PENDAHULUAN
1.1 Judul
Teknik Dasar Biologi Molekuler : Isolasi DNA
1.2 Latar Belakang
DNA (Deoxyribose Nucleid Acid) adalah master molekul yang mengkode
semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap
organisme. DNA merupakan suatu materi genetik yang terbentuk dari dua kelompok
basa yang berbeda yang mengandung nitrogen, yaitu purin dan pirimidin. Dua purin
yang paling banyak terdapat pada DNA adalah adenin dan guanin, dan pirimidin
umumnya adalah sitosin dan timin. Purin dan pirimidin berisi beberapa ikatan ganda
yang berhubungan. Molekul yang berisi ikatan tersebut mempunyai potensi untuk
hadir dalam sejumlah struktur kimia yang berbeda, karena atom hidrogennya
mempunyai kebebasan tertentu. (Goodenough. 1988).
Isolasi DNA yang digunakan bukanlah DNA genom melainkan DNA
plasmid, karena Plasmid memiliki suatu kekhususan yaitu mudah disisipi oleh gen
lainnya dan mampu bereplikasi beberapa kali dalam satu kali masa replikasi,
menyebabkan jumlahnya dapat bertambah dengan sangat cepat (Szczepanowski,
2008). Dari sifat khas itu, plasmid sering dimanfaatkan untuk menjadi vector suatu
gen atau untuk menghasilkan ekspresi gen yang besar, seperti pada produksi insulin.
Penjelasan tersebut cukup mendukung pemilihan DNA plasmid dalam percobaan
dibandingkan DNA genom. Dalam mempelajari DNA tentu saja tidak terlepas dari
adanya suatu gen. Pada gen terdapat urutan basa nukleotida yang membentuk rantai
ganda yaitu DNA itu sendiri. (Reece, 2012).
Ada dua metode pada praktikum Isolasi DNa, yaitu:
1. boiling: dipanaskan dalam air panas yang mendidih
2. CATD: secara kimiawi
Elektroforesis dilakukan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan purifikasi
dari molekul DNA. Elektroforesis merupakan cara pengamatan DNA dengan
bantuan sinar ultraviolet. Cara pemisahan dengan elektroforesis ini merupakan alat
pendukung yang sangat fundamental dalam teknologi DNA
rekombinan.
Elektroforesis
digunakan
untuk
pengamatan
DNA
dalam
penampakan
flouresensinya.
1.3 Tujuan Praktikum
1. Untuk memisahkan DNA dari molekul asam nukleat
2. Memahami prinsip kerja dan kegunaan tehnik elektroforesis
3. Memahami cara memisahkan asam-asam nukleat dan molekul protein
dengan menggunakan peralatan elektroforesis
BAB II
KAJIAN TEORI
2.1 Isolasi DNA
DNA (asam deoksiribonukleat) adalah polimer asam nukleat yang tersusun
secara sistematis dan yang membawa informasi genetik dari sel khususnya dan dari
mahluk dalam keseluruhannya dari satu generasi ke generasi berikutnya. Informasi
genetik tersebut disusun dalam bentuk kodon yang berupa tiga pasang basa
nukleotida dan menentukan bentuk, struktur, maupun fisiologi suatu jasad
(Triwibowo 2005: 51). DNA memiliki dua fungsi yang sangat penting, yaitu sebagai
autokatalis dan heterokatalis.
nukleosida.
Nukleosida akan
prokariot juga tidak dikemas dalam struktur yang jelas karena sel prokariot tidak
memiliki inti sel (Triwibowo 2005: 76). DNA pada sel eukariot berbentuk linear dan
memiliki protein histon. Ukuran DNA eukariot juga lebih besar dibandingkan DNA
prokariot dan DNA eukariot lebih bervariasi (Raven & Johnson 2002: 94).
Sel prokariot memiliki pula bahan genetik tambahan yang disebut DNA
plasmid.
diperlukan oleh sel. Jika sel prokariot membawa plasmid, maka genom sel tersebut
meliputi satu kesatuan gen yang ada pada bahan genetik utamanya dan gen yang ada
pada plasmid tersebut. (Triwibowo 2005: 76).
Sel eukariot memiliki DNA di dalam kromosom, yaitu di inti sel dan ada
Beberapa sel eukariot memiliki DNA di luar kromosom, yaitu DNA pada
mitokondria dan kloroplas. DNA nukleus berbentuk linear dan berasosiasi sangat
erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk
sirkular, replikasinya berlangsung secara independen dan tidak bergantung pada
replikasi kromosom, serta tidak berasosiasi dengan protein histon. Organisasi gen
mitokondria lebih mirip organisasi gen pada bakteri. Selain itu, DNA mitokondria
dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal
dari garis ibu. Hal ini sangat berbeda dengan DNA nukleus yang memiliki pola
pewarisan sifat dari kedua orangtua (Klug & Cummings 1994: 315316).
DNA dari sel prokariot maupun eukariot dapat diperoleh dengan cara
mengisolasi DNA yang terdapat di dalam sel. Isolasi DNA adalah teknik yang
dilakukan untuk memisahkan DNA dari zat yang lain di dalam sel. Fungsi dari
pengisolasian DNA adalah mendapatkan DNA murni dari dalam sel yang akan
digunakan untuk penganalisisan genotip suatu organisme (Triwibowo 2005 32).
Pada sel eukariotik termasuk tanaman dan hewan bagian terbesar dari DNA
berada pada nukleus yaitu organel yang dipisahkan dari sitoplasma dengan
membran. Nukleus terdiri dari 90 % keseluruhan DNA seluler. Sisa DNA adalah
organel lain seperti mitokondria dan kloroplas. Karena DNA terdapat pada nukleus,
maka perlu adanya metode pelisisan sel sampai pemanenan sel. Dimana metode
tersebut merupakan bagian dari metode isolasi DNA (Elrod, 2007).
berada di bawah pita DNA. Keberadaan pita RNA tergantung bahan yang
diekstraksi (Prasetyo, 2008).
1. Phenol:chloroform
Mengunakan senyawa Phenol-choloroform-isoamyl alcohol, Metode
standard untuk ekstraksi DNA, Akhir-akhir ini ditinggalkan, karena sifat
toksik phenol.
2. Salting Out
Menggunakan
garam
konsentrasi
tinggi
(NaCl
M),
untuk
protein
mengendap.
Larutan
tersebut
kemudian
tersebut
menggunakan
suatu
metode,
yakni
metode
elektroforesis.
melewati pori-pori gel agarosa, sedangkan molekul DNA berukuran kecil akan lebih
mudah melewati pori-pori gel tersebut. Oleh sebab itu maka mobilitas molekul DNA
dalam gel agarosa pada konsentrasi gel yang sama akan berbeda bergantung pada
ukuran molekul atau fragmen DNA sampel.
Metode elektroforesis yang banyak digunakan untuk menganalisis molekul
DNA adalah elektroforesis horisontal menggunakan gel agarosa. Konsentrasi gel
agarosa yang digunakan untuk elektroforesis harus disesuaikan dengan panjang
amplicon yang diharapkan. Pengaturan kapilaritas gel elektroforesis akan
meningkatkan resolusi analisis hasil PCR secara signifikan, dan hal ini menyebabkan
terjadinya pemisahan molekul DNA berdasar ukuran molekul secara sempurna. Hasil
elektroforesis DNA dapat dianalisis setelah melalui pewarnaan menggunakan
pewarna DNA, pewarna DNA yang paling banyak digunakan adalah ethidium
bromida. Fragmen DNA yang telah diwarnai tersebut ketika diamati dibawah sinar
ultraviolet akan terlihat sebagai pita-pita dalam gel elektroforesis berwarna oranyemerah yang berpendar.
Alat dan bahan beserta fungsi yang digunakan dalam tahapan elektroforesis
adalah :
1. Buffer elektroforesis yang terdiri dari TAE, memiliki daya ion dalam
larutan sebagai pengahantar listrik
2. Loading dye, berfungsi untuk pemberat agar tidak keluar dari sumuran
3. Etadium bromida, sebagai pewarna DNA yang akan menyisip didalam gel
agarosa
4. UV transiluminator, untuk visualisasi pewarna DNA dalam gel agarosa.
5. Aquades, sebagai pelarut.
6. Baki agarosa, sebagai cetakan gel agarosa
7. TAE (Trisbase), sebagai buffer sesuai pH.
8. Asam asetat Glasial, sebagai elektrolit garam.
9. EDTA (Etylen Diamine Tetra Asetic Acid) sebagai pe-non aktif DNA.
10. Sisir elektroforesis, untuk membuat sumuran pada gel agarosa.
11. Tangki elektroforesis, untuk tangki DNA.
12. Mikropipet, untuk mengambil dan menghomogenkan sampel DNA
dengan Loading dye.
power supply.
Dokumentasi
1. Gel agarose hasil elektroforesis direndam dalam larutan EtBr
selama 15
Menit.
2. Dilanjutkan dengan direndam dalam akuades selama 15 menit.
3. Kemuadian gel agarose divisualisasi dengan menggunakan UV
transiluminator, dan didokumentasikan
BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Jenis Praktikum
Praktikum biologi molekuler mengenai isolasi DNA ini menggunakan metode
boiling, dimana metode boiling ini menggunakan pemanasan atau temperature yang
digunakannya.
3.2 Waktu dan Tempat
: 13.00-16.00 WIB
Nama Alat
Jumlah
.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9
10.
11.
12.
13.
14.
15.
Tabung Mikro
Waterbath
Sentrifuge
Vortex
Freezer
Mikropipet
Jarum Ose
Tips
Tabung Kuvet
Spektrofotometri
Microwave
Tray
Shaker
Visualisasi Sinar UV
Sarung Tangan non powder
5 buah
1 buah
1 buah
1 buah
1 buah
4 buah
1 buah
Seperlunya
2 buah
1 buah
1 buah
1 buah
1 buah
1 buah
Seperlunya
Nama Bahan
Jumlah
.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
Larutan PBS
TE 1x
Aquabides
Koloni Bakteri
Agarosa
EtBr 0,02 %
Alkohol
ddH2O
Kertas Parafilm
Loading Dye
Aquadest
1 ml
600 l
Secukupnya
1 loop
Secukupnya
Secukupnya
Secukupnya
Secukupnya
Secukupnya
Secukupnya
Secukupnya
Bakteri dikultur
dalam media padat
LA selama sekitar
16 jam
1 loop bakteri
dari medium agar
dimasukkan ke
dalam tabung
mikro
Tabung mikro
yang sudah berisi
1ml PBS dan 1
loop bakteri
dihomogenkan
Pellet
ditambahkan
buffer TE 1x
sebanyak 100 l
dan divortex
Supernatan yang
terbentuk
kemudian
dibuang
Suspensi
disentrifugasi
selama 3 menit
dengan kecepatan
5000 rpm
Tabung mikro
dipanaskan di
atas air mendidih
(90-100oC)
selama 10 menit
Disentrifugasi
selama 3 menit
dengan kecepatan
5000 rpm
Lysat yang
terbentuk diambil
sebanyak 100l
Ditambahkan
buffer TE 1x
dingin sebanyak
500l
Dipindahkan ke
dalam tabung 1,5
ml yang baru
Disimpan dalam
freezer dengan suhu
-20OC
Tabung kuvet
disterilkan dengan
alkohol-aquabidestalkohol
Sampel dimasukkan ke
dalam tabung kuvet
Absorbansi sampel
ditentukan dengan
spektrogotometer pada
260-280 nm
Agarosa dan
TAE/TBE
dicampurkan
Homogenkan di
microwave selama
1,5 menit lalu
ditunggu hingga
dingin
Loading dye
diteteskan pada
kertas parafilm
sebanyak jumlah 15
tetes
Setelah dingin
masukkan ke Tray
lalu ditunggu selama
45 menit hingga
terbentuk agarosa
Ditambahkan
dengan sampel dari
setiap kelompoknya
lalu dihomogekan
dengan cara pipeting
Setelah homogen
dimasukkan ke
dalam agar yang
telah dibuat
proses running
berjalan selama 32
menit pada 80-100
volt
Rendam pada
aquades selama 1015 menit
Pada tahap
pewarnaan/
visualisasi
dibutuhkan waktu
10-30 menit
Visualisasi sinar UV
BAB IV
Purity=
A 260
A 280
Isolat
A260
A280
M
O
M
O
M
O
M
O
M
O
M
O
0,002
0,002
0,009
0,010
0,086
0,100
0,017
0,087
0,091
0,111
0,095
0,111
0,003
0,003
0,006
0,008
0,075
0,088
0,0093
0,079
0,080
0,093
0,082
0,095
[ DNA ]
Purity
Fragmen
mg/ml
50
50
225
250
2150
2500
425
2175
2275
2775
2375
2775
A260/A280
0,67
0,67
1,5
1,25
1,14
1,13
1,86
1,10
1,13
1,19
1,16
1,16
DNA
Dari tabel diatas, kita dapat mengetahui bahwa hasil konsentrasi DNA
kelompok 3 dan 5 memiliki konsentrasi yang paling tinggi diantara kelompok lain
yakni 2775 mg/ml dan 2500 mg/ml. Namun hasil visualisasi gel agarose
menggunakan sinar UV, hasil isolasi DNA kelompok 3 dan 5 tidak menunjukan
terbentuknya fragmen DNA, hal tersebut jika dikaitkan dengan nilai kemurnian yang
didapatkan kelompok tersebut kecil yaitu 1,19 dan 1,13 pada isolat O dan
kemungkinan masih terdapat kontainan lain seperti protein. Sesuai dengan teori
menurut Sambrook dan Russel (2001) dalam Kinasih Prayuni 2008, bahwa:
Hasil isolasi DNA genom memiliki tingkat kemurnian yang baik jika
angkanya berkisar pada 1,8 2,0. Jika <1,8 maka itu menunjukan adanya
kontaminasi dari protein. Jika >2,0 maka itu meunjukan adanya kontaminasi
RNA.
hasil visualisasi yang berasal dari analisis kualitatif hasil isolasi DNA. Hasil ini
berasal dari teknik Elektroforesis. elektroforesis ini memiliki fungsi untuk
mengetahui keberadaan DNA tersebut, dengan menggunakan gel agarose, yang hasil
akhirnya gel agarose tersebut diwarnai menggunakan EtBr ( Etdium Bromide ).
Etdium bromide adalah suatu molekul yang dapat mendeteksi DNA dengan cara
molekul ini disisipkan diantara basa fragmen double helix DNA dan diikat oleh basa
nitrogen dari DNA tersebut, yang kemudian memantulkan cahaya dibawah sinar UV.
Jika dengan sinar lainnya etdium bromide akan rusak, maka dari itu proses ini
dilakukan di ruang gelap. Penggunaan sinar UV ini juga mempermudah untuk
melihat fragmen DNA yang kecil agar dapat didokumentasikan dan fragmen DNA
yang terbentuk dapat divisualisasikan. Selain itu, gel agarose yang kami gunakan
adalah berkisar antara 1% - 2% saja. Karena semakin pekat kosentrasi gel agarose
maka akan semakin mempersulit pergerakan atau laju dari molekul DNA. Ini sesuai
dengan teori yang disampaikan oleh Davis, dkk ( 1994: 15 ) bahwa dalam proses
elektoforesis terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi laju pergerakan dari
molekul DNA, salah satunya adalah konsentrasi gel. Davis, dkk ( 1994: 15 )
mengatakan:
Semakin tinggi konsentrasi agarosa, semakin kaku gel yang dibuat
sehingga sukar untuk dilewati molekul-molekul DNA. Konsentrasi agarosa
yang lebih tinggi memudahkan pemisahan DNA yang berukuran kecil,
konsentasi agarosa yang lebih rendah memudahkan pemisahan DNA dengan
ukuran yang lebih besar.
tidak berhasil, pasti hasilnya akan mempengaruhi salah satu analisis nya, bisa
kuantitatif atau kualitatif. Jika diambil contoh, ketika konsentrasi atau kemurniannya
terlalu rendah, maka analisis kualitatif tidak akan tervisualisasikan. Dikarenakan
Etbr yang terikat oleh basa nitrogen menyebabkan pita pita tidak dapat
tervisualisasikan.
DAFTAR PUSTAKA
Alberts, B., Bray, J. L. dan Roff, M. 1994. Molecular Biology of The Cell. Garland
Pubkishing: New York.
Campbell, A. N., J. B. Reece & L. G. Mitchell. 2002. Biologi. Ed.ke-5 jilid 1. terj
dari Biology. 5th ed, oleh Lestari, R. Erlangga. Jakarta: xxi + 438 hlm.
Campbell, A. N., J. B. Reece & L. G. Mitchell. 2003. Biologi. Ed.ke-5 jilid 2. terj
dari Biology. 5th ed, oleh Lestari, R. Erlangga. Jakarta: xxii + 404 hlm.
Campbell, N., et al. 2007 Biology : Eight Edition. California : Pearson
Cheng, L., Zhang D. Y. 2008. Molecular Genetic Pathology. New Jersey : Humana
Press
Davis, L., M. Kuehl, & J. Battey. 1994. Basic methods: Molecular biology. 2nd
ed. Appleton & Lange, Norwola [ Diakses : 11 Februari 2016 ]
Dr. Ir. Maftuchah, M.P., Dr. Ir. Aris Winaya: dalam Analisis Teknik Dasar Biologi
Molekuler.
[Online]
Tersedia:
https://books.google.co.id/books?
id=MrfSCQAAQBAJ&pg=PA65&lpg=PA65&dq=absorbansi+260+adal
ah&source=bl&ots=Au4iYjk115&sig=d4oA6wQ9qDRuYx9eHzCg6DL
yOPk&hl=en&sa=X&ved=0ahUKEwj9g5ChqvLKAhXEnaYKHYKtDh
IQ6AEIMDAC#v=onepage&q=absorbansi%20260%20adalah&f=false
[ Diakses : 11 Februari 2016 ]
Klug, W. S. & M. R. Cummings. 1994. Concept of genetics. 4th ed. Prentice Hall,
New Jersey: ix + 773 hlm.
Lewis, R. 2003. Human genetics: Concepts and applications. The McGraw-Hills
Company, Inc., Boston: xviii + 454 hlm.
Raven, P.H. & G.B. Johnson. 2002. Biology. 6th ed. McGraw-Hill
Reece, J. B., et al. 2012. Campbell Biology Concept and Connections : Concept and
Connection. California : Pearson
Sambrook dan Russell (2001: A8.20-A8.21) dalam Prayuni Kinarsih. 2008. Isolasi
DNA
Genom
Padi
(Oryza
sativa).
[Online]
Tersedia