pentosa RNA adalah ribosa, sedangkan bagian pentosa DNA adalah
dioksiribosa
2. .Bentuk molekul DNA adalah heliks ganda, bentuk molekul RNA berupa rantai
tunggal yang terlipat, sehingga menyerupai rantai ganda
3. RNA mengandung basa adenin, guanin dan sitosin seperti DNA tetapi tidak
mengandung timin, sebagai gantinya RNA mengandung urasil.
4. Jumlah guanin dalam molekul RNA tidak perlu sama dengan sitosin,
demikian pula jumlah adenin, tidak perlu sama dengan urasil.Selain itu perbedaan RNA
dengan DNA yang lain adalah dalam hal(Suryo, 1992):
a. Ukuran dan bentuk
Pada umumnya molekul RNA lebih pendek dari molekul DNA. DNA berbentuk double helix,
sedangkan RNA berbentuk pita tunggal. Meskipun demikian pada beberapa virus tanaman,
RNA merupakan pita double namun tidak terpilih sebagai spiral.
b. Susunan kimia
Molekul RNA juga merupakan polimer nukleotida, perbedaannya dengan DNA yaitu:
1. Gula yang menyusunnya bukan dioksiribosa, melainkan ribosa.
2. Basa pirimidin yang menyusunnya bukan timin seperti DNA, tetapi urasil.
c. Lokasi
DNA pada umumnya terdapat di kromosom, sedangkan RNA tergantung dari macamnya,
yaitu:
1. RNA d(RNA duta), terdapat dalam nukleus, RNA d dicetak oleh salah satu pita DNA yang
berlangsung didalam nukleus.
2. RNA p(RNA pemindah) atau RNA t(RNA transfer), terdapat di sitoplasma
3. RNA r(RNA ribosom), terdapat didalam ribosom.
d. Fungsinya
DNA berfungsi memberikan informasi atau keterangan genetik, sedangkan fungsi RNA
tergantung dari macamnya, yaitu:
1. RNA d, menerima informasi genetik dari DNA, prosesnya dinamakan transkripsi,
berlangsung didalam inti sel.
2. RNA t, mengikat asam amino yang ada di sitoplasma
3. .RNA t, mensintesa protein dengan menggunakan bahan asam amino, proses ini
berlangsung di ribosom dan hasil akhir berupa polipeptida. Ada beberapa cara untuk
menentukan DNA dan RNA, yaitu(Frutan and Sofia, 1968):
DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel dengan komponen-
komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan pasangan basa. Pasangan
basa pada DNA terdiri atas dua macam, yaitu basa purin dan pirimidin. Basa purin terdiri atas
adenin (A) dan guanin (G) yang memiliki struktur cincinganda, sedangkan basa pirimidin
terdiri atas sitosin (C) dan timin (T) yang memiliki struktur cincin-tunggal. Ketika guanin
berikatan dengan sitosin, maka akan terbentuk tiga ikatan hidrogen, sedangkan ketika adenin
berikatan dengan timin maka hanya akan terbentuk dua ikatan hidrogen. Satu komponen
pembangun (building block) DNA terdiri atas satu gula pentosa, satu gugus fosfat dan satu
pasang basa yang disebut nukleotida. Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi
genetik dan bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan.
Genom adalah set lengkap materi genetic (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan
terorganisasi menjadi kromosom. DNA dapat diisolasi, baik dari sel hewan, manusia, maupun
pada tumbuhan. DNA manusia dapat diisolasi melalui darah. Darah manusia terdiri atas
plasma darah, globules lemak, substansi kimia (karbohidrat, protein dan hormon), dan gas
(oksigen, nitrogen dan karbon dioksida). Plasma darah terdiri atas eritrosit (sel darah merah),
leukosit (sel darah putih) dan trombosit (platelet). Komponen darah yang diisolasi yaitu sel
darah putih. Sel darah putih dijadikan pilihan karena memiliki nukleus, dimana terdapat DNA
di dalamnya. DNA pada tumbuhan juga dapat diisolasi, contohnya pada tumbuhan bawang
merah (Allium cepa) dan pada pisang (Musa sp.). Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan,
yaitu:
(1)Isolasi sel
(2)Lisis dindingdan membran sel
(3)Ekstraksi dalamlarutan
(4)Purifikasi dan
(5)Presipitasi.
Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan presipitasi.
Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul
dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di
dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi
tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan
yang bervariasi, contohnya 2500 rpm (rotation per minute) atau 3000 rpm.
Isolasi DNA/RNA merupakan langkah awal yang harus dikerjakan dalam rekayasa
genetika sebelum melangkah ke proses selanjutnya. Prinsip dasar isolasi total DNA/RNA dari
jaringan adalah dengan memecah dan mengekstraksi jaringan tersebut sehingga akan
terbentuk ekstrak sel yang terdiri atas sel-sel jaringan, DNA, dan RNA. Kemudian ekstrak sel
dipuri-fikasi sehingga dihasilkan pelet sel yang mengandung DNA/RNA total. Prinsip-prinsip
isolasi DNA plasmid hampir sama dengan isolasi total DNA/RNA dari jaringan. Langkah
pertama untuk mendapatkan DNA plasmid adalah dengan menumbuhkan sel-sel bakteri yang
mengandung plasmid rekombinan. Setelah itu sel dipanen, dinding serta membran sel dipecah
sehingga isi sel (ekstrak sel) keluar. Ekstrak sel ini kemudian dipurifikasi dengan serangkaian
perlakuan sehingga diperoleh DNA plasmid yang murni. Isolasi DNA yang dilakukan dalam
penelitian ini menurut standar prosedur yang sudah biasa dilaksanakan. Homogenisasi sel
dengan prosedur ini akan menghasilkan DNA utuh karena proses ini menyebabkan disrupsi
sel dan tercucinya komponen-komponen sel lain selain DNA. Penambahan kloroform setelah
sentrifugasi memisahkan larutan menjadi fase cair dan padat dimana fase cair merupakan
DNA dan fase padat adalah campuran protein dan DNA.

2.2. PCR (Polymerase Chain Reaction)
Reaksi Polimerase Berantai atau dikenal sebagai Polymerase Chain Reaction (PCR),
merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk mengamplifikasi nukleotida secara in vitro.
Metoda PCR dapat meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah
semula, sekitar 10
6
-10
7
kali. Setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi
dua kali jumlahnya. Pada setiap n siklus PCR akan diperoleh 2
n
kali banyaknya DNA target.
Kunci utama pengembangan PCR adalah menemukan bagaimana cara amplifikasi hanya pada
urutan DNA target dan meminimalkan amplifikasi urutan non-target.
Penggunaan PCR telah berkembang secara cepat seirama dengan perkembangan biologi
molekuler. PCR digunakan untuk identifikasi penyakit genetik, infeksi oleh virus, diagnosis
dini penyakit seperti AIDS, Genetic profiling in forensic, legal and bio-diversity
applications, biologi evolusi, Site-directed mutagenesis of genes dan mRNA Quantitation di
sel ataupun jaringan.
2.2.1. Teknik Dasar Amplifikasi PCR
Penemuan awal dari teknik PCR didasarkan pada tiga waterbaths yang mempunyai
temperatur yang berbeda. Thermal-cycler pertama kali dipublikasikan pada tahun 1986, akan
tetapi DNA polymerase awal yang digunakan masih belum thermostable, dan harus
ditambahkan disetiap siklusnya. Kelemahan lain temperature 37C yang digunakan bias dan
menyebabkan non-specific priming, sehingga menghasilkan produk yang tidak
dikehendaki. Taq DNA polymerase yang diisolasi dari bakteri Thermus
aquaticus (Taq) dikembangkan pada tahun 1988. Ensim ini tahan sampai temperature
mendidih 100C, dan aktifitas maksimal pada temperatur 92-95C.
Proses PCR merupakan proses siklus yang berulang meliputi denaturasi, annealing dan
ekstensi oleh enzim DNA polimerase. Sepasang primer oligonukleotida yang spesifik
digunakan untuk membuat hibrid dengan ujung-5 menuju ujung-3 untai DNA target dan
mengamplifikasi untuk urutan yang diinginkan. Dasar siklus PCR ada 30-35 siklus meliputi:
denaturation (95C), 30 detik
annealing (5560C), 30 detik
extension (72C), waktu tergantung panjang pendeknya ukuran DNA yang diinginkan
sebagai produk amplifikasi.
Peningkatan jumlah siklus PCR diatas 35 siklus tidak memberikan efek yang positif, seperti
yang terlihat pada gambar1B

Gambar1. Siklus dasar PCR. A. Sistem tiga temperatur yang berbeda. B. Kenaikan hasil amplifikasi
menunjukkan pertumbuhan sigmoid.
2.2.2. Denaturasi untai ganda DNA
Denaturasi untai ganda DNA merupakan langkah yang kritis selama proses PCR.
Temperatur yang tinggi pada awal proses menyebabkan pemisahan untai ganda DNA.
Temperatur pada tahap denaturasi pada kisaran 92-95C, suhu 94C merupakan pilihan
standar.

Gambar2. Reaksi skematis proses amplifikasi.

Temperatur denaturasi yang tinggi membutuhkan kandungan GC yang tinggi dari DNA
template, tetapi half-life dari Taq DNA Polymerase menekan secara tajam pada temperatur
sekitar 95C.

2.2.3. Primer Annealing
Primer Annealing, pengenalan (annealing) suatu primer terhadap DNA
target tergantung pada panjang untai, banyaknya kandungan GC, dan konsentrasi primer itu
sendiri. Optimalisasi temperatur annealing dimulai dengan menghitung Melting
Temperature (Tm) dari ikatan primer dan DNA template. Cara termudah menghitung untuk
mendapatkan melting-temperatur yang tepatmenggunakan rumus Tm = {(G+C)x4} +{
(A+T)x2}. Rumus standar dapat dilihat di subbab primer pada komponen PCR. Sedang
temperatur annealing biasanya 5C ddibawah Tm primer yang sebenarnya. Secara praktis, Tm
ini dipengaruhi oleh komponen buffer, konsentrasi primer dan DNA template

Gambar3. Optimalisasi Temperatur Annealing. Primer dikalkulasi untuk
menentukan annealing temperature (misal 54C). Temperature must be confirmed practically
dengan menggunakan gradient cycler. Step temperature berjarak 2C per gradient analysis.
Amplifikasi akan lebih effisien bila temperatur annealing tidak kurang dari 37C agar
tidak terjadi mispriming. Oleh karena itu, pada temperatur sekitar 55C akan dihasilkan
amplifikasi produk yang mempunyai spesifitas yang tinggi. Penyusunan primer dapat dilihat
disubbab primer dari komponen primer. Primer ini akan menempel pada urutan nukleotida
yang sesuai dengan urutan primer itu sendiri, dan menempel pada posisi ujung-5 dari untai
DNA target yang telah terurai pada proses sebelumnya.
2.2.4. DNA Polymerase extension
Pada tahap extension ini terjadi proses pemanjangan untai baru DNA, dimulai dari posisi
primer yang telah menempel di urutan basa nukleotida DNA target akan bergerak dari ujung
5 menuju ujung 3 dari untai tunggal DNA. Proses pemanjangan atau pembacaan informasi
DNA yang diinginkan sesuai dengan panjang urutan basa nukleotida yang ditargetkan. Pada
setiap satu kilobase (1000bp) yang akan diamplifikasi memerlukan waktu 1 menit. Sedang
bila kurand dari 500bp hanya 30 detik dan pada kisaran 500 tapi kurang dari 1kb perlu waktu
45 detik, namun apabila lebih dari 1kb akan memerlukan waktu 2 menit di setiap siklusnya
(lihat contoh pada tabel 2). Adapun temperatur ekstensi berkisar antara 70-72C.

Pada reaksi PCR diperlukan DNA template, primer spesifik, ensim DNA polimerase
yang thermostabil, buffer PCR, ion Mg
2+
, dan thermal cycler.
2.2.5. Template DNA
Ukuran target amplifikasi biasanya kurang dari 1000 pasangan basa (bp) atau 1KB, Hasil
amplifikasi yang efisien antara 100-400bp. Walaupun kemungkinan hasil amplifikasi lebih
dari 1 kB tetapi prosesnya kurang efisien, karena produk yang panjang rentan terhadap
inhibitor yang mempengaruhi kerja ensim DNA polymerase dan waktu yang diperlukan lebih
lama. Hal ini dapat menyebabkan hasil amplifikasi yang tidak diinginkan.
Kemurnian DNA target sangat penting, karena ketidakmurnian suspensi DNA dapat
mempengaruhi reaksi amplifikasi dan dapat menghambat kerja ensim DNA polymerase.
Meskipun demikian, pada kondisi tertentu amplifikasi PCR masih dapat bekerja dalam
suspensi kasar, seperti koloni bakteri. Bakteri tidak perlu diekstraksi dan secara langsung
dicampurkan pada PCR mix solutionsebagai template.
Pemilihan target yang akan diamplifikasi perlu memperhatikan kestabilan genetik dari
daerah/urutan nukleotida yang ditargetkan. Perubahan atau hilangnya sebagian urutan target
akan berakibat hilangnya reaktivitas. Bagian dari plasmid yang membawa sifat virulensi
suatu bakteri adalah salah satu contoh elemen genetik yang potensial tidak stabil. Elemen
genetik ini bisa hilang waktu isolai atau pemindahan serial. Untuk mengatasi hal ini
sebaiknya amplifikasi segera dilakukan setelah isolasi DNA selesai.
2.2.6. Primers
Primer disusun dari sintesis oligonukleotida sepanjang 15-32bp dan primer ini harus
mampu mengenali urutan yang akan diamplifikasi. Untuk standar amplifikasi sepasang
primer akan mempunyai kisaran pasangan basa sekitar 20 basa panjangnya pada tiap
primernya. Kandungan GC harus antara 45-60%. Annealing temperatur antara primer yang
digunakan harus berkisar antara 1C. Ujung 3 dari setiap primer harus G atau C, akan tetapi
hindari susunan nukleotida G/C berturut-turut tiga pada ujung ini, misal CCG, GCG, GGC,
GGG, CCC, GCC. Pada penentuan atau penyusunan sepasang primer, penting diperhatikan
urutan primer tidak saling komplementer sehingga membentuk dimer-primers, berikatan satu
sama lain, atau membentukhairpins. Hal lainnya hindari menyusun primer pada daerah DNA
repetitif. Selain itu, faktor homologi urutan nukleotida dengan urutan DNA target sangat
mempengaruhi kestabilan ikatan keduanya. Semakin tinggi prosentase homologi semakin
stabil ikatan yang terbentuk.
5-ACCGGTAGCCACGAATTCGT-3
| | | | | | | | | |
3-TGCTTAAGCACCGATGGCCA-5

Gambar4. Bentuk dimer-primer dari sepasang primer
Temperatur annealing sangat tergantung pada primer dengan Tm yang tertentu. Penentuan
formula primer ditentukan secara teoritikal oleh Tm asam nukleat. Formula di bawah ini
dapat digunakan untuk mengestimasi titik Tm untuk oligonucleotida primer yang diinginkan:
Tm = 81.5 + 16.6 x (log10[Na
+
]) + 0.41 x 9%G+C) -675/n
Dimana [Na
+
] adalah konsentrasi molar garam, [Na
+
]=[K
+
]; dan n= jumlah basa dalam
oligonukleotida.
2.2.7. Taq DNA polymerase
Enzim ini bersifat thermostabil dan diisolasi dari Thermus aquaticus. Aktivitas
polimerisasi DNAnya dari ujung-5 ke ujung-3 dan aktivitas enzimatik ini mempunyai
waktu paruh sekitar 40 menit pada 95C. Biasanya untuk setiap 100l volume reaksi
ditambahkan 2.0-2.5 unit Taq polymerase. Penggunaan enzim ini harus diperhatikan proses
penyimpanan (selalu di freezer -20C) dan juga pada saat pengambilan tidak boleh terlalu
lama di temperatur ruang, usahakan selalu dalam kotak berisi water-ice. Hal ini dilakukan
untuk meminimalkan kerusakan enzim yang mungkin terjadi akibat pengaruh perubahan
temperatur. Taq DNA polymerase yang digunakan dalam PCR adalah milik paten asli dari
perusahaan Promega. Walaupun pada saat ini telah banyak dikembangkan oleh perusahaan
yang lain.
2.2.8. PCR buffer dan konsentrasi Mg2+
Buffer standar untuk PCR tersusun atas 50mM KCl, 10mM Tris-Cl (pH8.3) dan 1.5mM
MgCl
2
. Buffer standard ini akan bekerja dengan baik untuk DNA template dan primer dengan
kondisi tertentu, tetapi mungkin tidak optimum dengan kombinasi yang lain. Produk PCR
buffer ini terkadang dijual dalam bentuk tanpa atau dengan MgCl
2
.
Konsentrasi ion magnesium dalam PCR buffer merupakan faktor yang sangat kritikal,
karena kemungkinan dapat mempengaruhi proses annealing primer, temperatur dissosiasi
untai DNA template, dan produk PCR. Hal ini disebabkan konsentrasi optimal ion Mg
2+
itu
sangat rendah. Hal ini penting untuk preparasi DNA template yang tidak mengandung
konsentrasi chelating agent yang tinggi, seperti EDTA atau phosphat. Ion Mg
2+
yang bebas
bila terlalu rendah atau tidak ada, maka biasanya tidak menghasilkan produk akhir PCR,
sedang bila terlalu banyak ion Mg
2+
yang bebas akan menghasilkan produk PCR yang tidak
diinginkan. Penentuan kisaran konsentrasi Mg
2+
dapat dilihat pada gambar 5, pada setiap step
bervariasi berjarak0.5 mM.
2.2.9. Nucleotides (dNTPs)
Konsentrasi yang biasanya digunakan untuk setiap dNTP adalah 200 M.Pada
konsentrasi ini penting untuk mengatur konsentrasi ke-empat dNTP pada titik estimasi Km
untuk setiap dNTP. 50mM, harus selalu diatur pH7.0. Konsentrasi yang tinggi akan
menimbulkan ketidakseimbangan dengan enzim polymerase. Sedang pada konsentrasi rendah
akan memberikan ketepatan dan spesifitas yang tinggi tanpa mereduksi hasil akhir. Total
konsentrasi dNTP dan ion saling terkait dan tidak akan merubah secara bebas.

2.2.10. PCR Thermal Cycler
PCR thermal cycler pertama kali dikembangkan oleh perusahaanPerkinElmer sebagai
pemegang paten asli. Pada saat ini telah diproduksi berbagai macam tipe alat PCR thermal
cycler ini dari berbagai perusahaan yang bergerak dalam bioteknologi. Walaupun nama
masing-masing alat itu berbeda tetapi prinsip kerjanya sama.

Gambar6. PCR thermal cycler multi-block system
Alat ini secara tepat meregulasi temperatur dan siklus waktu yang dibutuhkan untuk
reprodusibilitas dan keakuratan reaksi amplifikasi. Seperti telah disebutkan di atas, siklus
PCR terbagi atas tiga step utama yaitu DNA denaturation (92-95C, selama 30-60 detik),
primer annealing (50-64C, selama 60-120 detik), dan extention (70-72C, selama 30-120
detik). Siklus ini berulang 20-35 kali. Siklus utama ini diawali terlebih dahulu oleh
dengan hot-start misal 94C selama 5 menit (lihat tabel 2 diatas). Langkah ini dilakukan
untuk memaksimalkan proses denaturasi DNA template, karena apabila denaturasi tidak
sempurna akan menyebabkan kegagalan proses PCR. Setelah siklus utama berakhir, maka
ditambah program final extension dengan temperatur 70-72C selama 7-10 menit.
2.3. Bioinformatika
2.3.1. Pengertian Bioinformatika
Bioinformatika adalah ilmu yang mempelajari penerapan tekhnik komputasional untuk
mengelola dan menganalisis informasi biologi. Bidang ini mencakup penerapan metode-
metode matematika, statiska, dan informatika untuk memecahkan masalah-masalah biologis,
terutama dengan menggunakan sekuens DNA dan asam amino serta informasi yang berkaitan
dengannya. Contoh topik uttama bidang ini meliputi basis data untuk mengelola informasi
biologis, penyejajaran sekuens, prediksi struktur untuk meramalakan bentuk struktur protein
maupun struktur sekunder RNA, analisis filogenetik, dan analisis ekspresi gen
2.3.2. Sejarah Bioinformatika
Istilah bioinformatika mulai dikemukakan pada pertengan era 1980-an untuk mengacu
pada penerapan komputer dalam biologi. namun demikian, penerapan bidang-bidang dalam
bioinformatika seperti pada pembuatan basis data dan pengembangan algoritma untuk
analisis sekuens biologis sudah dilakukan sejak tahun 1960-an Kemajuan tekhnik biologi
molekular dalam mengungkap sekuens biologis dari protein awal 1950-an dan asam nukleat
sejak 1960-an mengawali perkembangan basis data dan tekhnik analisis sekuens biologis.
Basis data sekuens protein mulai dikembangkan pada tahin 1960-an di Amerika Serikat,
sementara basis data sekuens DNA dikembangkan pada 1970-an di Amerika Serikat dan
Jerman. Penemuan tekhnik sekuensing DNA yang lebih cepat pada pertengahan 1970-an
menjadi landasan terjadinya ledakkan jumlah sekuens DNA yang berhasil diungkapkan pada
1980-an dan 1990-an, menjadi salah satu pembuka jalan baig proyek-proyek pengungkapan
genom, meningkatkan kebutuhan akan pengelolaan dan analisis sekuens, dan pada akhirnya
menyebabkan lahirnya bioinformatika. Perkembangan internet juga mendukung
berkembangnya bioinformatika. Basis data bioinformatika yang terhubung melalui internet
memudahkan ilmuwan hasil sekuensing ke dalam basis dara tersebut mauoun memperoleh
sekuens biologis sebagai bahan analisis. Selain itu, penyebaran program-program aplikasi
bioinformatika melalui internet memudahkan ilmuwan mengakses program-program tersebut
dan kemudian memudahkan pengembangannya.
2.3.3. Penerapan utama bioinformatika
Sesuai dengan jenis informasi biologis yang disimpanya, basis data sekuens biologis
berupa basis data primer asam nukleat maupun protein, basis data sekunder untuk
menyimpan motif sekuens protein, dan basis data struktur untuk menyimpan data struktur
protein maupun asam nukleat. Basis data utama untuk sekuens asam nukleat saat ini adalah
GenBank (Amerika Serikat), EMBL (Eropa), dan DDBJ(en) (DNA Data Bank of Japan,
Jepang). Ketiga basis data tersebut bekerja sama dan bertukar data secara harian untuk
menjaga keluasan cakupan masing-masing basis data. Sumber utama data sekuens asam
nukleat adalah submisi langsung dari periset individual, proyek sekuensing genom, dan
pendaftaran paten. Selain berisi sekuens asam nukleat, entri dalam basis data sekuens asam
nukleat umumnya mengandung informasi tentang jenis asam nukleat (DNA atau RNA),
nama organisme sumber asam nukleat tersebut, dan pustaka yang berkaitan dengan sekuens
asam nukleat tersebut.

Sementara itu, contoh beberapa basis data penting yang menyimpan sekuens primer
protein adalah PIR (Protein Information Resource, Amerika Serikat), Swiss-Prot (Eropa), dan
TrEMBL (Eropa). Ketiga basis data tersebut telah digabungkan dalam UniProt (yang didanai
terutama oleh Amerika Serikat). Entri dalam UniProt mengandung informasi tentang sekuens
protein, nama organisme sumber protein, pustaka yang berkaitan, dan komentar yang
umumnya berisi penjelasan mengenai fungsi protein tersebut.

BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) merupakan perkakas bioinformatika
yang berkaitan erat dengan penggunaan basis data sekuens biologis. Penelusuran BLAST
(BLAST search) pada basis data sekuens memungkinkan ilmuwan untuk mencari sekuens
asam nukleat maupun protein yang mirip dengan sekuens tertentu yang dimilikinya. Hal ini
berguna misalnya untuk menemukan gen sejenis pada beberapa organisme atau untuk
memeriksa keabsahan hasil sekuensing maupun untuk memeriksa fungsi gen hasil
sekuensing. Algoritma yang mendasari kerja BLAST adalah penyejajaran sekuens.

PDB (Protein Data Bank, Bank Data Protein) adalah basis data tunggal yang
menyimpan model struktural tiga dimensi protein dan asam nukleat hasil penentuan
eksperimental (dengan kristalografi sinar-X, spektroskopi NMR dan mikroskopi elektron).
PDB menyimpan data struktur sebagai koordinat tiga dimensi yang menggambarkan posisi
atom-atom dalam protein ataupun asam nukleat.

2.3.4. Penyejajaran Sekuens
Penyejajaran sekuens (sequence alignment) adalah proses penyusunan/pengaturan dua
atau lebih sekuens sehingga persamaan sekuens-sekuens tersebut tampak nyata. Hasil dari
proses tersebut juga disebut sebagai sequence alignment atau alignment saja. Baris sekuens
dalam suatu alignment diberi sisipan (umumnya dengan tanda "") sedemikian rupa sehingga
kolom-kolomnya memuat karakter yang identik atau sama di antara sekuens-sekuens
tersebut. Berikut adalah contoh alignment DNA dari dua sekuens pendek DNA yang berbeda,
"ccatcaac" dan "caatgggcaac" (tanda "|" menunjukkan kecocokan atau match di antara kedua
sekuens).

Sequence alignment merupakan metode dasar dalam analisis sekuens. Metode ini
digunakan untuk mempelajari evolusi sekuens-sekuens dari leluhur yang sama (common
ancestor). Ketidakcocokan (mismatch) dalam alignment diasosiasikan dengan proses mutasi,
sedangkan kesenjangan (gap, tanda "") diasosiasikan dengan proses insersi atau delesi.
Sequence alignment memberikan hipotesis atas proses evolusi yang terjadi dalam sekuens-
sekuens tersebut. Misalnya, kedua sekuens dalam contoh alignment di atas bisa jadi
berevolusi dari sekuens yang sama "ccatgggcaac". Dalam kaitannya dengan hal ini, alignment
juga dapat menunjukkan posisi-posisi yang dipertahankan (conserved) selama evolusi dalam
sekuens-sekuens protein, yang menunjukkan bahwa posisi-posisi tersebut bisa jadi penting
bagi struktur atau fungsi protein tersebut.

Selain itu, sequence alignment juga digunakan untuk mencari sekuens yang mirip atau
sama dalam basis data sekuens. BLAST adalah salah satu metode alignment yang sering
digunakan dalam penelusuran basis data sekuens. BLAST menggunakan algoritma heuristik
dalam penyusunan alignment. Beberapa metode alignment lain yang merupakan pendahulu
BLAST adalah metode "Needleman-Wunsch" dan "Smith-Waterman". Metode Needleman-
Wunsch digunakan untuk menyusun alignment global di antara dua atau lebih sekuens, yaitu
alignment atas keseluruhan panjang sekuens tersebut. Metode Smith-Waterman
menghasilkan alignment lokal, yaitu alignment atas bagian-bagian dalam sekuens. Kedua
metode tersebut menerapkan pemrograman dinamik (dynamic programming) dan hanya
efektif untuk alignment dua sekuens (pairwise alignment)

Clustal adalah program bioinformatika untuk alignment multipel (multiple alignment),
yaitu alignment beberapa sekuens sekaligus. Dua varian utama Clustal adalah ClustalW dan
ClustalX. Metode lain yang dapat diterapkan untuk alignment sekuens adalah metode yang
berhubungan dengan Hidden Markov Model ("Model Markov Tersembunyi", HMM). HMM
merupakan model statistika yang mulanya digunakan dalam ilmu komputer untuk mengenali
pembicaraan manusia (speech recognition). Selain digunakan untuk alignment, HMM juga
digunakan dalam metode-metode analisis sekuens lainnya, seperti prediksi daerah pengkode
protein dalam genom dan prediksi struktur sekunder protein.

2.3.5. Prediksi Struktur Protein
Secara kimia/fisika, bentuk struktur protein diungkap dengan kristalografi sinar-X
ataupun spektroskopi NMR, namun kedua metode tersebut sangat memakan waktu dan relatif
mahal. Sementara itu, metode sekuensing protein relatif lebih mudah mengungkapkan
sekuens asam amino protein. Prediksi struktur protein berusaha meramalkan struktur tiga
dimensi protein berdasarkan sekuens asam aminonya (dengan kata lain, meramalkan struktur
tersier dan struktur sekunder berdasarkan struktur primer protein). Secara umum, metode
prediksi struktur protein yang ada saat ini dapat dikategorikan ke dalam dua kelompok, yaitu
metode pemodelan protein komparatif dan metode pemodelan de novo.

Pemodelan protein komparatif (comparative protein modelling) meramalkan struktur
suatu protein berdasarkan struktur protein lain yang sudah diketahui. Salah satu penerapan
metode ini adalah pemodelan homologi (homology modelling), yaitu prediksi struktur tersier
protein berdasarkan kesamaan struktur primer protein. Pemodelan homologi didasarkan pada
teori bahwa dua protein yang homolog memiliki struktur yang sangat mirip satu sama lain.
Pada metode ini, struktur suatu protein (disebut protein target) ditentukan berdasarkan
struktur protein lain (protein templat) yang sudah diketahui dan memiliki kemiripan sekuens
dengan protein target tersebut. Selain itu, penerapan lain pemodelan komparatif adalah
protein threading yang didasarkan pada kemiripan struktur tanpa kemiripan sekuens primer.
Latar belakang protein threading adalah bahwa struktur protein lebih dikonservasi daripada
sekuens protein selama evolusi; daerah-daerah yang penting bagi fungsi protein
dipertahankan strukturnya. Pada pendekatan ini, struktur yang paling kompatibel untuk suatu
sekuens asam amino dipilih dari semua jenis struktur tiga dimensi protein yang ada. Metode-
metode yang tergolong dalam protein threading berusaha menentukan tingkat kompatibilitas
tersebut.

Dalam pendekatan de novo atau ab initio, struktur protein ditentukan dari sekuens
primernya tanpa membandingkan dengan struktur protein lain. Terdapat banyak
kemungkinan dalam pendekatan ini, misalnya dengan menirukan proses pelipatan (folding)
protein dari sekuens primernya menjadi struktur tersiernya (misalnya dengan simulasi
dinamika molekular), atau dengan optimisasi global fungsi energi protein. Prosedur-prosedur
ini cenderung membutuhkan proses komputasi yang intens, sehingga saat ini hanya
digunakan dalam menentukan struktur protein-protein kecil. Beberapa usaha telah dilakukan
untuk mengatasi kekurangan sumber daya komputasi tersebut, misalnya dengan
superkomputer (misalnya superkomputer Blue Gene dari IBM) atau komputasi terdistribusi
(distributed computing, misalnya proyek Folding@home) maupun komputasi grid.

2.3.6. Analisis ekspresi gen
Ekspresi gen dapat ditentukan dengan mengukur kadar mRNA dengan berbagai macam
teknik (misalnya dengan microarray ataupun Serial Analysis of Gene Expression ["Analisis
Serial Ekspresi Gen", SAGE]). Teknik-teknik tersebut umumnya diterapkan pada analisis
ekspresi gen skala besar yang mengukur ekspresi banyak gen (bahkan genom) dan
menghasilkan data skala besar. Metode-metode penggalian data (data mining) diterapkan
pada data tersebut untuk memperoleh pola-pola informatif. Sebagai contoh, metode-metode
komparasi digunakan untuk membandingkan ekspresi di antara gen-gen, sementara metode-
metode klastering (clustering) digunakan untuk mempartisi data tersebut berdasarkan
kesamaan ekspresi gen.

2.4. Isolasi Genom DNA
Isolasi DNA/RNA merupakan langkah awal yang harus dikerjakan dalam rekayasa
genetika sebelum melangkah ke proses selanjutnya. Prinsip dasar isolasi total DNA/RNA dari
jaringan adalah dengan memecah dan mengekstraksi jaringan tersebut sehingga akan
terbentuk ekstrak sel yang terdiri atas sel-sel jaringan, DNA, dan RNA. Kemudian ekstrak sel
dipuri-fikasi sehingga dihasilkan pelet sel yang mengandung DNA/RNA total. Prinsip-prinsip
isolasi DNA plasmid hampir sama dengan isolasi total DNA/RNA dari jaringan. Langkah
pertama untuk mendapatkan DNA plasmid adalah dengan menumbuhkan sel-sel bakteri yang
mengandung plasmid rekombinan. Setelah itu sel dipanen, dinding serta membran sel dipecah
sehingga isi sel (ekstrak sel) keluar. Ekstrak sel ini kemudian dipurifikasi dengan serangkaian
perlakuan sehingga diperoleh DNA plasmid yang murni. Isolasi DNA yang dilakukan dalam
penelitian ini menurut standar prosedur yang sudah biasa dilaksanakan. Homogenisasi sel
dengan prosedur ini akan menghasilkan DNA utuh karena proses ini menyebabkan disrupsi
sel dan tercucinya komponen-komponen sel lain selain DNA. Penambahan kloroform setelah
sentrifugasi memisahkan larutan menjadi fase cair dan padat dimana fase cair merupakan
DNA dan fase padat adalah campuran protein dan DNA.
2.5. Electrophoresis
Istilah elektroforesis digunakan untuk menggambarkan migrasi partikel bermuatan
di bawah pengaruh medan listrik. Dengan demikian elektroforesis gel mengacu adalah teknik
di mana molekul dipaksa di rentang gel, didorong oleh arus listrik. Pada kedua ujung gel
terdapat elektroda diaktifkan yang menyediakan pendorong utama. Oleh karena itu sifat
molekul khususnya milik kelompok ionisable, menentukan seberapa cepat medan listrik
dapat menggerakkan molekul melalui media agar-agar.
Pada proses elektroforesis kapiler, produk-produk reaksi cycle sequencingdiinjeksikan secara
elektrokinetik ke dalam kapiler yang diisi dengan polimer. Dengan diberikannya tegangan
listrik tinggi maka fragmen DNA yang bermuatan negatif akan bergerak melalui polimer di
dalam kapiler menuju elektroda positif. Dengan diberikannya tegangan listrik tinggi maka
fragmen DNA yang bermuatan negatif akan bergerak melalui polimer di dalam kapiler
menuju elektroda positif (gambar 4). Elektroforesis kapiler dapat memisahkan molekul DNA
yang memiliki perbedaan bobot molekul hanya satu nukleotida.

Salah satu aplikasi yang sangat penting bagi elektroforesis gel dalam DNA Teknologi.
Bioteknologi telah selama ribuan tahun telah digunakan oleh orang yang telah menggunakan
ragi untuk membuat tepung menjadi roti dan anggur menjadi anggur. Kami sekarang
menggunakan bioteknologi untuk mempelajari proses dasar kehidupan, diagnosa penyakit,
dan mengembangkan pengobatan baru untuk penyakit. Beberapa alat bioteknologi merupakan
komponen alami dari sel-sel. Sebagai contoh enzim restriksi yang dibuat oleh bakteri untuk
melindungi diri dari virus. Mereka membunuh DNA virus oleh pemotongan itu di tempat-
tempat tertentu. DNA ligase adalah suatu enzim yang ada di semua sel dan bertanggung
jawab untuk bergabung bersama untai DNA. enzim restriksi dapat digunakan untuk
memotong DNA pada urutan tertentu disebut situs pengakuan. Mereka kemudian bergabung
dengan alur dipotong dengan DNA ligase untuk kombinasi baru dari gen. DNA rekombinan
urutan mengandung gen dari dua atau lebih organisme.

Teknik ini telah memungkinkan peneliti untuk mendapatkan kemampuan untuk
mendiagnosa penyakit seperti anemia sel sabit, cystic fibrosis, dan chorea Huntington pada
awal perjalanan penyakit ini. Banyak peneliti juga menerapkan teknik-teknik bioteknologi
untuk menemukan pengobatan baru untuk penyakit genetik. teknologi DNA telah memicu
kemajuan penelitian di hampir semua bidang biologi. Saat ini ratusan produk yang
bermanfaat yang dihasilkan oleh rekayasa genetika. Hal ini telah menjadi rutin untuk
menggabungkan gen dari sumber yang berbeda, spesies biasanya berbeda - dalam tabung
reaksi, dan kemudian transfer ini DNA rekombinan ke sel-sel hidup di tempat yang dapat
direplikasi dan diekspresikan. Prestasi yang paling penting yang dihasilkan dari teknologi
DNA rekombinan telah kemajuan dalam pemahaman dasar kita tentang biologi molekular
eukariotik. Misalnya, hanya melalui penggunaan teknik gen-splicing memiliki rincian
eukaryotics pengaturan gen dan peraturan telah dibuka untuk analisis eksperimental.

Elektroforesis gel adalah salah satu alat pokok dalam biologi molekular dan nilai penting
dalam banyak aspek manipulasi genetik dan belajar. Salah satu penggunaan adalah
identifikasi molekul DNA tertentu oleh pola band mereka menghasilkan dalam elektroforesis
gel setelah dipotong dengan berbagai enzim restriksi. Viral DNA, DNA plasmid, dan segmen
tertentu DNA kromosom semua dapat diidentifikasi dengan cara ini. Penggunaan lainnya
adalah isolasi dan pemurnian fragmen individu yang mengandung gen menarik, yang dapat
pulih dari gel dengan penuh aktivitas biologis. Gel elektroforesis memungkinkan untuk
menentukan perbedaan genetik dan hubungan evolusi di antara spesies tanaman dan hewan.
Menggunakan teknologi ini adalah mungkin untuk memisahkan dan mengidentifikasi
molekul protein yang berbeda dengan sesedikit asam amino tunggal.
Gel Elektroforesis adalah proses di mana molekul (seperti protein, DNA, atau fragmen
RNA) dapat dipisahkan menurut ukuran dan muatan listrik dengan menerapkan arus listrik
kepada mereka. Pasukan saat ini molekul-molekul melalui pori-pori di dalam lapisan tipis
gel, sebuah perusahaan substansi seperti jelly. Gel dapat dibuat sedemikian rupa sehingga
pori-pori yang hanya dimensi yang tepat untuk memisahkan molekul-molekul dalam jarak
tertentu dari ukuran dan bentuk. fragmen yang lebih kecil biasanya perjalanan lebih jauh
daripada yang besar. Proses ini terkadang disebut elektroforesis gel. .

elektroforesis gel agarosa adalah metode yang digunakan dalam biokimia dan biologi
molekuler untuk memisahkan populasi campuran DNA dan RNA dengan fragmen panjang,
atau protein yang terpisah oleh muatan [1] molekul asam nukleat. dipisahkan dengan
menerapkan medan listrik untuk memindahkan bermuatan negatif molekul melalui agarosa
matriks. molekul yang lebih pendek bergerak lebih cepat dan bermigrasi jauh dari yang lama
karena molekul-molekul yang lebih pendek lebih mudah bermigrasi melalui pori-pori gel.
Fenomena ini disebut pemisahan. [2] Protein dipisahkan oleh muatan dalam agarosa karena
pori-pori gel terlalu besar untuk saringan protein.
Estimasi ukuran molekul DNA berikut restriksi enzim pencernaan, misalnya pembatasan
dalam pemetaan DNA kloning. Analisis produk PCR, misalnya dalam diagnosis genetika
molekuler atau genetik fingerprinting
Pemisahan DNA genomik Selatan dibatasi sebelum transfer, atau RNA sebelum mentransfer
Utara.
gel agarosa mudah cor dan ditangani dibandingkan dengan matriks lain dan asam nukleat
tidak kimia diubah selama elektroforesis. Sampel juga mudah ditemukan. Setelah percobaan
selesai, gel yang dihasilkan dapat disimpan dalam sebuah kantong plastik di kulkas. Ada
batas untuk teknik elektroforesis. Sejak saat melewati gel menyebabkan pemanasan, gel bisa
meleleh selama elektroforesis. Elektroforesis dilakukan dalam larutan buffer untuk
mengurangi perubahan pH karena medan listrik, yang penting karena muatan DNA dan RNA
tergantung pada pH, tetapi berjalan terlalu lama dapat menghabiskan kapasitas buffering dari
solusi. Selanjutnya, berbagai persiapan bahan genetik tidak dapat bermigrasi secara konsisten
satu sama lain, untuk alasan morfologi atau lainnya. Sunting Faktor-faktor yang
mempengaruhi migrasi asam nukleat

Faktor paling penting adalah panjang dari molekul DNA, molekul kecil perjalanan
jauh. Tapi konformasi molekul DNA juga faktor. Untuk menghindari masalah ini molekul
linier biasanya dipisahkan, fragmen DNA biasanya dari pembatasan mencerna, linear DNA
produk PCR, atau RNA. Meningkatkan konsentrasi gel agarosa dari migrasi mengurangi
kecepatan dan memungkinkan pemisahan molekul DNA yang lebih kecil. Semakin tinggi
tegangan, semakin cepat bergerak DNA. Tapi tegangan dibatasi oleh fakta bahwa
memanaskan dan akhirnya menyebabkan gel mencair. Tegangan tinggi juga menurunkan
resolusi (di atas sekitar 5 sampai 8 / cm V).
Elektroforesis DNA 'digunakan untuk memisahkan fragmen DNA dengan ukuran.
Jenis gel paling sering digunakan untuk elektroforesis DNA agarosa (untuk molekul DNA
yang relatif besar) dan poliakrilamida (untuk resolusi tinggi fragmen DNA pendek). Yang
pertama juga kadang-kadang disebut sebagai kapal selam karena elektroforesis gel yang
terendam dalam buffer. The buffer digunakan untuk pemisahan adalah Tris-Borat-EDTA atau
Tris-Asetat-EDTA dan DNA bermigrasi relatif terhadap ukuran: kecil fragmen bergerak lebih
cepat melalui matriks gel dan fragmen yang bergerak lebih lambat. Setelah pemisahan, gel
dapat diwarnai atau ditransfer (Southern blotting). pemisahan DNA biasanya dideteksi
dengan pewarna yang mengikat ke molekul dan biasanya dilihat di bawah sinar UV. asam
nukleat dapat ditransfer dari gel matriks membran kapiler lembar melalui transfer atau listrik
untuk menyelidik.
DNA fragmen dalam kisaran 100 bp hingga 20 kb biasanya dipisahkan dalam gel agarosa
menggunakan gaya elektroforesis unit kapal selam. Hoefer menawarkan 8 ukuran unit kapal
selam untuk hasil cepat atau throughput tinggi.
2.6. Ekstraksi DNA
Ekstraksi DNA adalah langkah pertama yang sangat penting dalam langkah-langkah
kerja analisis DNA sequencing. Kualitas secara keseluruhan, akurasi dan panjang pembacaan
urutan basa DNA dapat dipengaruhi secara signifikan oleh karakter sample itu sendiri, dan
metode yang dipakai untuk ekstraksi DNA. Mengisolasi DNA dengan kualitas tinggi dari
berbagai jenis sample memiliki tantangan tersendiri, dan metode yang ideal akan beragam
bergantung pada jenis jaringan/tissue (termasuk darah), bagaimana ia diperoleh dari
sumbernya, dan bagaimana sample ditangani atau disimpan sebelum diekstrak. Metode untuk
isolasi asam nukleat sering dikerjakan menggunakan penghancuran mekanik atau metode
kimiawi, yang kadang-kadang juga terotomatisasi. Baik metode ekstraksi manual maupun
otomatis yang digunakan, kita harus berhati-hati untuk meminimalisir degradasi DNA,
dengan menghindari ekspos terhadap panas, cahaya, freeze-thaw yang berulang-ulang
dan vortex. Selanjutnya, laboratorium harus diatur sedemikian rupa untuk meminimalisir
kemungkinan kontaminasi silang diantara sample.
Sebuah sampel biologis dapat diperoleh dari suatu tindak kejahatan dalam bentuk
darah atau noda air mani atau darah segar dari seorang tersangka yang berisi beberapa unsur
di samping DNA. Molekul DNA harus dipisahkan dari materi sel lain sebelum diuji. Sel-sel
protein terbungkus melindungi DNA di dalam lingkungan sel dapat menghalangi kemampuan
analisa DNA.Sementara itu metode ekstrasi DNA dapat dikembangkan untuk memisahkan
protein-protein dan materi sel-sel yang lain dari molekul-molekul DNA. Sebagai tambahan
kuantitas dan kualitas DNA sering perlu diukur sebelum kelanjutan lebih lanjut dengan
prosedur analitis untuk memastikan hasil yang optimal. Ada tiga teknik utama yang
digunakan saat ini untuk ekstrasi DNA pada laboratorium forensik DNA: ektraksi organik,
ekstraksi Chelex, dan FTA paper (gambar 3.1). Ekstraksi eksak atau masam-macam prosedur
isolasi DNA tergantung pada bukti-bukti tipe biologis yang akan diuji. Sebagai contoh darah
utuh harus diperlakukan dengan cara yang berbeda dari suatu noda darah atau suatu fragmen
tulang.
Ekstraksi organik, kadang-kadang dikenal sebagai ekstraksi zat asam karbol
choloform, telah digunakan untuk waktu yang lama dan mungkin telah digunakan untuk
situasi di mana baik RFLP atau PCR dilakukan. Bobot molekular tinggi DNA, yang mana
penting bagi metoda RFLP, mungkin diperoleh secara paling efektif dengan ekstraksi
organik.
Metoda Chelex dari ekstraksi DNA lebih cepat dibandingkan dengan metode ekstraksi
organik. Sebagai tambahan, metoda Chelex membutuhkan lebih banyak langkah dan
kebanyakan langkah itu digunakan untuk mengkontaminasi sampel ke sampel.
Bagaimanapun hal itu menghasilkan DNA tunggal sebagai hasil proses ekstraksi dan oleh
karena itu hanya yang bermanfaat untuk prosedur pengujian yang berbasis PCR.
Semua contoh harus secara hati-hati ditangani dengan mengabaikan metoda ekstraksi
DNA untuk menghindari pencemaran sampel ke kesampel atau pengenalan tentang tambahan
DNA. Proses ekstraksi memungkinkan di mana contoh DNA jadi lebih peka pada
pencemaran di laboratorium dibanding pada waktu lain dalam proses analisa forensik DNA.
Dengan suatu alasan laboratorium-laboratorium biasa memproses sampel-sampel petunjuk
pada waktu yang berbeda dan kadang-kadang dengan loksi yang tidak sama dari dimana
sampel tersebut diambil.
Metoda yang populer untuk persiapan pengambilan referensi sampel adalah dengan
menggunakan noda darah dengan mengoleskannya ke kain kapas, dikenal dengan suatu
carikan, dengan menghasilkan bulatan kira-kira 1 cm
2
pada kain kapas tersebut, dengan rata-
rata 70.000-80.000 sel darah putih dan menghasilkan rata-rata 500ng DNA genomic. Hasil
nyata akan bervariasi dengan jumlah sel-sel darah putih yang akan menunjukkan sampel dan
efisiensi proses ekstraksi DNA.

Ekstraksi DNA disimpan secara khusus pda suhu -20
o
C, atau bahkan pada suhu -80
o
C
pada penyimpanan dalam waktu lama, untuk menjaga aktifitas inti. Nucleas-nucleas adalah
enzim-enzim (protein) yang diketemukan di dalam sel-sel turunan DNA untuk
memungkinkan pendauran ulang menyangkut komponen-komponen nucleotide. Nucleases
memerlukan magnesium untuk bekerja dengan baik sehingga salah satu pengujian untuk
mencegah mereka dari mencerna DNA di dalam darah adalah menggunakan tabung purple-
topped yang berisi bahan pengawet darah yang dikenal sebagai EDTA. EDTA meliputi, atau
membalut, semua magnesium bebas dengan begitu mencegah nucleases menhancurkan DNA
di dalam contoh darah yang dikumpulkan.

2.6.1. Ekstraksi Organik (Phenol-Cloroform)
Ekstraksi organik melibatkan penambahan beberapa bahan kimia. Pertama, sodium
Dodecylsulfate (SDS) dan Proteinase Kare ditambahkan untuk membuka dinding sel
sepanjang protein yang melindungi molekul DNA selagi mereka ada di dalam kromosom.
Selanjutnya campuranphenol/cloroform ditambahkan untuk memisahkan protein dari DNA.
DNA menjadi lebih dapat larut di dalam air yang mengandung campuran organic-aqueous.
Ketika proses sentrifuge, bekas peninggalan protein dan selular yang tak dikehendaki
dipisahkan dari tahap yang mengandung air dan menggandakan molekul DNA sehingga
dapat ditransfer dengan baik untuk dianalisa. Beberapa protokol melibatkan dialisa centricon
100 (Millipore, Billerica, MA) dan konsentrasi di tempat timbulnya ethanol dan untuk
memindahkan heme inhibitors (Comey et al 1994). Sementara metoda ekstraksi bekerja
dengan baik untuk recovery bobot DNA dengan molekul tinggi, ini adalah waktu
menggunakan bahan kimia yang penuh resiko dan memerlukan contoh untuk ditransfer antara
banyak tabung (faktanya ini menaikkan resiko kesalahan dan kontaminasi)
2.6.2. Proses Penarikan Chelex
Sebuah prosedur alternatif untuk penarikan DNA yang telah terkenal dikalangan ahli
forensik adalah penggunaan dari suspensi resin kombinasi yang dapat ditambahkan langsung
pada sampel (misalnya, darah, bercak darah, atau semen). Diperkenalkan kepada komunitas
forensik DNA pada tahun 1991, chelex
R
100 (Lab Bio-Rad, Hercules, CA) adalah pertukaran
ion resin yang ditambahkan sebagai suspensi pada beberapa sampel (Walsh et.al.1991).
chelex terdiri dari styrene divinylbenzene copolimers mengandung sepasang ion
iminodiacetate yang bereaksi sebagai grup-grup kombinasi dalam ikatan ion metal polivalen
seperti magnesium. Serupa dengan pengisian besi untuk menjadi sebuah magnet, beberapa
ion magnesium tertarik dan terlempar keatas. Dengan memindahkan magnesium dari reaksi
tersebut, DNA menghancurkan enzim-enzim dikenal sebagai nukleus yang tidak diaktifkan
dan molekul-molekul DNA yang terlindungi.
Pada sebagian besar protokol, sampel biologis seperti bercak darah ditambahkan
sampai dengan 5% suspensi chelex dan dididihkan selama beberapa menit untuk memecah
sel-sel dan melepaskan DNA. Sebuah permulaan, langkah pencucian sebelumnya sangat
membantu untuk menghilangkan kontaminasi dan hambatan yang mungkin timbul seperti
heme dan beberapa protein (Willard et.al. 1998). Pemanasan sampai temperatur 100
0
C
memecahkan DNA protein sel sama seperti mengacaukan membran sel dan menghancurkan
protein sel setelah pemusingan didalam mesin sentrifuse untuk mendorong resin chelex dan
sisa-sisa selular kedasar tabung reaksi, cairan bagian atas setelah proses pengendapan
dihilangkan dan dapat ditambahkan langsung ke reaksi pengerasan PCR.
2.7. Analisis sequen DNA dengan Blast
Analisa DNA sequencing merupakan salah satu tools yang sangat penting dalam
mengungkap rahasia genetik di balik kehidupan. Banyak sekali penelitian life science yang
melibatkan analisa ini. Pencapaian terbesar teknologi DNA sequencing saat ini adalah
terungkapnya urutan basa nukleotida yang menyusun genom manusia. Para peneliti yang
menggunakantools ini seringkali menghadapi masalah dalam melakukan analisa, output yang
dihasilkan seringkali tidak memuaskan. DNA sequencing menggunakan elektrophoresis
kapiler merupakan teknologi kunci pada laboratorium-laboratorium life science. Berikut ini
adalah beberapa hal yang penting untuk diketahui yang menjadi faktor penentu keberhasilan
analisa DNA Sequencing.

Urutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan teknik DNA Sequencing, metode yang
umum digunakan saat ini adalah metode Sanger (chain termination method) yang sudah
dimodifikasi menggunakan dye-dideoxy terminator, dimana proses awalnya adalah reaksi
PCR dengan pereaksi yang agak berbeda, yaitu hanya menggunakan satu primer (PCR biasa
menggunakan 2 primer) dan adanya tambahan dideoxynucleotide yang dilabel fluorescent.
Karena warna fluorescent untuk setiap basa berbeda, maka urutan basa suatu DNA yang tidak
diketahui bisa ditentukan.
2.7.1. Sequencing Chemistries
Cycle sequencing merupakan metode sederhana yang mana terdiri atas proses
denaturasi, annealing dan ekstensi yang berulang-ulang dalam sebuah mesin thermal cycler,
menghasilkan amplifikasi linear produk-produk ekstensi. Produk ini kemudian diinjeksikan
ke dalam sebuah kapiler. Untuk Applied Biosystems, ada 2 kategori pendekatan sequencing
chemistry: Dye Primer Chemistry dan Dye Terminator chemistry.

2.7.2. Sequencing menggunakan Dye Primers
Ketika menggunakan sequencing chemistry berbasis dye primer, dilakukan empat reaksi
terpisah. Setiap reaksi dilabel pada ujung 5-nya dengan menggunakan dyefluorescent yang
berbeda. Masing-masing keempat reaksi ini akan mengandung apakah primer yang dilabel
warna biru, hijau, kuning atau merah. Warna setiap reaksi berkorespondensi dengan A, C, G
atau T. Dideoksiribonukleotida (ddNTP) terdapat dalam setiap campuran reaksi, dan
menterminasi sintesis DNA secara acak, menghasilkan fragmen-fragmen DNA dengan
panjang yang bervariasi. Karena digunakan primer yang dilabel fluorescent untuk ekstensi,
seluruh fragmen yang diterminasi terlabel fluorescent. Setelah beberapa siklus yang cukup
untuk terbentuknya produk ekstensi yang optimal, keempat reaksi tersebut digabungkan dan
dielektroforesis menggunakan satu kapiler pada mesin Genetic Analyzer (gambar 2).
2.7.3. Sequencing menggunakan Dye Terminators
DNA sequencing fluorescent dapat juga dilakukan menggunakan suatu bahan kimia
dimana pewarna (dye) terikat pada ddNTP, sehingga membutuhkan hanya satu tabung reaksi
per sample, bukan empat. Karena hanya membutuhkan satu tabung reaksi untuk reaksi dye
terminator, bahan kimia ini lebih simple untuk digunakan dibanding dye primer
chemistry. Template DNA, primer tak dilabel, buffer, empat jenis dNTP, empat jenis ddNTP
yang terlabel fluorescent, dan DNA polymerase ditambahkan ke dalam tabung reaksi.
Fragmen-fragmen yang berfluorescent terbentuk karena inkorporasi ddNTP yang terlabel
pewarna. Masing-masing ddNTP yang berbeda (ddATP, ddCTP, ddGTP, atau ddTTP) akan
membawa sebuah warna dye yang berbeda. Dengan demikian semua fragmen yang
diterminasi (yang berujung sebuah ddNTP), mengandung sebuah dye pada ujung 3-nya
(gambar 3)

3.3. Metodelogi
3.3.1. Visualisasi Ekstraksi DNA
3.3.1.1. Isolasi DNA Prokariot
1. Dalam kondidi aseptis, isi tabung apendorf 1,5 ml dengan aquadest
2. Kemudian ambil 1 ose kultur bakteri dan inokulasikan kedalam tabung apendorf tersebut
3. Suspense bakteri tersebut kemudian dimasukkan kedalam freezer
4. Diamkan hingga mengkristal
5. Sementara itu panaskan air hingga suhu air mencapai 90
0
C
6. Sementara itu suspense mengkristal, rendam tabung apendorf di air selama 10 menit
7. Ulangi langkah diatas sebanyak tiga kali
3.3.1.2. Isolasi DNA Euakriot
1. Ambil 1 buah strawberry, kemudian dibelah / dibagi menjadi 2 bagian.
2. Letakkan sebagian strawberry kedalam plastic ziplock dan remas-remas
dengan jari tangan hingga menjadi cairan juice.
3. Tambahkan 10 ml buffer lisis kedalam plastic dan tutup kembali.
4. Lanjutkan meremas plastic kurang lebih 2-3 menit hingga bercampur/
homogeny dengan larutan juice
5. Kemudian larutan disaring/filter dan biarkan selama 10 menit
6. Buang saringan dan ekstrak yang ada
7. Teteskan sebanyak 2-4 tetes enzim ke dalam tabung yang telah berisi
strawberi dan larutan.
8. Tuangkan sebanyak 30 ml 95 % alcohol dingin ke dalam tabung sentrifuge 50
ml
Lalu tuangkan larutan yang telah disaring kedalam tabung, tutup tabungnya

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Hasil
Pada visualisasi ekstraksi dari DNA ini didapatkan beberapa hasil dari praktikum isolasi
genom DNA diantaranya yaitu:
a. Isolasi DNA Prokariot
Pada isolasi DNA prokariot didapatkan dari sampel DNA, dengan suspense mengkristal
setelah dimasukkan kedalam freezer
b. Isolasi DNA Eukariot
Pada isolasi DNA eukariot didapatkan hasil, DNA naik keatas setelah diberi alcohol dengan
warna dari DNA itu sendiri berwarna bening dan berupa benang benang putih.

4.2. Pembahasan
Pada ekstraksi suatu DNA, terdapat dua teknik dari isolasi DNA yaitu isolasi DNA
prokariot dan isolasi DNA eukariot. materi genetik dan berfungsi untuk mengatur
perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. Dilihat dari organismenya,
struktur DNA prokariot berbeda dengan struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak
memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear
dan memiliki protein histon. Karena ukuran relatif kecil genom prokariotik, banyak urutan
genom lengkap untuk berbagai bakteri dan archaea telah dipublikasikan selama beberapa
tahun terakhir. Akibatnya, kita mulai mengerti banyak tentang anatomi genom prokariotik,
dan dalam banyak hal kita tahu lebih banyak tentang organisme daripada kita tentang
eukariota. Dari hasil elektroforesis menunjukkan pita DNA tampak jelas (berarti jumlah DNA
yang terdeteksi banyak), sedangkan bagian bawah gel agarose masih terdapat berkas.
Kemungkinan hal itu disebabkan adanya protein lain atau ada bagian-bagian sel yang terikut
(debris sel) pada saat isolasi DNA. Jadi pada isolasi DNA ini kita mendapatkan DNA yang
belum benar-benar murni. Ada 5 tahap untuk melakukan isolasi DNA, yaitu: isolasi sel,
pelisisan dinding dan membran sel, pengekstraksian dalam larutan, purifikasi, dan presipitasi.
Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi sel yang ingin digunakan, yaitu sel bakteri.
Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan larutan pelisis sel. Pada
isolasi dari genom DNA ini semua sel mempunyai membrane plasma, lapisan lipoprotein
ganda yang membentuk penghalang memisahkan isi sel dari lingkungan ekstraseluler. pada
DNA terdapat didalam suatu sel sehingga untuk emngisolasi dari suatu DNA, harus
dilakukan pemecahan sel secara fisik yang diantaranya yaitu seperti mechanical destruption,
liquid homozigation, sonofikasi, freeze dan manual grinding.

4.2.2. Analisis sequen DNA dengan Blast
Analisa DNA sequencing merupakan salah satu tools yang sangat penting dalam
melibatkan analisa ini. DNA sequencingmenggunakan elektrophoresis kapiler merupakan
teknologi kunci pada laboratorium-laboratorium life science.Analisis sekuens perlu dilakukan
untuk mengetahui beberapa karakteristik pentingnya seperti peta restriksi, rangka baca, kodon
awal, dan kodon akhir, atau kemungkinan tempat promoternya. Di samping itu, perlu juga
dipelajari hubungan kekerabatan suatu sekuens baru dengan beberapa sekuens lainnya yang
telah terlebih dahulu diketahui. Pada kali ini untuk analisis sequen DNA dengan
menggunakan BLAST. Dengan melakukan analisis sekuensing dari DNA, maka dapat
diketahui dari jenis jenis bakteri dan sumber atau asal dari suatu bakteri tersebut. Untuk
pemilihan bakteri pada analisis sekuensing DNA ini, pemilihanya dilakukan secara random
atau acak tidak berdasarkan ketentuan secara urut. Sedangkan untuk penetuan dari
sequencing DNA ini diproses dengan progam bioinformatika, dengan progam tersebut maka
akan diketahui dari pohon filogenik dari suatu bakteri yang dimasukan kedalam pemrosesan
data tersebut. Data dari suatu DNA ini didapat dari GenBank.
4.2.3. Identifikasi Sekuen Menggunakan Program BioInformatika
Pada proses identifikasi DNA dengan menggunakan progam bioinformatika ini
untuk menentukan atau mengetahui dari tingkat hubungan dari kekerabatan dari suatu
mikroorganisme. Dengan pengolahan data dari hasil sekuensing DNA tersebut maka
dapat dihasilkan berupa pohon filogenetik, yang tujuanya juntuk membandingkan dari
hasi sekuensing yang didapat pada sekuensing DNA. Dari analisis filogenetik terlihat
beberapa bakteri yang mempunyai kekerabatan terdekat seperti pada jenis bakteri Brugia
malayi, Plectus murrayi, Theobroma cacao KZ0ACAC, Tamarix hispida clone,
Theobroma cacao, Tamarix hispida dan masih banyak yang mempunyai tingkat
kekerabatan terdekat antar suatu bakteri. Dari hasil identifikasi bakteri yang didapat
dengan menggunakan progam bioinformatika, sumber dari bakteri tersebut rata rata
berasal dari tanah, plastic. Ini merupakan dari karakteristik dari suatu organism yang
didapat dengan Eukaryota, Metazoa, Arthropoda, Hexapoda, Insecta, Pterygota,
Neoptera, Endopterygota, Diptera, Nematocera, Culicoidea dan Culicidae.

BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN

5.1. Kesimpulan
Dari praktikum dasar dasar bioteknologi kali ini dapat diambil beberapa kesimpulan
yang diantaranya yaitu:
1) Isolasi DNA kromosom ataupun DNA plasmid dapat dilakukan dengan menggunakan
prosedur isolasi sel; lisis dinding dan membran sel; ekstraksi dalam larutan; purifikasi; dan
presipitasi. Diperoleh DNA kromosom dan plasmid dengan kemurniannya cukup tinggi
dilihat dari hasil elektroforesis yang baik. Ketelitian dan kecermatan dalam pelaksanaan
penelitian, sangat menentukan hasil kemurnian DNA kromosom dan plasmid.
2) Analisa DNA sequencing merupakan salah satu tools yang sangat penting dalam
melibatkan analisa ini. Para peneliti yang menggunakan tools ini seringkali menghadapi
masalah dalam melakukan analisa, output yang dihasilkan seringkali tidak memuaskan.
3) Identifikasi DNA dilakukan untuk mengetahui tingkat hubungan kekerabatan dari suatu
bakteri dengan bakteri yang lain atau juga bisa disebut dengan istilah dengan pohon filogenik

5.2. Saran
1) Mohon dijelaskan untuk lebih detail lagi tentang teknik teknik isolasi DNA
2) Pada praktikum berlangsung dengan sangat menyenangkan, karna asistenya sangat ramah
ramah dan menjelaskan dengan sabar.
3) Kurangnya waktu untuk praktikum kali ini, karena banyak alat alat dan teknik teknik
dari isolasi DNA yang belum diketahui oleh para praktikan.

Daftar Pustaka
Artama, W.T. 1991. Rekayasa Genetika. Pusat Antar Universitas-Bioteknologi.
UGM.Yogyakarta.
Ausabel. F.M, et al. 1992. Short Protocols in Moleculer Biology, Third ed. John
Wiley & Sons.
Inc. USA.
Brown, A.T. 1991. Pengantar Kloning Gen (Alih bahasa: S.A. Muhammad dan
Praseno).Yayasan Esensia Medika. Yogyakarta.
Kimbal, John W. 1989. Biologi. Edisi kelima cetakan kedua. Penerbit Erlangga.
Jakarta.
Lehninger, A.L. 1982. Dasar - dasar Biokimia. jilid 1. Penerbit Erlangga. Jakarta.
Lodish, Harvey, et al. 2001. Molecular Cell Biology, Fourth Edition. W.H. Freeman
and Company. New York.
Murray. R.K, at al. 1995, Biokimia Harper, edisi ke-22. Penerbit Buku Kedokteran.
Jakarta.
Mubarika, Sofia. 1990. Rekayasa Genetika. Pusat Antar Universitas-Bioteknologi
UGM. Yogyakarta.
Sambrook, L., et al. Molecular Clonning : A laboratory Manual, second edition. Cold
Spring Harbor Laboratory Press. New York.
Schmid, R.D. 2003. Pocket Guide to Biotechnology and Genetic Engineering. Wiley-
VCH. Germany.
Watson, James D. Tooze, John. Kurtz, David T. 1988. DNA Rekombinan. Penerbit
Erlangga. Jakarta.

Isolasi Dna Sederhana

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Isolasi Dna Sederhana

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

ISOLASI DNA SEDERHANA

Dosen pengampu: Luisa Diana Handoyo, M. Si.

Anda mungkin juga menyukai