LAPORAN PRAKTIKUM ISOLASI DNA GENOM PADA TUMBUHAN

Disusun Untuk Memenuhi Tugas Mata Kuliah Biologi Molekuler

Dosen Pengampu:
Dr. Yustinus Ulung Anggraito, M.si.
Dr. Ning Setiati, M.si.

Disusun oleh:
Dwi Setyorini (0402518016)

PENDIDIKAN IPA KONSENTRASI BIOLOGI

PROGRAM PASCASARJANA
UNIVERSITAS NEGERI SEMARANG
2019

1
 KATA PENGANTAR

Puji dan syukur kami panjatkan kehadirat Allah SWT, atas segala limpahan
rahmat dan hidayah-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan penyusunan
“Laporan Praktikum DNA Genom Pada Tumbuhan”. Dalam kesempatan ini tidak
lupa penulis menyampaikan ucapan terima kasih kepada semua pihak yang telah
membantu dalam penyusunan makalah ini, diantaranya: Dr. Yustinus Ulung
Anggraito, M.si. dan Dr. Ning Setiati, M.si., selaku dosen pengampu Mata Kuliah
Biologi Molekuler.
Kritik dan saran yang bersifat membangun dari semua pihak sangat penulis
harapkan untuk kesempurnaan laporan ini. Akhirnya penulis berharap semoga
laporan ini dapat bermanfaat bagi semua pihak yang terkait pada umumnya dan bagi
penulis pada khususnya.

Semarang, 28 Juni 2018

Penulis

2
 BAB I
PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

DNA merupakan materi yang membentuk kromosom-kromosom dan juga
merupakan informasi genetik yang tersimpan dalam tubuh makhluk hidup. Informasi
genetik ini pada dasarnya merupakan kumpulan instruksi/perintah yang mengatur sel
untuk bisa melakukan hal-hal tertentu. DNA singkatan darideoxyribonucleic acid,
atau dalam Bahasa Indonesia disebut dengan Asam Deoksiribosa Nukleat atau ADN.
Kata deoxyrybo mengacu pada nama gula yang terkandung dalam DNA, yaitu
deoxyrybose (deoksiribosa) (Tohib, 2012).
Susunan kimia DNA adalah polimer berupa rantai panjang dari nukleotida.
Perlu Kamu ingat bahwa satu nukleotida terdiri dari satu gugus fosfat, satu komponen
gula pentosa (5-karbon), dan satu basa nitrogen. Satu-satunya pembeda tiap
nukleotida ialah basa nitrogen. Hanya ada 4 kemungkinan basa yang terdapat pada
tiap satu nukloetida DNA, yaitu adenine (A), guanine (G), thymine (T), ataucytosine
(C). Variasi urutan dari keempat basa-basa tersebut membentuk suatu kode genetik
pada sel. Mungkin hal ini dirasa aneh, hanya dengan 4 huruf yang terdapat pada
DNA, suatu informasi genetik yang berbeda-beda dapat diwariskan pada keturunan
makhluk hidup. Itu sebenarnya wajar saja, karena pada kromosom terdapat berjuta-
juta nukleotida, maka sangat banyak kombinasi yang berbeda meskipun hanya berasal
dari 4 huruf tersebut. James Watson dan Francis Crick memenangkan Nobel di tahun
1962 mengenai model penyatuan sturktur DNA. Bersama dengan Rosalind Franklin
dan Maurice Wilkins, mereka menyatakan bahwa struktur DNA merupakan dua
untaian nukleotida yang disebut dengan double helix, dimana untaian tersebut
tersusun secara spiral dengan posisi gula dan gugus fosfat terletak di sisi luar dan
basa-basa nitrogen saling berpasangan di sisi dalam (menyambung kedua untaian
tersebut).

3
 DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang anti pararel dengan
komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat dan
pasangan basa. Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan
bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap dari
materi genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi
kromosom. DNA juga dapat diisolasi, baik pada manusia maupun tumbuhan. Isolasi
DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada dua,
yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan
campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat
molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada
pada bagian atas tabung (Aditia, 2010).
DNA pada organisme tingkat tinggi seperti manusia, hewan dantumbuhan
terdapat di dalam inti sel, dan beberapa organ lain didalam sel seperti mitokondria
dan kloroplast. Penyebutan nama DNAjuga didasarkan pada lokasi asalnya. DNA
genome inti nuclear DNA genome berasal dari inti sel, DNA genom mitokondria &
mitochondrial DNA genome berasal dari mitokondria, DNA genomkloroplast berasal
dari kloroplast. Pada organisme tingkatrendah, DNA penyusun kromosom dan
plasmid dibungkus oleh dindingsel &pada bakteri atau dibungkus oleh protein
tertentu pada. kromosom eukariot berbentuk linear sedangkan kromosom prokariot
berbentuk sirkular. selain itu prokariot juga mengandung satu atau lebih plasmid.
Plasmid merupakan mulekul DNA sirkular dengan ukuran yang jauh lebih kecil
dibanding kromosom (Anggie, 2011).
Molekul DNA dalam suatu sel dapat diekstraksi atau diisolasi untuk berbagai
macam keperluan seperti amplifikasi dan analisis DNA melalui elektroforesis. Isolasi
DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti
protein, lemak, dan karbohidrat. Berdasarkan latar belakang tersebut, perlu
diperhatikan dalam penggembangan molekuler yang berperan penting dalam
keanekaragaman dari makhluk hidup. Oleh karena itu, dalam praktikum ini
melaksanakan percoabaan dengan metode isolasi DNA pada genom tumbuha, dengan

4
menggunaaan alat PCR dan pembacaan dengan elekytroforensis. DNA merupakan
substansi genetik dari tiap makhluk hidup, yang sangat rumit sehingga untuk dapat
mengetahui panjang gelombang pita DNA diperlukan suau metode dan tahapan yang
akan dijelaskan pada pembahasan selanjutnya.
1.2. Rumusan Masalah
Dari uraian latar belakang di atas, dapat diperoleh rumusan masalah
“Bagaimana hasil representasi pita basa dari isolasi DNA genom pada beberapa
tumbuhan?”
1.3. Tujuan
Adapun rumusan masalah dalam praktikum kali ini ialah untuk menganalisis
dan mendeskripsikan secara kualitatif hasil representasi panjang pita basa dari isolasi
DNA genom pada jaringan tumbuhan. Selain itu dapat memberikan informasi
mengenai penggunaan dan tahapan PCR, isolasi DNA, dan Elektroforesis dengan
baik.

5
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Ekstraksi DNA

Proses ekstraksi DNA dilakukan untuk memperoleh DNA yang murni tanpa
bahan pengotor berupa protein maupun RNA. Ekstraksi dilakukan dengan
menambahkan beberapa pelarut ataupun nitrogen cair untuk melisis jaringan. Proses
ekstraksi merupakan tahap krusial untuk memperoleh DNA (Dwiyitno, 2008). Hasil
ekstraksi akan digunakan sebagai DNA cetakan yang akan diperbanyak dengan
metode enzimatis yaitu melalui proses PCR. Proses ekstraksi DNA untuk melisis sel,
dan kemudian mendegradasi protein dan melarutkan komponen selular lain sehingga
akan diperoleh DNA. Perusahaan yang memproduksi kit menyediakan larutan yang
dapat langsung digunakan dan ditambahkan dalam proses ekstraksi DNA (Baker
2000).

Ada beberapa tahap dasar dalam ekstraksi DNA, yang rinciannya dapat
berbeda tergantung jenis sampel dan senyawa yang mempengaruhi ekstraksi dan
analisis lanjut. Berikut ini tahap-tahapnya yaitu:

1. Memecahkan sel (lisis) melalui sonikasi, dan menghancurkan lipid membran

dengan penambahan detergen seperti SDS. Melakukan vorteks dengan fenol
(kadang-kadang dipanaskan) sering efektif untuk memecahkan protein
dinding sel.
2. Mengeluarkan sel dan protein histon yang terikat dengan DNA melalui
penambahan protease dalam presipitasi dengan garam atau asetat ammonium,
atau dengan menggunakan ekstrasi fenol-ktoroform.
3. Presipitasi DNA dalam etanol atau isopropanol dingin, DNA dapat larut di
dalam alkohol dan berikatan bersama, tahap ini juga melepaskan garam. Cuci

6
 pelet DNA dengan alkohol taq dan sentrifugasi untuk mendapatkan kembali
peletnya.
4. Melarutkan DNA dalam buffer alkalin
Tahap pertama prosedur ekstraksi DNA adalah memanaskan sejumlah
jaringan dalam larutan Chelex. Pemanasan tersebut membantu memecahkan sel dan
mendenaturasi protein. Chelex melindungi sampel dari DNAse dan mencegah sampel
dari kontaminan.

2.2 Polymerase Chain Reaction (PCR)

Polymerase chain reaction (PCR) adalah suatu reaksi in-vitro untuk

menggandakan molekul DNA pada target tertentu dengan cara menyintesis molekul
DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA tersebut dengan enzim
polimerase dan oligonukleotida pendek sebagai primer. Metode ini berjalan secara
enzimatik melalui mekanisme perubahan suhu. Target PCR yaitu asam nukleat
(DNA) untai ganda yang diekstraksi dari sel dan terdenaturasi menjadi asam nukleat
beruntai tunggal.

Komponen reaksi PCR terdiri atas template DNA, pasangan primer berupa
oligonukleotida spesifik untuk target gen yang dipilih, enzim (umumnya Taq
polymerase, enzim thermostable dan thermoactive yang berasal dari Thermus
aquaticus), larutan penyangga dan trifosfat deoxynucleoside (dNTP) yang digunakan
untuk amplifikasi target gen secara eksponensial dengan hasil replikasi ganda dari
target awal (Muladno, 2010; Gaffar, 2007; Sulistyaningsih, 2007). Reaksi ini
dilakukan dalam suatu mesin pemanas yang diprogram secara otomatis disebut
thermocycler. Mesin tersebut menyediakan kondisi termal yang diperlukan untuk
proses amplifikasi (Nollet dan Toldrá, 2011).

1. Template DNA

7
 Template DNA adalah molekul DNA untai ganda yang mengandung sekuen
target yang akan diamplifikasi. Ukuran DNA bukan merupakan faktor utama
keberhasilan PCR. Berapapun panjangnya jika tidak mengandung sekuen yang
diinginkan, maka proses PCR tidak akan berhasil. Namun sebaliknya, jika ukuran
DNA tidak terlalu panjang tapi mengandung sekuen yang diinginkan maka PCR akan
berhasil (Sulistyaningsih, 2007). Konsentrasi DNA juga dapat mempengaruhi
keberhasilan PCR. Jika konsentrasinya terlalu rendah maka primer mungkin tidak
dapat menemukan target dan jika konsentrasi terlalu tinggi akan meningkatkan
kemungkinan mispriming. Perlu diperhatikan kemurnian template karena akan
mempengaruhi hasil reaksi (Sulistyaningsih, 2007).

2. Primer

Susunan primer merupakan salah satu kunci keberhasilan PCR. Pasangan

primer terdiri dari 2 oligonukleotida yang mengandung 18-28 nukleotida dan
mempunyai 40-60% GC content. Sekuen primer yang lebih pendek akan memicu
amplifikasi produk PCR non spesifik. Ujung 3' primer penting dalam menentukan
spesifisitas dan sensitivitas PCR. Ujung ini tidak boleh mempunyai 3 atau lebih basa
G atau C, karena dapat menstabilkan annealing primer non spesifik. Ujung 3' kedua
primer tidak boleh komplementer satu dengan yang lain karena hal ini akan
mengakibatkan pembentukan primer-dimer yang akan menurunkan hasil produk yang
diinginkan. Ujung 5' primer tidak terlalu penting untuk annealing primer, sehingga
memungkinkan untuk menambahkan sekuen tertentu, misalnya sisi restriksi enzim,
start codon ATG atau sekuen promoter (Sulistyaningsih, 2007).

3. Enzim DNA Polymerase

DNA polimerase adalah enzim yang mengkatalisis polimerisasi DNA. Dalam

perkembangannya, banyak digunakan enzim Taq DNA polymerase yang memiliki
keaktifan pada suhu tinggi, sehingga penambahan enzim tidak perlu dilakukan di
setiap siklus dan proses PCR dapat dilakukan dalam satu mesin (Gaffar, 2007).

8
Enzim Taq DNA polymerase terdiri atas dua macam yaitu enzim alami yang diisolasi
dari sel bakteri Thermus aquaticus dan enzim rekombinan yang disintesis di dalam sel
bakteri Escherichia coli (Muladno, 2010). Enzim ini masih mempunyai aktivitas
eksonuklease dari 5' ke 3' tetapi tidak mempunyai aktivitas eksonuklease dari 3' ke 5'.
Konsentrasi enzim yang dibutuhkan untuk PCR biasanya 0,5-2,5 unit. Kelebihan
jumlah enzim mengakibatkan akumulasi produk non spesifik, sedangkan jika terlalu
rendah maka dihasilkan sedikit produk yang diinginkan (Sulistyaningsih, 2007).

4. Larutan buffer
Larutan buffer yang biasa digunakan untuk reaksi PCR mengandung Tris-
HCL 10 mM pH 8,3, KCl 50 mM dan MgCl2 1,5 mM. Optimalisasi konsentrasi ion
Mg2+ merupakan hal yang penting. Konsentrasi ion ini mempengaruhi beberapa hal
yaitu annealing primer, suhu pemisahan untai template dan produk PCR, spesifisitas
produk, pembentukan primer-dimer serta aktivitas dan ketepatan enzim Taq
Polymerase. PCR harus mengandung 0,5-2,5 μM Mg2+ dari total konsentrasi dNTP.
Konsentrasi yang lebih tinggi akan meningkatkan produk PCR, tetapi menurunkan
spesifisitasnya. Konsentrasi ion ini tergantung pada konsentrasi bahan-bahan yang
mengikatnya seperti dNTP, EDTA dan fosfat (Sulistyaningsih, 2007).
5. Deoxynucleotide Triphosphate (dNTP)
Deoxynucleotide Triphosphate merupakan material utama untuk sintesis DNA
dalam proses PCR yang terdiri dari dATP, dGTP, dCTP, dan dTTP. Konsentrasi
dNTP yang masing-masing sebesar 20-200 μM dapat menghasilkan keseimbangan
optimal antara hasil, spesifisitas dan ketepatan PCR. Konsentrasi masing-masing
dNTP harus seimbang untuk meminimalkan kesalahan penggabungan.
Deoxynucleotide Triphosphate akan menurunkan Mg2+ bebas, sehingga
mempengaruhi aktivitas polimerase dan menurunkan annealing primer. Konsentrasi
dNTP yang rendah akan meminimalkan mispriming pada daerah non target dan
menurunkan kemungkinan perpanjangan nukleotida yang salah. Dengan demikian,

9
spesifisitas dan ketepatan PCR meningkat pada konsentrasi dNTP yang lebih rendah
(Sulistyaningsih, 2007).

2.2.1. Prinsip Dasar PCR

PCR digunakan untuk mengamplifikasi gen tunggal, bagian gen, atau urutan
non-kode DNA. PCR akan membuat sekitar 40 milyar salinan dan DNA cetakan.
Kebanyakan metode PCR dapat mengamplifikasi fragmen DNA sampai 10 kilo
pasang basa (kb), meskipun beberapa teknik dapat mengamplifikasi fragmen
berukuran sampai 40 kb. PCR biasanya terdiri atas 20 sampai 35 siklus. Kebanyakan
PCR dilakukan dalam tiga tahap, yang didahului satu suhu tetap untuk awal dan
diikuti satu suhu lagi untuk akhir. Tahap-tahap tersebut yaitu:

1. Tahap Inisiasi. Sebelum tahap inisiasi reaksi PCR sering dipanaskan pada
suhu 94-96°C (atau 98°C jika menggunakan polimerase termostabil), selama
1-9 menit. Ini berguna untuk menjamin banyak cetakan DNA dan primer
terdenaturasi yaitu putusnya ikatan hidrogen basa-basa komplemen rantai
DNA untuk menghasilkan rantai tunggal DNA. Beberapa polimerase PCR
juga membutukan kondisi tahap ini untuk aktivasi (PCR awal-panas). Setelah
itu, mulai siklus dengan tahap satu pada 94-98°C selama 20-30 detik (tahap
denaturasi).
2. Tahap Annealing. Dalam tahap ini suhu diturunkan sehingga primer dapat
menempel pada cetakan DNA rantai tunggal. Gerakan Brownian
menyebabkan primer bergerak di ikatan hidrogen DNA - DNA yang secara
konstan dibentuk dan diputuskan antara dan cetakan. Ikatan stabil hanya
terbentuk bila urutan primer sangat dengan urutan cetakan. Bagian pendek
rantai ganda ini dikatalisis oleh polimerase untuk memulai sintesis DNA. pada
tahap ini bergantung pada suhu primer dan biasanya antara 50-64 °C selama
20-40 detik.

10
 3. Tahap Ekstensi/pemanjangan yaitu polimerase memperpanjang rantai DNA
yang komplemen dengan rantai cetakan. Suhu pada tahap ini bergantung pada
DNA polimerase yang digunakan. Polimerase Taq mempunyai suhu optimum
70-74°C. Umumnya reaksi ini menggunakan suhu 72°C. DNA polimerase
melakukan kondensasi 5'- fosfat dNTP dengan gugus 5'- hidroksil ujung awal
rantai DNA yang komplemen dengan cetakan dalam arah 5' ke 3'.
Pemanjangan bergantung pada DNA polimerase dan panjang bagian DNA
akan diamplifikasi. Tahap elongasi akhir selama 5-15 menit (tergantung
panjang cetakan DNA) setelah siklus terakhir digunakan untuk menjamin
DNA rantai tunggal sisa diperpanjang seluruhnya. Akhimya jaga suhu 4-15°C
selama waktu terbatas untuk penyimpanan singkat seiama reaksi misalnya jika
reaksi dikerjakan semalam.
2.2.2. Elektroforesis
Elektroforesis adalah suatu proses yang dapat memisahkan atau memigrasikan
fragmen DNA pada matriks berpori di bawah pengaruh medan listrik. Elektroforesis
dilakukan untuk menentukan keutuhan DNA total (Novitasari, 2014). Elektroforesis
adalah suatu cara analisis kimiawi yang didasarkan pada pergerakan molekul-molekul
protein bermuatan di dalam medan listrik (titik isoelektrik). Pergerakan molekul
dalam medan listrik dipengaruhi oleh bentuk, ukuran, besar muatan dan sifat kimia
dari molekul (Titrawani, 1996).
Menurut Tirtawani 1996 teknik elektroforensis dapat dibedakan menjadi dua
cara yaitu: elektroforesis larutan dan elektroforesis daerah. Pada teknik larutan,
larutan penyangga yang mngandung makro-molekul ditempatkan dalam suatu kamar
tertutup dan dialiri arus listrik. Kecepaatan migrasi dari molekul makro-molekul
diukur dengan pelarut. Teknik elektroforensis daerah adalah menggunakan suatu
bahan padat yang berfungsi sebagai media penunjang yang berisi larutan penyangga.

11
 BAB III
METODEOLOGI

3.1. Alat dan Bahan:

Adapun alat dan bahan yang digunakan dalam praktikum kali ini ialah sebaga
berikut:
Alat Bahan
1. Mortar dan pistil 1. Daun singkong
2. Microtube 1,5 ml 2. Alkohol 70%
3. Micropipet 3. 400 ul GPX1 Buffer
4. Microtip 4. 5 ul RNAse
5. Microwave 5. 100 ul elution buffer
6. Waterbath 6. 100 ul GP2 Buffer
7. Vortex 7. 400 ul W1 Buffer
8. Tube sampel 8. 600 ul wash buffer
9. Sentrifus 9. Gel agarose
10. Freezer 10. 1 ul loading dye
11. Spatula 11. Tris Acetic Acid EDTA
12. Collection tube 12. EtBr (Ethidium Bromide)
13. Filter coloumn
14. GD coloumn
15. GelDoc UV Transilumintor

3.2. Prosedur Kerja

1. Ekstraksi DNA
a. Membersihkan sampel daun dengan alkohol 70%
b. Memotong dan menimbang sampel 100 mg
c. Menghancurkan sampel dengan mortar dan alu hingga seperti bubuk
d. Memindahkan sampel pada mikrotube 1,5 ml
2. Lysis

12
a. Menabahkan 400 ul GPX1 Buffer dan 5 ul RNAse A ke dalam tube
sampel dan votex hingga homogen
b. Menginkubasi dengan waterbath 60o C selama 10 menit dan invert setiap
5 menit sekali (inkubasi juga Elution Buffer 200 ul per sampel) suhu 600
C (pre-heat)
c. Menambahkan 100 ul GP Buffer, vortex, kemudian inkubasi dalam
freezer selama 3 menit
d. memindahkan sampel ke filter column dan letakkan di collection tube
e. mesentrifuse selama 1 menit dengan kecepatan 3000 rpm
f. meindahkan supernatan dari collection tube ke mocro tube baru
A. DNA Binding
1) Menambahkan GP3 Buffer sebanyak 1,5 volume supernatan,
kemudian vortex 3 detik
2) Selanjutnya memindahkan 700 ul larutan GD Column yang sudah
diletakkan di Collection Tube dan mensentrifuse 12000 rpm
selama 2 menit
3) Membuang cairan yang terdapat di Collection Tube dan
meletakkan kembali GD Column ke Collection Tube
4) menambahkan sisa larutan ke GD Column dan sentrifuse dengan
kecepatan dan waktu yang sama
5) Membuang cairan yang terdapat di Collection Tube dan pasang
kembali GD Column pada Collection Tube
B. Washing
1) Tambahkan 400 ul W1 Bufer GD column dan sentrifuse 12000
rpm selama 30 detik
2) Membuang cairan yang di collection tube dan memasang kembali
GD Column ke Collection Tube
3) Menambahkan 600 ul wash buffer ke GD Column dan sentrifuse
12000 rpm selama 30 detik
4) Membuang lagi cairan yang dicellection tube dan memasang
kembali GD column ke collection tube
5) Mesentrifuse 12000 rpm selama 3 menit
C. DNA elution
1) Memindahkan GD column yang kering ke mikro tube baru
berikutnya menambahkan 100 ul elution buffer yang sudah
dipanaskan ke tengah column matriks

13
 2) Menambahkan 100 ul elution buffer yang sudah dipanaskan ke
tengah kolom matrix
3) Mendiamkan 5 menit elution buffer benar-benar terabsobsi
4) Mensentrifuse 12000 rpm selama 30 detik untuk melarutkan DNA
murni.

Pembuatan Cocktail/ mix PCR

Konsentrasi Bahan Volume (ul)
30 – 50 ng/ul DNA Template 1
2X Dream Taq Green PCR Master Mix 6,25
10 ng/ul Primer forward 1
10 ng/ul Primer reverse 1
Water free nuclease 3,25
Total 12,5

Program PCR yang digunakan untuk 35 siklus

Proses Suhu (°C) Waktu
Pre-denaturasi 95 4 menit
Denaturasi 95 30 detik
Annealing 51,4 30 detik
Extention 72 1 menit
Final-extention 72 10 menit
Total 12,5

Elektroforesis

1. Menimbang gel 0,4 gram kemudian melarutkan dengan 40 ml Tris acetid acid
EDTA (TAE) 1x
2. Memanaskan larutan dalam microwave sampai agarose larut dan larutan
menjadi jernih
3. Selanjutnya memasukannya kedalam cetakan yang telah dipasang sisir,
kemudian menunggu hingga mengeras
4. Setelah mengeras, memasukan gel ke dalam bak elektroforesis yang telah diisi
buffer TAE 1x hingga gel terendam
5. Mencampur larutan sebanyak 3 ul larutan DNA dengan 1 ul loading dye,
kemudian memasukannya ke dalam sumur-sumur gel
6. Memasukan DNA ladder pada salah satu sumur letak pada ujung

14
7. Running dilakukan pada 120 volt selama 30 menit
8. Melakukan pewarnaan dengan cara gel direndam dalam EtBr (Ethidium
Bromide) selama 5 menit dan dibilas dalam buffer TAE 1x
9. Mevisualisasi gel dilakukan dengan menggunakan alat GelDoc UV
Transiluminator

15
 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil Praktikum

Berdasarkan hasil praktikum di peroleh sebagai berikut:
Tahapan Hasil
Ekstraksi Sel Jaringan Pada
Daun Singkong

Elektroforesis Isolasi DNA

16
 Elektroforesis dengan PCR

Kemurnian DNA

Tabel 4.1. Tabel Hasil Praktikum Dengan Tahapan Pelaksanaannya

4.2. Pembahasan
Berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan diperoleh bahwa pada tahapan
ekstraksi DNA daun singkong yang digerus dengan lumpang dan alu, terlihat ketika
menambahkan dengan larutan buffer dan RNAse tidak terjadi perubahan warna
menjadi hijau. Hal ini dikarenakan dalam proses pengekstraksian bahan yang
digunakan ytergerus dengan alat dalam keadaan basah sehingga susah untuk menjadi
tepung. Slain itu, tekstur yang masih kasar sehingga larutan baffer dan RNAse sulit
meluluhkan jaringan sehingga nantinya akan memperoleh DNA dari tanaman
tersebut.

17
 Analisis DNA dimulai dengan melakukan ekstraksi DNA total dari daun
tanaman mangga, durian, papaya, dan singkong. Ada tiga tahap utama dalam
ekstraksi DNA ini, yaitu perusakan dinding dan membrane sel (lisis), pemisahan
DNA dari makromulekul seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA
(Surzycki, 2000). Pada tahapan isolasi DNA hasil elektroforesis yang diperoleh dari
keseluruhan sampel banyak tidak terlihat representasi dari pita DNA. Untuk isolasi
DNA dilakukan penggulangan dalam memasukan kedalam sumuran. Yang dari hasi
diatas terlihat hanya ada pada penggulangan kedua dan pada sampel daun
elektroforesis hanya pada pita 1b (Durian) sedangkan pita yang lain tidak muncul.
Pita DNA yang tidak muncul yaitu pada pita 2 (singkong), pita 3 (papaya), pita 4
(singkong), dan pita 5 (mangga). Pita DNA yang tidak muncul menandakan bahwa
sampel tersebut memiliki konsentrasi yang sangat sedikit dan telah terjadi
kontaminan pada saat praktikum. Durian menunjukkan konsentrasi DNA yang paling
banyak dibandingkan dengan sampel lainnya. DNA juga menunjukkan smear pada
pita DNA. Pada hasil elektroforesis diketahui bahwa smear hanya terdapat pada
sampel durian. Sedangkan pada sampel yang lain tidak terdapat smear sama sekali.
Hal ini sejalan menurut Irmawati (2003) ang mengatakan bahwa semakin sedikit atau
tidak ada smear menunjukkan semakin baik kualitas DNA.
Pada hasil elektroforsis yang digunakan terlihat bahwa terdapat 4 sampel (1,
2, 3, dan 4) yang dapat diamplifikasi dengan primer trnL-F (forward) dan trnL-F
(reverse). Keterangan dari ke-4 sampel tersebut yaitu: sampel 1 (Durian); sampel 2
(Singkong); sampel 3 (Pepaya); dan sampel 4 (Singkong). Sedangkan sampel 5
(Mangga) tidak dapat diamplifikasi karena tidak terbentuk pita. Ukuran hasil
amplifikasi tidak bisa praktikan prediksi karena kesalahan praktikan tidak mengetahui
ukuran DNA leeder dan jarak pita antar DNA Marker yang berdekatan. Terdapat
beberapa faktor yang menyebabkan tidak berhasilnya amplifikasi PCR yaitu
komposisi PCR (kerusakan PCR pada Green Master Mix), suhu annealing dan primer
yang tidak sesuai. Yuwono (2006) menyebutkan bahwa pada saat proses annealing,
primer akan menempel pada untaian DNA yang telah terpisah menjadi untai tunggal.

18
Primer tersebut akan membentuk jembatan hydrogen dengan untaian DNA pada
daerah sekuens komplementer dengan sekuens primer. Pada sampel dengan pita DNA
yang muncul, juga terdapat DNA smear. Menurut Fatchiyah (2009), DNA smear
dapat disebabkan oleh berlebihnya pemakaian Mg++, dNTP, Taq polimerase, primer,
dan DNA templete atau adanya kontaminan pada DNA templete sehingga
menghambat aktivitas taq polimerase. Berdasarkan hasil dari kelompok dengan
menggunakan bahan daun singkong, Durian dan pepaya memperoleh pajang pita
DNA yaitu 350 bp. Sedangkan untuk sampel singkong 2 yaitu 340 bp dan untuk
mangga tidak terlihat pajang pita DNA.
Pada tahapan terakhir yaitu kemurnian sampel DNA yang menunjukan
Kemurnian DNA dari hasil elektroforesis dikonfirmasi dengan uji kuantitatif
menggunakan spektrofotometer. Hasil kemurnian DNA dengan menggunakan
spektrofotometer menunjukkan semua sampel memiliki nilai absorbansi negatif.
Menurut praktikan nilai absorbansi yang negatif kemungkinan disebabkan karena
cuvet untuk pengukuran sampel dan blangko berbeda, dinding cuvet tidak bersih,
tersentuh jari praktikan, atau kemungkinan karena cuvet baru saja dipakai untuk
larutan yang lebih pekat. Oleh karena itu seharusnya saat praktikum menggunakan 1
cuvet untuk semua pengukuran, usahakan dinding cuvet jangan tersentuh dengan jari,
mencuci cuvet setiap selesai mengukur absorbansi suatu larutan dengan pelarut yang
dipakai untuk membuat sampel benar-benar bersih, serta selalu mengecek titik nol
setiap kali pengukuran agar stabil. Uji kuantitas kemurnian DNA menggunakan
spektrofotometer.
Dalam penelitian ini secara umum telah berhasil terlihat dengan adanya pita
DNA pada proses elektroforesis. Walaupun dalam prose isolasi DNA yang
memperoleh hampir semua sampel tidak terlihat pita DNA.

19
 BAB V
PENUTUP

5.1. Kesimpulan
Berdasarkan percobaan yang dilakukan dan pembahasan yang dipaparkan pada
percobaan diatas maka dapt disimpulkan bahwa:
1. Hasil elektroforesis diketahui bahwa smear hanya terdapat pada sampel durian.
Sedangkan pada sampel yang lain tidak terdapat smear sama sekali. Semakin
sedikit atau tidak ada smear menunjukkan semakin baik kualitas DNA. Bahan
daun singkong, durian dan pepaya memperoleh pajang pita DNA yaitu 350 bp.
Sedangkan untuk sampel singkong 2 yaitu 340 bp dan untuk mangga tidak terlihat
pajang pita DNA.
2. Hasil elektroforesis dikonfirmasi dengan uji kuantitatif menggunakan
spektrofotometer. Hasil kemurnian DNA menunjukan semua sampel memiliki
nilai absorbansi negatif. Nilai absorbansi yang negatif kemungkinan disebabkan
karena cuvet untuk pengukuran sampel dan blangko berbeda, dinding cuvet tidak
bersih, tersentuh jari praktikan, atau kemungkinan karena cuvet baru saja dipakai
untuk larutan yang lebih pekat.

5.2. Saran
1. Dianjurkan untuk lebih teliti supaya menghindari kontaminasi.
2. Dianjurkan untuk tidak memegang langsung dinding cuvet.

20
 DAFTAR PUSTAKA

Aditia. 2010. Isolasi DNA. (online)

http://sharkestaditia.academia.edu/2010/03/isolasiDNA.html. Diakses 28 Juni
2019
Anggie. 2011. Manfaat Isolasi DNA. (online) .
http://anggiemyblog.academia.edu/2011/04/laporan-isolasi-dna.html. Diakses
tanggal 30 Maret 2018
Fatchiyah, dkk. 2012. Buku Praktikum Teknik Analisis Biologi Molekular. Jurusan
Biologi. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Universitas
Brawijaya. Malang.
Novita S., Elyvra R dan Roslim D.I.2014. Teknik Isolasi Dan Elektroforesis DNA
Total Pada Kryptopterus apogon (Bleeker 1851) Dari Sungai Kampar Kiri Dan
Tapung Hilir Kabupaten Kampar Provinsi Riau. JOM FMIPA. Volume 1 No. 2
Oktober 2014 258
Sulistyaningsih, E., 2007, Polymerase Chain Reaction (PCR): Era Baru Diagnosis
dan Manajemen Penyakit Infeksi, Jember: Laboratorium Fisiologi Fakultas
Kedokteran Universitas Jember
Titrawani. 1996. Biodiversiti Kodok Genus ciples of Protein Structure. New York.
Rana Ditinjau dari Morfologi, Kariotip Springer: 23. dan Pola Protein di Kodya
Sawahlunto. Program Pasca Sarjana. Institute SUZUKI, D.T.J., A.I
GRIFFITHS., J.H. MILLER Pertanian Bogor: 76 hal.

21