Anda di halaman 1dari 23

BAB I

PENDAHULUAN
1.1 Judul
Teknik Dasar Biologi Molekuler : Isolasi DNA
1.2 Latar Belakang
DNA (Deoxyribose Nucleid Acid) adalah master molekul yang mengkode
semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap
organisme. DNA merupakan suatu materi genetik yang terbentuk dari dua kelompok
basa yang berbeda yang mengandung nitrogen, yaitu purin dan pirimidin. Dua purin
yang paling banyak terdapat pada DNA adalah adenin dan guanin, dan pirimidin
umumnya adalah sitosin dan timin. Purin dan pirimidin berisi beberapa ikatan ganda
yang berhubungan. Molekul yang berisi ikatan tersebut mempunyai potensi untuk
hadir dalam sejumlah struktur kimia yang berbeda, karena atom hidrogennya
mempunyai kebebasan tertentu. (Goodenough. 1988).
Isolasi DNA yang digunakan bukanlah DNA genom melainkan DNA
plasmid, karena Plasmid memiliki suatu kekhususan yaitu mudah disisipi oleh gen
lainnya dan mampu bereplikasi beberapa kali dalam satu kali masa replikasi,
menyebabkan jumlahnya dapat bertambah dengan sangat cepat (Szczepanowski,
2008). Dari sifat khas itu, plasmid sering dimanfaatkan untuk menjadi vector suatu
gen atau untuk menghasilkan ekspresi gen yang besar, seperti pada produksi insulin.
Penjelasan tersebut cukup mendukung pemilihan DNA plasmid dalam percobaan
dibandingkan DNA genom. Dalam mempelajari DNA tentu saja tidak terlepas dari
adanya suatu gen. Pada gen terdapat urutan basa nukleotida yang membentuk rantai
ganda yaitu DNA itu sendiri. (Reece, 2012).
Ada dua metode pada praktikum Isolasi DNa, yaitu:
1. boiling: dipanaskan dalam air panas yang mendidih
2. CATD: secara kimiawi
Elektroforesis dilakukan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan purifikasi
dari molekul DNA. Elektroforesis merupakan cara pengamatan DNA dengan
bantuan sinar ultraviolet. Cara pemisahan dengan elektroforesis ini merupakan alat
pendukung yang sangat fundamental dalam teknologi DNA

rekombinan.

Elektroforesis

digunakan

untuk

pengamatan

DNA

dalam

penampakan

flouresensinya.
1.3 Tujuan Praktikum
1. Untuk memisahkan DNA dari molekul asam nukleat
2. Memahami prinsip kerja dan kegunaan tehnik elektroforesis
3. Memahami cara memisahkan asam-asam nukleat dan molekul protein
dengan menggunakan peralatan elektroforesis

BAB II

KAJIAN TEORI
2.1 Isolasi DNA
DNA (asam deoksiribonukleat) adalah polimer asam nukleat yang tersusun
secara sistematis dan yang membawa informasi genetik dari sel khususnya dan dari
mahluk dalam keseluruhannya dari satu generasi ke generasi berikutnya. Informasi
genetik tersebut disusun dalam bentuk kodon yang berupa tiga pasang basa
nukleotida dan menentukan bentuk, struktur, maupun fisiologi suatu jasad
(Triwibowo 2005: 51). DNA memiliki dua fungsi yang sangat penting, yaitu sebagai
autokatalis dan heterokatalis.

DNA berfungsi sebagai autokatalis karena DNA

mampu mensintesis dirinya sendiri Sedangkan sebagai heterokatalis karena DNA


mampu mensintesis molekul kimiawi lainnya seperti RNA, protein dan lain-lain
(Wolfe 1995: 72).
DNA terdiri dari tiga macam molekul, yaitu gula pentosa, gugus fosfat dan
basa nitrogen. Gula pentosa memiliki 5 atom C dan pada DNA, atom C nomor 2
berikatan dengan atom H. Gugus fosfat pada DNA berikatan dengan atom C nomor 5
melalui ikatan fosfoester. Gugus fosfat tersebut yang menyebabkan asam nukleat
bermuatan negatif. Basa nitrogen yang menyusun asam nukleat ada dua macam,
yaitu basa purin yang terdiri dari adenin dan guanin dan basa pirimidin yang terdiri
dari timin dan sitosin. Basa purin atau pirimidin adalah basa nitrogen yang terikat
pada atom C nomor 1 suatu molekul gula melalui ikatan N-glukosidik. Ikatan
tersebut menghasilkan molekul yang disebut

nukleosida.

Nukleosida akan

bergabung dengan fosfat dan membentuk molekul yang disebut nukleotida


(Triwibowo 2005:26; Suryo 2005 : 59--62). Nukleotida adalah Satu komponen
pembangun (building block) DNA terdiri atas satu gula pentosa, satu gugus fosfat
dan satu pasang basa (Lewis 2003: 176--178).
DNA terdapat dalam sel prokariot maupun eukariot. Lokasi yang paling
banyak mengandung DNA terdapat pada bagian aktifitas genetik utama sel. Sel
prokariot, aktifitas genetiknya terjadi di seluruh sel sehingga DNA tidak mempunyai
tempat yang spesifik dalam sel. Sebaliknya, karena aktifitas pada sel eukariot terjadi
di dalam inti, maka sebagian besar DNA terdapat dalam inti sel. DNA pada sel
prokariot berbentuk lingkaran dan hanya ada satu unit. Oleh karena itu, prokariot
bersifat monoploid karena hanya ada satu bahan genetik utama. DNA pada sel

prokariot juga tidak dikemas dalam struktur yang jelas karena sel prokariot tidak
memiliki inti sel (Triwibowo 2005: 76). DNA pada sel eukariot berbentuk linear dan
memiliki protein histon. Ukuran DNA eukariot juga lebih besar dibandingkan DNA
prokariot dan DNA eukariot lebih bervariasi (Raven & Johnson 2002: 94).
Sel prokariot memiliki pula bahan genetik tambahan yang disebut DNA
plasmid.

Dalam keadaan normal, kehadiran plasmid pada umumnya tidak

diperlukan oleh sel. Jika sel prokariot membawa plasmid, maka genom sel tersebut
meliputi satu kesatuan gen yang ada pada bahan genetik utamanya dan gen yang ada
pada plasmid tersebut. (Triwibowo 2005: 76).
Sel eukariot memiliki DNA di dalam kromosom, yaitu di inti sel dan ada
Beberapa sel eukariot memiliki DNA di luar kromosom, yaitu DNA pada
mitokondria dan kloroplas. DNA nukleus berbentuk linear dan berasosiasi sangat
erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk
sirkular, replikasinya berlangsung secara independen dan tidak bergantung pada
replikasi kromosom, serta tidak berasosiasi dengan protein histon. Organisasi gen
mitokondria lebih mirip organisasi gen pada bakteri. Selain itu, DNA mitokondria
dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal
dari garis ibu. Hal ini sangat berbeda dengan DNA nukleus yang memiliki pola
pewarisan sifat dari kedua orangtua (Klug & Cummings 1994: 315316).
DNA dari sel prokariot maupun eukariot dapat diperoleh dengan cara
mengisolasi DNA yang terdapat di dalam sel. Isolasi DNA adalah teknik yang
dilakukan untuk memisahkan DNA dari zat yang lain di dalam sel. Fungsi dari
pengisolasian DNA adalah mendapatkan DNA murni dari dalam sel yang akan
digunakan untuk penganalisisan genotip suatu organisme (Triwibowo 2005 32).
Pada sel eukariotik termasuk tanaman dan hewan bagian terbesar dari DNA
berada pada nukleus yaitu organel yang dipisahkan dari sitoplasma dengan
membran. Nukleus terdiri dari 90 % keseluruhan DNA seluler. Sisa DNA adalah
organel lain seperti mitokondria dan kloroplas. Karena DNA terdapat pada nukleus,
maka perlu adanya metode pelisisan sel sampai pemanenan sel. Dimana metode
tersebut merupakan bagian dari metode isolasi DNA (Elrod, 2007).

Terdapat organel-organel bermembran ganda di dalam sitoplasma, termasuk


mitokondria baik pada tumbuhan maupun hewan. Oleh karena itu perlu dilakukan
isolasi DNA pada tanaman dan hewan untuk mengetahui dan mempelajari DNA dari
tanaman dan hewan tersebut. Sel eukariotik memiliki DNA lebih banyak, lengkap
dengan komponen-komponen lain. DNA tanaman dan hewan tersimpan dalam
nucleusyang terbungkus oleh membran. Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat
untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi.
Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat
molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada
di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung.
Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu
supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah. Presipitasi merupakan
langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran
(Albert, 1994).
Adapun macam macam metode yang digunakan dalam proses isolasi
DNA :
1. Teknik Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)
Teknik pengujian polimorfisme DNA berdasarkan pada amplifikasi dari
segmen-segmen DNA acak yang menggunakan primer tunggal yang sekuen
nukleotidanya ditentukan secara acak. Primer tunggal ini biasanya berukuran
10 basa. PCR dilakukan pada suhu anealing yang rendah yang
memungkinkan primer menempel pada beberapa lokus pada DNA. Aturan
sederhana untuk primer adalah terdiri atas 18-28 susunan basa dengan
persentase G+C 50-60% (Subandiyah,2006).
2. Metode CTAB
Menghasilkan pita DNA yang berukuran tebal dan dapat memisahkan
DNA dari polisakarida karena adanya perbedaan karakteristik kelarutan
(differensial of solubility). Disamping deperoleh fragmen DNA, dengan
metode CTAB juga akan diperoleh RNA dengan pita tipis yang terletak jauh

berada di bawah pita DNA. Keberadaan pita RNA tergantung bahan yang
diekstraksi (Prasetyo, 2008).
1. Phenol:chloroform
Mengunakan senyawa Phenol-choloroform-isoamyl alcohol, Metode
standard untuk ekstraksi DNA, Akhir-akhir ini ditinggalkan, karena sifat
toksik phenol.
2. Salting Out
Menggunakan

garam

konsentrasi

tinggi

(NaCl

M),

untuk

medenaturisasi protein menggunakan Proteinase K untuk denaturasi protein


3. Guanidine isothiocyanate
Metode ini lebih cepat dibanding dua metode sebelumnya, Thiocyanate
bersifat toksik, untuk lisis dinding sel, Memerlukan chloroform untuk
denaturasi protein.
4. Silica Gel
Silica gel dapat mengikat DNA dengan perantaraan garam/buffer tertentu
(NaI), Cepat, tetapi recovery DNA kurang (Barnum 2005).
5. PCR (Polymerase Chain Reaction)
Merupakan suatu teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara
in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer
oligonukleotida. Primer yang digunakan sebagai pembatas daerah yang
diperbanyak adalah DNA untai tunggal yang urutannya komplemen dengan
DNA templatnya. Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA secara
in vivo yang bersifat semi konservatif (Giri, 2004).

Tahapan proses Isolasi DNA :


1. Tahap Isolasi jaringan
Tahap pertama ini yang dilakukan adalah mengisolasi jaringan
yang ingin digunakan.
2. Tahap Pelisisan dinding dan membran sel
Yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan cara
penggerusan (homogenasi), sentrifugasi dengan kecepatan lebih dari
10.000 rpm atau dengan menggunakan larutan pelisis sel atau buffer
ekstraksi. Inti sel harus dilisiskan, karena substansi gen yang diinginkan
ada didalamnya. Penambahan larutan pelisis sel ini bertujuan untuk
melisiskan sel yang tidak mengandung DNA agar sel yang mengandung
inti sel dapat diisolasi atau dipisahkan dari komponen-komponen sel
lainnya yang tidak berfungsi.
3. Tahap Pengekstraksian dalam larutan
Selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang dan kemudian
dilakukan ekstraksi di dalam larutan. Hal tersebut bertujuan agar didapat
ekstrak.
4. Tahap Purifikasi
Tahap ini bertujuan untuk membersihkan hasil ekstrak dari zat-zat
lainnya. Pada larutan tersebut kemudian diberikan RNAse dan diinkubasi
selama 10 menit pada suhu 65C. Hal tersebut bertujuan untuk
mengoptimalkan kerja enzim yang sangat dipengaruhi oleh temperatur.
Penambahan RNAse berguna untuk menyingkirkan kontaminasi RNA
sehingga DNA dapat diisolasi secara utuh.
5. Presipitasi
Tahap terakhir, yaitu presipitasi bertujuan untuk mengendapkan
protein histon, sehingga untai-untai DNA tidak lagi menggulung (coiling)
dan berikatan dengan protein histon, yang menyebabkan DNA menjadi
terlihat. Tahap presipitasi dilakukan dengan cara meneteskan larutan
presipitasi protein dan kemudian divortex yang bertujuan untuk

menghomogenkan larutan. Larutan presipitasi protein terdiri atas


amonium asetat yang jika berikatan dengan protein mengakibatkan
terbentuknya senyawa baru dengan kelarutan lebih rendah, sehingga
menyebabkan

protein

mengendap.

Larutan

tersebut

kemudian

disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 13.000 rpm.


Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan
berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga
substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang
lebih ringan akan terletak di atas ( Fauziah, 2010)

Gambar 1.1 Tahapan Proses Isolasi DNA


2.2 Elektroforesis
Hasil isolasi DNA yang didapat tidak dapat diketahui secara langsung
menggunakan mata telanjang, sehingga diperlukan adanya analisis terhadap produk
PCR

tersebut

menggunakan

suatu

metode,

yakni

metode

elektroforesis.

Elektroforesis merupakan metode standar untuk analisis, identifikasi, dan purifikasi


fragmen DNA dalam berbagai PCR. Elektroforesis adalah teknik pemisahan
komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam
sebuah medan listrik.
Elektroforesis pada dasarnya bekerja berdasarkan migrasi atau perpindahan
partikel-partikel bermuatan dalam lingkungan yang memiliki medan listrik dan
kemudian terpisahkan oleh gel elektroforesis tempatnya berpindah. Seluruh molekul
atau fragmen DNA bermuatan negatif, sehingga fragmen DNA akan bergerak
menuju kutub positif (anoda) dengan perpindahan yang sama dalam medan listrik.
Fragmen DNA kemudian terpisahkan berdasarkan kemampuan pergerakannya dalam
matriks gel. Molekul DNA berukuran besar akan mengalami kesulitan untuk

melewati pori-pori gel agarosa, sedangkan molekul DNA berukuran kecil akan lebih
mudah melewati pori-pori gel tersebut. Oleh sebab itu maka mobilitas molekul DNA
dalam gel agarosa pada konsentrasi gel yang sama akan berbeda bergantung pada
ukuran molekul atau fragmen DNA sampel.
Metode elektroforesis yang banyak digunakan untuk menganalisis molekul
DNA adalah elektroforesis horisontal menggunakan gel agarosa. Konsentrasi gel
agarosa yang digunakan untuk elektroforesis harus disesuaikan dengan panjang
amplicon yang diharapkan. Pengaturan kapilaritas gel elektroforesis akan
meningkatkan resolusi analisis hasil PCR secara signifikan, dan hal ini menyebabkan
terjadinya pemisahan molekul DNA berdasar ukuran molekul secara sempurna. Hasil
elektroforesis DNA dapat dianalisis setelah melalui pewarnaan menggunakan
pewarna DNA, pewarna DNA yang paling banyak digunakan adalah ethidium
bromida. Fragmen DNA yang telah diwarnai tersebut ketika diamati dibawah sinar
ultraviolet akan terlihat sebagai pita-pita dalam gel elektroforesis berwarna oranyemerah yang berpendar.
Alat dan bahan beserta fungsi yang digunakan dalam tahapan elektroforesis
adalah :
1. Buffer elektroforesis yang terdiri dari TAE, memiliki daya ion dalam
larutan sebagai pengahantar listrik
2. Loading dye, berfungsi untuk pemberat agar tidak keluar dari sumuran
3. Etadium bromida, sebagai pewarna DNA yang akan menyisip didalam gel
agarosa
4. UV transiluminator, untuk visualisasi pewarna DNA dalam gel agarosa.
5. Aquades, sebagai pelarut.
6. Baki agarosa, sebagai cetakan gel agarosa
7. TAE (Trisbase), sebagai buffer sesuai pH.
8. Asam asetat Glasial, sebagai elektrolit garam.
9. EDTA (Etylen Diamine Tetra Asetic Acid) sebagai pe-non aktif DNA.
10. Sisir elektroforesis, untuk membuat sumuran pada gel agarosa.
11. Tangki elektroforesis, untuk tangki DNA.
12. Mikropipet, untuk mengambil dan menghomogenkan sampel DNA
dengan Loading dye.

Gambar 1.3 Alat Elektroforesis Gel Agarosa


(Sentrabd, 2012)

Pembuatan Gel Agarose


1. 0,4 gram bubuk agarose dilarutkan pada 50 ml Buffer TAE,
dengan cara dipanaskan, diamkan pada suhu 50C.
2. Cetakan gel agarose dipasang pada tangki elektroforesis.
3. Larutan agarose dituangkan pada tangki elektroforesis dan
didinginkan hingga mengeras.
4. Setelah gel mengeras, cetakan gel agarose dapat diambil, dan gel

agarose siap digunakan.


Elektroforesis
1. Gel agarose direndam dengan Buffer TAE.
2. 1l loading dye dicampur dengan 3l produk DNA pada parafilm
yang telah tersedia dengan bantuan mikropipet.
3. Campuran tersebut dimasukan kedalam sumur pada gel agarose.
4. Tangki elektroforesis kemudian ditutup dan dihubungkan ke

power supply.
Dokumentasi
1. Gel agarose hasil elektroforesis direndam dalam larutan EtBr
selama 15
Menit.
2. Dilanjutkan dengan direndam dalam akuades selama 15 menit.
3. Kemuadian gel agarose divisualisasi dengan menggunakan UV
transiluminator, dan didokumentasikan

Gambar 1.4 Hasil Visualisasi Gel Agarose menggunakan UV Transiluminator


(Biomed, 2011)

BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Jenis Praktikum
Praktikum biologi molekuler mengenai isolasi DNA ini menggunakan metode
boiling, dimana metode boiling ini menggunakan pemanasan atau temperature yang
digunakannya.
3.2 Waktu dan Tempat

Hari, tanggal : Selasa-Kamis, 9-11 Februari 2016


Waktu

: 13.00-16.00 WIB

Tempat: Laboratorium Riset FPMIPA B UPI


3.3 Alat dan Bahan
Tabel 3.3.1. Alat
No

Nama Alat

Jumlah

.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9
10.
11.
12.
13.
14.
15.

Tabung Mikro
Waterbath
Sentrifuge
Vortex
Freezer
Mikropipet
Jarum Ose
Tips
Tabung Kuvet
Spektrofotometri
Microwave
Tray
Shaker
Visualisasi Sinar UV
Sarung Tangan non powder

5 buah
1 buah
1 buah
1 buah
1 buah
4 buah
1 buah
Seperlunya
2 buah
1 buah
1 buah
1 buah
1 buah
1 buah
Seperlunya

Tabel 3.3.2. Bahan


No

Nama Bahan

Jumlah

.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.

Larutan PBS
TE 1x
Aquabides
Koloni Bakteri
Agarosa
EtBr 0,02 %
Alkohol
ddH2O
Kertas Parafilm
Loading Dye
Aquadest

1 ml
600 l
Secukupnya
1 loop
Secukupnya
Secukupnya
Secukupnya
Secukupnya
Secukupnya
Secukupnya
Secukupnya

3.4 Cara Kerja


Diagram alur 3.4.1 Isolasi DNA

Bakteri dikultur
dalam media padat
LA selama sekitar
16 jam

1 loop bakteri
dari medium agar
dimasukkan ke
dalam tabung
mikro

Tabung mikro
yang sudah berisi
1ml PBS dan 1
loop bakteri
dihomogenkan

Pellet
ditambahkan
buffer TE 1x
sebanyak 100 l
dan divortex

Supernatan yang
terbentuk
kemudian
dibuang

Suspensi
disentrifugasi
selama 3 menit
dengan kecepatan
5000 rpm

Tabung mikro
dipanaskan di
atas air mendidih
(90-100oC)
selama 10 menit

Disentrifugasi
selama 3 menit
dengan kecepatan
5000 rpm

Lysat yang
terbentuk diambil
sebanyak 100l

Ditambahkan
buffer TE 1x
dingin sebanyak
500l

Dipindahkan ke
dalam tabung 1,5
ml yang baru

Disimpan dalam
freezer dengan suhu
-20OC

Diagram alur 3.4.2 Spektrofotometer

Tabung kuvet
disterilkan dengan
alkohol-aquabidestalkohol

Bagian samping tabung


kuvet dibersihkan
menggunakan kertas
khusus pembersih kuvet

Sampel dimasukkan ke
dalam tabung kuvet

Dari hasil yang


didapatkan dihitung
konsentrasi DNA dan
kemurniaanya

Tabung kuvet yang


telah terisi sampel
dimasukkan ke dalam
spektrofotometri

Absorbansi sampel
ditentukan dengan
spektrogotometer pada
260-280 nm

Diagram alur E.4.3 Elektroforesis

Agarosa dan
TAE/TBE
dicampurkan

Homogenkan di
microwave selama
1,5 menit lalu
ditunggu hingga
dingin

Loading dye
diteteskan pada
kertas parafilm
sebanyak jumlah 15
tetes

Pada tahap running


dibutuhkan waktu
30-60 menit

Setelah dingin
masukkan ke Tray
lalu ditunggu selama
45 menit hingga
terbentuk agarosa

Ditambahkan
dengan sampel dari
setiap kelompoknya
lalu dihomogekan
dengan cara pipeting

Setelah homogen
dimasukkan ke
dalam agar yang
telah dibuat

proses running
berjalan selama 32
menit pada 80-100
volt

Rendam pada
aquades selama 1015 menit

Agar direndam pada


EtBr 0,02 % selama
5 menit dan di
simpan diatas shaker

Pada tahap
pewarnaan/
visualisasi
dibutuhkan waktu
10-30 menit

Pada tahap persiapan


dibutuhkan waktu
selama 45- 75 menit

Visualisasi sinar UV

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN


Dalam praktikum kali ini kami melakukan Isolasi DNA genom dari isolat M,
dan isolat O. Teknik ini merupakan teknik manual, artinya bahwa teknik yang
digunakan hanya sebatas untuk mengetahui keberadaan DNA murni, dan
kuantitasnya saja. Tidak sampai pada proses amplifikasi seperti teknik PCR sehingga
didapatkan hasil ekstrasi DNA. DNA isolasi dari kedua isolat ini kemudian di analisa
secara kuantitatif terlebih dahulu dengan menggunakan spektrofotometer yang
hasilnya merupakan angka-angka ( quantity ). Metoda spektrofotometri ini
merupakan metoda dimana hasilnya akan menunjukan tingkat kemurnian dan
konsentrasi DNA. Mengapa spektrofotometri dapat menunjukan tingkat kemurnian
dan konsentrasi dari suatu DNA? Karena basa nitrogen dari DNA dapat menyerap
sinar UV, semakin tinggi konsentrasi DNA dalam larutan, maka sinar UV akan
semakin terserap. Biasanya pengukuran konsentrasi ini didasarkan pada pengukuran
absorbansi. Pembacaan absorbansi dilakukan pada A260 dimana absorbansi 260 ini
DNA akan menyerap cahaya yang paling kuat. Rumus konsentrasi DNA:
[ DNA ] = A260 x Faktor Pengenceran x 50
A260 merupakan absorbansi panjang gelombang DNA pada 260 m,
sedangkan faktor pengenceran disesuaikan dengan pengenceran yang kami lakukan,
karena sample yang kami ambil sebanyak 1nl, ditambah dengan 499ml aquabidest
maka pengencerannya adalah 500 kali, dan menurut Dr. Ir. Maftuchah, M.P., Dr. Ir.
Aris Winaya: dalam buku Analisis Teknik Dasar Biologi Molekuler
50 merupakan konstanta dari hubungan 1.0 = 50 g untai
ganda DNA murni.
Sedangkan untuk rasio kemurnian DNA, didapatkan dengan membandingkan
Absorbansi 260 dengan Absorbansi 280. Seperti yang telah dipaparkan sebelumnya,
pada absorbansi 260 ini DNA akan menyerap cahaya yang paling kuat, sedangkan
pada absorbansi 280, biasanya digunakan untuk mengukur adanya kontaminan lain.
Maka dari itulah, perbandingan rasio Absorbansi 260 dengan Absorbansi 280
digunakan untuk mendapatkan hasil DNA murni. Berikut adalah rumus untuk
mendapatkan tingkat kemurnian DNA:

Purity=

A 260
A 280

Berikut adalah hasil pengukuran konsentrasi dan kemurnian DNA dengan


spektrofotometri mengguakan sinar UV dari 6 kelompok:
Tabel 1. Hasil Pengamatan Spektrofotometri
Kelompok
1
2
3
4
5
6

Isolat

A260

A280

M
O
M
O
M
O
M
O
M
O
M
O

0,002
0,002
0,009
0,010
0,086
0,100
0,017
0,087
0,091
0,111
0,095
0,111

0,003
0,003
0,006
0,008
0,075
0,088
0,0093
0,079
0,080
0,093
0,082
0,095

[ DNA ]

Purity

Fragmen

mg/ml
50
50
225
250
2150
2500
425
2175
2275
2775
2375
2775

A260/A280
0,67
0,67
1,5
1,25
1,14
1,13
1,86
1,10
1,13
1,19
1,16
1,16

DNA

Dari tabel diatas, kita dapat mengetahui bahwa hasil konsentrasi DNA
kelompok 3 dan 5 memiliki konsentrasi yang paling tinggi diantara kelompok lain
yakni 2775 mg/ml dan 2500 mg/ml. Namun hasil visualisasi gel agarose
menggunakan sinar UV, hasil isolasi DNA kelompok 3 dan 5 tidak menunjukan
terbentuknya fragmen DNA, hal tersebut jika dikaitkan dengan nilai kemurnian yang
didapatkan kelompok tersebut kecil yaitu 1,19 dan 1,13 pada isolat O dan
kemungkinan masih terdapat kontainan lain seperti protein. Sesuai dengan teori
menurut Sambrook dan Russel (2001) dalam Kinasih Prayuni 2008, bahwa:

Hasil isolasi DNA genom memiliki tingkat kemurnian yang baik jika
angkanya berkisar pada 1,8 2,0. Jika <1,8 maka itu menunjukan adanya
kontaminasi dari protein. Jika >2,0 maka itu meunjukan adanya kontaminasi
RNA.

Berbeda dengan hasil konsentrasi yang dimiliki oleh kelompok 1 dan 4,


konsentrasinya paling rendah dibanding dengan empat kelompok lainnya yaitu 50
mg/ml dan 425 mg/ml dengan kemurnian masing-masing 0,67 dan 1,86. Dan
keberadaan fragmen DNAnya sama-sama tidak terlihat juga sama seperti kelompok
1, 3, 4, 5, dan 6. Ini bisa terjadi karena adanya fakor human error, kesalahan terjadi
ketika sedang mengisolasi DNA, salah satunya ketika pengambilan bakteri atau
isolat dari dalam Laminar mengunakan Ose. Pengambilan isolat kurang banyak
sehingga mengakibatkan konsentrasi DNA terlalu sedikit, selain itu, ketika setelah di
lakukan Sentrifugasi, dan melakukan pembuangan supernatan, sepertinya peletnya
ikut terbuang ketika diambil atau disedot oleh micropipet. Bahkan ketika pertama
kali akan melkukan praktikum, kurangnya sifat steril yang dimiliki oleh praktikan,
yang menyebabkan adanya kontaminan pada alat atau bahan yang akan di isolasi.
Selain hal tersebut, tahap homgenisasi yang kecepatannya tidak konstan bahkan
terlalu kencang, yang menyebabkan rusaknya DNA. Maka dari kesalahan-kesalahan
tersebut dapat disimpulkan bahwa sebagian besar hasil Isolasi DNAnya dinyatakan
tidak berhasil.
Terdapat hal yang menarik yang dapat kita ulas dari tabel di atas. Kita dapat
melihat hasil pengukuran yang dilakukan oleh kelompok 2 dan 4. Dari hasil
konsentrasi DNAnya, masing-masing memiliki konsentrasi 225mg/ml dan 425mg/ml
dengan kemurnian masing-masing adalah 1,5 dan 1,86. Jika dikaitkan dengan teori
teori sebelumnya menurut Sambrook, dan teori lainnya, maka kelompok 4 memiliki
tingkat konsentrasi dan kemurnian yang sangat baik, maka seharusnya fragmen DNA
bisa terlihat. Tapi kenyataannya, justru hasil dari kelompok 2 lah yang fragmen DNA
nya terlihat. Menurut kami, ini terjadi karena adanya faktor human error juga, dapat
dibuktikan dengan adanya hasil kemurnian pada kelompok 1 dengan tingkat
kemurnian yang sama yaitu 0,67 pada isolat M maupun O nya. Itu dilakukan dengan
1 kali kalibrasi dengan menggunakan blanko. Tapi pada saat kelompok selanjutnya
melakukan spektro, dilakukan kalibrasi ulang tapi hasil kalibrasi pada alat tidak
menunjukan angka nol. Jadi dapat dipastikan hail spektrofotometri selanjutnya
kurang valid karena tidak dilakukannya 1 kali kalibrasi saja.
Selanjutnya fragmen DNA, dalam tabel di atas, hanya kelompok 2 yang
terlihat fargmen-fragmen DNA nya, dan kelompok lainnya tidak terlihat. Karena
memang sebelumnya hasil isolasi DNAnya tidak berhasil. Fragmen DNA merupakan

hasil visualisasi yang berasal dari analisis kualitatif hasil isolasi DNA. Hasil ini
berasal dari teknik Elektroforesis. elektroforesis ini memiliki fungsi untuk
mengetahui keberadaan DNA tersebut, dengan menggunakan gel agarose, yang hasil
akhirnya gel agarose tersebut diwarnai menggunakan EtBr ( Etdium Bromide ).
Etdium bromide adalah suatu molekul yang dapat mendeteksi DNA dengan cara
molekul ini disisipkan diantara basa fragmen double helix DNA dan diikat oleh basa
nitrogen dari DNA tersebut, yang kemudian memantulkan cahaya dibawah sinar UV.
Jika dengan sinar lainnya etdium bromide akan rusak, maka dari itu proses ini
dilakukan di ruang gelap. Penggunaan sinar UV ini juga mempermudah untuk
melihat fragmen DNA yang kecil agar dapat didokumentasikan dan fragmen DNA
yang terbentuk dapat divisualisasikan. Selain itu, gel agarose yang kami gunakan
adalah berkisar antara 1% - 2% saja. Karena semakin pekat kosentrasi gel agarose
maka akan semakin mempersulit pergerakan atau laju dari molekul DNA. Ini sesuai
dengan teori yang disampaikan oleh Davis, dkk ( 1994: 15 ) bahwa dalam proses
elektoforesis terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi laju pergerakan dari
molekul DNA, salah satunya adalah konsentrasi gel. Davis, dkk ( 1994: 15 )
mengatakan:
Semakin tinggi konsentrasi agarosa, semakin kaku gel yang dibuat
sehingga sukar untuk dilewati molekul-molekul DNA. Konsentrasi agarosa
yang lebih tinggi memudahkan pemisahan DNA yang berukuran kecil,
konsentasi agarosa yang lebih rendah memudahkan pemisahan DNA dengan
ukuran yang lebih besar.

Berikut adalah hasil pengamatan elektroforesis yang kami lakukan:


Gambar 1. Hasil Elektroforesis menggunakan Sinar-UV

Transiluminator (Dokumentasi Pribadi, 2016)


K = Kontrol, F= Fulky

Berdasarkan gambar di atas, maka dapat disimpulkan bahwa hanya kontrol


dan fragmen dari DNA kelompok 2 yang dapat terlihat. Fragmen DNA yang tidak
dapat terbentuk dalam gel agarose mungkin terjadi karena adanya kesalahankesalahan yang telah dijelaskan sebelumnya. Atau memang karena konsentrasi
DNAnya terlalu kecil. Ketika konsentrasi DNA yang didapatkan dari analisis
kuantitatif Spektrofotometri terlalu kecil, terkadang tidak akan terbaca oleh hasil
analisis kualitatif berdasarkan Elektroforesis. Yang kemudian terbukti pada beberapa
kelompok yang tidak terlihat fragmen DNAnya rata-rata mereka memiliki
konsentrasi DNA yang sangat rendah. Maka dapat kami simpulkan, terdapat
hubungan antara ketiga proses praktikum yang kami lakukan, ketika Isolasi DNA

tidak berhasil, pasti hasilnya akan mempengaruhi salah satu analisis nya, bisa
kuantitatif atau kualitatif. Jika diambil contoh, ketika konsentrasi atau kemurniannya
terlalu rendah, maka analisis kualitatif tidak akan tervisualisasikan. Dikarenakan
Etbr yang terikat oleh basa nitrogen menyebabkan pita pita tidak dapat
tervisualisasikan.

DAFTAR PUSTAKA

Alberts, B., Bray, J. L. dan Roff, M. 1994. Molecular Biology of The Cell. Garland
Pubkishing: New York.
Campbell, A. N., J. B. Reece & L. G. Mitchell. 2002. Biologi. Ed.ke-5 jilid 1. terj
dari Biology. 5th ed, oleh Lestari, R. Erlangga. Jakarta: xxi + 438 hlm.
Campbell, A. N., J. B. Reece & L. G. Mitchell. 2003. Biologi. Ed.ke-5 jilid 2. terj
dari Biology. 5th ed, oleh Lestari, R. Erlangga. Jakarta: xxii + 404 hlm.
Campbell, N., et al. 2007 Biology : Eight Edition. California : Pearson
Cheng, L., Zhang D. Y. 2008. Molecular Genetic Pathology. New Jersey : Humana
Press
Davis, L., M. Kuehl, & J. Battey. 1994. Basic methods: Molecular biology. 2nd
ed. Appleton & Lange, Norwola [ Diakses : 11 Februari 2016 ]
Dr. Ir. Maftuchah, M.P., Dr. Ir. Aris Winaya: dalam Analisis Teknik Dasar Biologi
Molekuler.

[Online]

Tersedia:

https://books.google.co.id/books?

id=MrfSCQAAQBAJ&pg=PA65&lpg=PA65&dq=absorbansi+260+adal
ah&source=bl&ots=Au4iYjk115&sig=d4oA6wQ9qDRuYx9eHzCg6DL
yOPk&hl=en&sa=X&ved=0ahUKEwj9g5ChqvLKAhXEnaYKHYKtDh
IQ6AEIMDAC#v=onepage&q=absorbansi%20260%20adalah&f=false
[ Diakses : 11 Februari 2016 ]
Klug, W. S. & M. R. Cummings. 1994. Concept of genetics. 4th ed. Prentice Hall,
New Jersey: ix + 773 hlm.
Lewis, R. 2003. Human genetics: Concepts and applications. The McGraw-Hills
Company, Inc., Boston: xviii + 454 hlm.
Raven, P.H. & G.B. Johnson. 2002. Biology. 6th ed. McGraw-Hill
Reece, J. B., et al. 2012. Campbell Biology Concept and Connections : Concept and
Connection. California : Pearson
Sambrook dan Russell (2001: A8.20-A8.21) dalam Prayuni Kinarsih. 2008. Isolasi
DNA

Genom

Padi

(Oryza

sativa).

[Online]

Tersedia

http://lib.ui.ac.id/file?file=digital/124126-BIO.010-08-Isolasi%20danAnalisis.pdf [ Diakses : 11 Februari 2016 ]


Stansfield, W. D dan S. L. Elrod., 2007. Schaums Outlines Teori dan Soal-Soal
Genetika, Edisi Keempat. Terjemahan Damaring Tyas W. dan A. Safitri.
Penerbit Erlangga, Jakarta.

Subandiyah, S. 2006. Polymerase Chain Reaction untuk Deteksi atau Identifikasi


Patogen Tumbuhan. Beberapa Metode Ekstraksi DNA. Pelatihan dan
Workshop Identifikasi DNA dengan Aplikasi PCR. Malang. hlm. 43-5
Suryo, H. 2005. Genetika strata 1. 9th. Ed. Gadjah mada University Press,
Yogyakarta: xvi + 344 hlm.
Triwibowo, Y. 2005. Biologi Molekular. Erlangga, Jakarta: xiii + 269 hlm.
University of Utah. 2005. DNA Extraction from Wheat Germ.(?): 3 hlm.
Wolfe, S. L. 1993. Molecular and cellular biology. Wodsworth