LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

ISOLASI DNA TUMBUHAN

Oleh:

Dosen Pengampu:

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI

FAKULTAS ILMU TARBIYAH DAN KEGURUAN
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI (UIN) RADEN FATAH
PALEMBANG
2020
 BAB I
PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Ekstraksi atau isolasi asam nukleat adalah salah satu teknik dasar yang
harus dikuasai dalam mempelajari teknik biologi molekular. Tujuan dari
ekstraksi atau isolasi asam nukleat adalah membuang dan memisahkan asam
nukleat dari komponen sel lainnya (protein, karbohidrat dan lemak).
Pemisahan tersebut dilakukan sehingga asam nukleat yang diperoleh dapat
dianalisis dan atau dimodifikasi lebih lanjut dengan teknik biologi molekular
lainnya (Corkill dan Rapey 2008).
Pada prinsipnya isolasi DNA sel harus dipecah terlebih dahulu dengan
beberapa agensia, baik secara fisik kimia atau dengan mempergunakan enzim
tertentu. Pemecahan dengan cara fisik misalnya dengan menggunakan alat
sonikator, yaitu merupakan alat yang menghasilkan suara ultra tinggi.
Pemecahan dengan alat ini biasanya cukup fektif untuk memecah sel bacteri,
tetapi kurang efektif untuk memecah sek eukaryote. Pemecahan sel juga dapat
dilakukan dengan menggunakan enzim lisozim yang dapat memecah dinding
sel. Seringkali penggunaan enzim ini dikombinasikan dengan perlakuan fisik,
misalnya dengan pemansan sehingga sel lebih mudah pecah. Senyawa lain
yang sering digunakan untuk memecah sel untuk isolasi DNA adalah CTAB
(Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide)( Yuwono 2006).
DNA umumnya terletak di dalam inti sel, DNA merupakan
makromolekul yang memiliki peran penting dalam penyimpanan informasi
genetik di dalam setiap sel organisme. Jadi, makromolekul ini merupakan
polimerisasi dari nukleotida, yang tersusun atas tiga molekul yaitu gula
deoksiribosa, basa nitrogen, dan gugus fosfat. Pada sel prokariot, DNA
terdapat pada sitoplasma, tidak dikelilingi oleh membran sel dan
terkonsentrasi pada daerah nukleoid, sementara pada sel eukariot sebagian
besar DNA terdapat pada inti sel yang berada dalam membran inti, berbentuk
linier dan dikemas bersama protein histon membentuk struktur kromatin dan
kromosom. Selain di dalam inti sel, eukariot juga menyimpan DNA di dalam
mitokondria dan kloroplas. Ukuran genom inti umumnya meningkat seiring
kompleksitas suatu organisme, sementara genom mitokondria dan kloroplas
umumnya berukuran kecil, tanpa protein histon, dan berbentuk sirkular.
Ekstraksi DNA total mitokondria dapat dilakukan dari berbagai sumber
jaringan. Ekstraksi DNA merupakan langkah utama untuk memperoleh DNA
yang diperlukan dalam teknik molekuler lainnya (Tamam, 2012).
Ekstraksi DNA sering dikenal juga dengan proses pemisahan DNA dari
bagian-bagian sel lainnya yaitu berupa protein, karbohidrat, dan lemak. Untuk
menentukan teknik molekuler selanjutnya kualitas DNA yang dihasilkan
merupakan pertimbangan yang sangat penting, sehingga diperlukan metode
ekstraksi untuk memperoleh DNA dari berbagai sumber jaringan organisme.
Kuantifikasi DNA dari hasil ekstraksi dapat dilakukan dengan mengukur
rasio, konsentrasi DNA (μg/ml) dan protein (mg/ml) dari setiap sampel
dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 dan 280
nm (Glasel 1994). Molekul DNA dalam suatu sel dapat diekstraksi atau
diisolasi untuk berbagai macam keperluan seperti amplifikasi dan analisis
DNA melalui elektroforesis. Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk
memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat.
Prisnsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis),
ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein,
serta pemurnian DNA. Ada beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam
proses isolasi DNA antara lain harus menghasilkan DNA tanpa adanya
kontaminan seperti protein dan RNA; metodenya harus efektif dan bisa
dilakukan untuk semua spesies metode yang dilakukan tidak boleh mengubah
struktur dan fungsi molekul DNA; dan metodenya harus sederhana dan cepat
(Tamam, 2012).
Isolasi DNA dapat dilakukan dari berbagai sumber, antara lain organ
maunusia, darah, daun, daging buah, akar, batang, daging dan sisik ikan. Pada
individu yang sama DNA yang diperoleh dari berbagai sumber akan memiliki
jenis jumlah dan ukuran yang sama (Koesmadji dkk, 2017).
DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali terkontaminasi oleh
polisakarida dan metabolit sekunder seperti tanin, pigmen, alkaloid, dan
 flavonoid. Salah satu kesulitan isolasi DNA dari tanaman tinggi adalah proses
destruksi dinding sel untuk melepaskan isi sel. Hal ini disebabkan karena
tanaman memiliki dinding sel yang kuat dan seringkali pada beberapa jenis
tanaman, kontaminasi tersebut sulit dipisahkan dari ekstrak asam nukleat.
Kontaminasi tersebut dapat menghambat aktivitas enzim, misalnya DNA
tidak sensitif oleh enzim restriksi dan mengganggu proses amplifikasi DNA
dengan PCR (Koesmadji dkk, 2017).
Jaringan tanaman yang mengandung sedikit kontaminan dapat dijadikan
bahan untuk praktikum isolasi DNA, diantaranya daging buah atau tanaman
jenis sayuran. Berdasarkan hal tersebut, kami melakukan praktikum isolasi
DNA tanaman yang masih muda.

A. Tujuan Praktikum
Adapun tujuan praktikum yaitu:
1. Dapat melakukan isolasi DNA dari berbagai jenis tanaman
2. Dapat memahami cara kerja senyawa yang digunakan untuk mengisolasi
DNA dan elektroforesis DNA
3. Mengetahui proses elektroforesis DNA.
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

A. Definisi DNA
Isolasi DNA adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari
komponen-komponen sel lain. Sumber DNA bisa dari tanaman, kultur
mikroorganise, atau sel manusia. Membran sel dilisis dengan menambahkan
detergen untuk membebaskan isinya, kemudian pada ekstrak sel tersebut
ditambahkan protease (yang berfungsi mendegradasi protein) dan RNase (yang
berfungsi untuk mendegradasi RNA), sehingga yang tinggal adalah DNA.
Selanjutnya ekstrak tersebut dipanaskan sampai suhu 90oC untuk
menginaktifasi enzim yang mendegradasi DNA (DNase). Larutan DNA
kemudian di presipitasi dengan etanol dan bisa dilarutkan lagi dengan air
(Susanto 2012).
Preparasi DNA yang panjang dan murni merupakan sesuatu yang sangat
diharapkan. Tekanan yang dibutuhkan untuk membuka dinding sel juga dapat
memotong DNA, sehingga diperlukan tindakan yang harus sungguh-sungguh
menjaga DNA yang dihasilkan dan panjangnya. Nukleus yang utuh merupakan
sumber yang baik untuk DNA tumbuhan yang panjang, nucleus tersebut bisa
sulit untuk diisolasi dalam jumlah yang banyak, dan teknik yang dibutuhkan
sangat sulit. Polisakarida dan tannin merupakan masalah utama dalam
tumbuhan karena mereka sulit dipisahkan dari DNA (Murray and Thompson,
1980).
Deoxyribo Nucleic Acid (DNA) merupakan senyawa kimia yang paling
penting dalam makhluk hidup. DNA merupakan senyawa yang mengandung
informasi genetic makhluk hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya.
DNA eukariot tidak hanya dijumpai pada nucleus, tetapi dapat ditemukan pada
mitokondria dan kloroplas. DNA yang diisolasi dari kloroplas menunjukkan
sifat berbentuk sirkular dan terdiri dari untai ganda, replikasi semikonservatif
dan bebas dari protein histon. DNA kloroplas penting dalam proses
fotosintesis. DNA pada sel tanaman dibagi menjadi dua, yaitu DNA
intrakromosomal dan DNA ekstrakromosomal (Donata, 2007).
 DNA intrakromosomal merupakan DNA yang ditemukan di bagian inti
sel, sedangkan DNA ekstrakromosomal merupakan DNA yang ditemukan di
sitoplasma sel. Pada sel-sel tanaman DNA ekstrakromosomal ini dapat
ditemukan di mitokondria dan kloroplas (Farrel, 2004).
Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA, salah satu prinsip
isolasi DNA ialah dengan sentrifugasi . sentrifugasi merupakan teknik untuk
memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul
yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan
molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung (Farrel, 2004).
Pada prokariota, sebagian besar DNA dalam suatu genom akan
mengkode protein atau t-RNA dan r-RNA dimana sebagian kecil DNA bukan
pengkode tersebut kebanyakan terisi oleh urutan-urutan pengatur, seperti
misalnya promoter. Urutan pengkodean nukleotida di sepanjang gen
prokariotik berlangsung dari awal sampai akhir tanpa interupsi (Campbell,
2002).
Ada beberapa pengecualian yang penting dimana DNA dari suatu sel
somatik berubah secara sistematik. Karena ini tidak mempengaruhi gamet,
perubahan-perubahan ini tidak akan diteruskan pada keterunuannya, tetapi
perubahan-perubahan ini dapat, serta memang memiliki pengaruh besar pada
ekspresi gen di dalam sel dan jaringan genom. Jumlah salinan suatu gen atau
famili gen meningkat untuk sementara waktu di dalam sel beberapa jaringan
selama satu tahapan perkembangan tertentu (Campbell, 2002).

B. Isolasi DNA
DNA pada organisme tingkat tinggi seperti manusia, hewan dan
tumbuhan terdapat di dalam inti sel, dan beberapa organ lain di dalam sel
seperti mitokondria dan kloroplast. Penyebutan nama DNA juga didasarkan
pada lokasi asalnya. DNA genome inti (nuclear DNA genome) berasal dari
inti sel, DNA genom mitokondria (mitochondrial DNA genome) berasal dari
mitokondria, DNA genom kloroplast berasal dari kloroplast. Pada organisme
tingkat rendah, DNA penyusun kromosom dan plasmid dibungkus oleh
dinding sel (pada bakteri) atau dibungkus oleh protein tertentu (pada virus).
Kromosom eukariot berbentuk linear sedangkan kromosom prokariot
berbentuk sirkular. Selain itu prokariot juga mengandung satu atau lebih
plasmid. Plasmid merupakan mulekul DNA sirkular dengan ukuran yang jauh
lebih kecil dibanding kromosom (Tamam, 2012).
a. Isolasi DNA kromosom.
Prinsipnya adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom
dari komponen-komponen sel lain. Sumber DNA bisa dari tanaman,
kultur mikroorganise, atau sel manusia. Membran sel dilisis dengan
menambahkan detergen untuk membebaskan isinya, kemudian pada
ekstrak sel tersebut ditambahkan protease (yang berfungsi mendegradasi
protein) dan RNase (yang berfungsi untuk mendegradasi RNA), sehingga
yang tinggal adalah DNA. Selanjutnya ekstrak tersebut dipanaskan
sampai suhu 90oC untuk menginaktifasi enzim yang mendegradasi DNA
(DNase). Larutan DNA kemudian di presipitasi dengan etanol dan bisa
dilarutkan lagi dengan air (Tamam, 2012).
b. Isolasi DNA plasmid
DNA plasmid merupakan wadah yang digunakan untuk kloning
gen, sehingga DNA plasmid harus di pisahkan dari DNA kromosom.
DNA plasmid mempunyai ukuran yang jauh lebih kecil daripada DNA
kromosom. Untuk memisahkan DNA plasmid, maka memerlukan
perlakuan yang sedikit berbeda dengan prosedur di atas. Pertama,
membran sel dilisis dengan penambahan detergen. Proses ini
membebaskan DNA kromosom, DNA plasmid, RNA, protein dan
komponen lain. DNA kromosom dan protein diendapkan dengan
penambahan potasium. DNA + protein + potasium yang mengendap
dipisahkan dengan cara sentrifugasi. Supernatan yang mengandung DNA
plasmid, RNA dan protein yang tersisa dipisahkan. Kemudian
ditambahkan RNase dan protese untuk mendegradasi RNA dan protein.
Akhirnya DNA plasmid dapat dipresipitasi menggunakan etanol
(Tamam, 2012).
C. Metode Isolasi DNA
CTAB merupakan sejenis deterjen yang dapat mendegradasi dinding sel,
denaturasi protein, memisahkan karbohidrat, merusak membran sel dan
melarutkan DNA. Apabila dinding sel terdegradasi maka semua isi sel dapat
keluar termasuk DNA dan dilepaskan ke dalam buffer ekstraksi (Purwantara,
2001).
Dalam proses isolasi DNA tanaman, penambahan senyawa pereduksi
seperti merchaptoetanol dapat mencegah proses oksidasi senyawa fenolik
sehingga menghambat aktivitas radikal bebas yang dihasilkan oleh oksidasi
fenol terhadap asam nukleat. Merchaptoetanol juga berfungsi untuk
melindungi RNA dari senyawa quinon, disulphide, peroksida,
poliphenoksidase, dan protein. Proses pemansan pertama bertujuan untuk
melarutkan CTAB dan mercaptoetanol. Sedangkan pemanasan yang kedua
bertujuan untuk memdegradasi protein dan dinding sel (Milligan, 1992).
Klorofrom dan isoamilalkohol (CIAA) berfungsi untuk mengekstrak dan
dan mengendapkan komponen polisakarida di dalam buffer ektraksi yang
mengkontaminasi larutan DNA. Pemberian isopropanol dan etanol dilakukan
agar terjadi dehidrasi DNA sehingga terjadi presipitasi. Setelah pemberian
etanol, pellet yang dipeoleh dikeringanginkan. Hal ini bertujuan untuk
mengeringkan pellet dari sisa-sisa buffer maupun etanol (Ningrum, 2008).
Tahapan terakhir dari ektraksi ini adalah penambahan buffer TE. Buffer
TE berfungsi untuk melarutkan DNA yang dihasilkan dan menjaga DNA agar
tidak mudah rusak. Dalam buffer TE mengandung EDTA yang berfungsi
sebagai senyawa pengkelat yang mengikat ion Magnesium, yaitu kofaktor yang
diperlukan untuk altivtas berbagai enzim nuclease (Sudarsono, 1996).
Metode ekstraksi DNA dengan CTAB akan menghasilkan pita DNA
yang berukuran tebal dan dapat memisahkan DNA dari polisakarida karena
adanya perbedaan karakteristik kelarutan (differensial of solubility). Disamping
deperoleh fragmen DNA, dengan metode CTAB juga akan diperoleh RNA
dengan pita tipis yang terletak jauh berada di bawah pita DNA. Keberadaan
pita RNA tergantung bahan yang diekstraksi (Prasetyo, 2008).
 Metode ini tidak membutuhkan biaya yang lebih mahal dibandingkan
dengan menggunakan kit. Selain itu, kelebihan dari ektraksi ini adalah pita
DNA yang diperoleh lebih tebal bila dibandinglan dengan ektraksi metode
fenol dan tanpa fenol. Akan tetapi, dari hasil dengan metode ini masih terdapat
pita smear dan DNA yang dihasilkan lebih sedikit daripada ektraksi dengan
menggunakan kit. Kendala yang umum terjadi dalam ekstraksi CTAB adalah
adanya inhibitor pada inang, rendahnya konsentrasi vius dan pengaruh cara
maupun lama waktu penyimpanan (Ningrum, 2008).
Deoxyribo Nucleic acid (DNA) merupakan senyawa kimia yang paling
penting dalam makhluk hidup. DNA merupakan senyawa yang mengandung
informasi genetik makhluk hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya.
DNA eukariot tidak hanya dijumpai pada nukleus, tetapi dapat ditemukan
pada mitokondria dan kloroplas. DNA yang diisolasi dari kloroplas
menunjukkan sifat berbentuk sirkular, terdiri dari untai ganda, replikasi
semikonservatif, dan bebas dari protein histon. DNA kloroplas penting dalam
proses fotosintesis. DNA pada sel tanaman dibagi menjadi dua yaitu DNA
intrakromosomal dan DNA ekstrakromosomal (Donata, 2007).
DNA intrkromosomal merupakan DNA yang ditemukan di inti sel.
Sedangkan DNA ekstrakromosomal merupakan DNA yang ditemukan di
sitoplasma sel. Pada sel-sel tanaman DNA ekstrakromosal ini dapat
ditemukan di mitokondria dan kloroplas. Isolasi DNA merupakan langkah
mempelajari DNA, salah satu prinsip isolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi.
Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan
berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar
akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada
bagian atas tabung (Muladno, 2002).
Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari
bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Prinsip utama dalam
isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan
DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA.
Terdapat berbagai macam metode isolasi DNA tanaman. Metode-metode
tersebut menggunakan CTAB dan SDS dalam ekstraksi DNA. Beberapa
metode isolasi DNA juga menggunakan nitrogen cair pada tahap awal
ekstraksi untuk menghasilkan kualitas DNA terbaik. Sering digunakan untuk
ekstraksi DNA tanaman (Yuwono, 2008).
Metode tersebut pada dasarnya memiliki prinsip yang sama, namun ada
beberapa hal tertentu yang biasanya digunakan modifikasi untuk dapat
menghancurkan inhibitor yang ada di dalam masing-masing sumber
spesimen. Komponen nukleotida DNA adalah gula, fosfat, dan basa nitrogen.
Komponen gula pada DNA adalah gula deoksiribosa, yaitu gula ribose yang
kehilangan satu atom oksigen. Basa yang ada pada DNA ada dua macam,
yaitu purin dan pirimidin. Purin terbagi lagi menjadi dua macam, yaitu adenin
dan guanin. Pirimidin terdiri dari dua jenis, yaitu timin dan sitosin. Nukleus
terdiri dari 90% keseluruhan DNA seluler. Sisa DNA adalah organel lain
seperti mitokondria dan kloroplas (Yuwono, 2008).
Elektroforesis adalah teknik yang digunakan untuk memisahkan dan
memurnikan suatu makromolekul khususnya protein dan asam nukleat
berdasarkan perbedaan ukuran. Elektroforesis merupakan metode yang
paling banyak dipakai saat ini dalam percobaan biokimia dan biologi
molekuler (Tamam, 2012).
Elektroforesis gel agarosa adalah teknik paling baik yang pernah dibuat
dan secara rutin digunakan di laboratorium klinis untuk analisis protein dan
DNA pada berbagai cairan biologis (serum, urin, CSF). Teknik ini merupakan
teknik yang menggunakan prinsip elektroforesis zona. Seperti yang diketahui,
molekul protein bermigrasi pada medium padat/gel yang direndam dengan
suatu larutan penyangga di bawah pengaruh medan listrik. Migrasi ini
tergantung pada muatan listrik, titik isoelektrik bersih dan massa molekul
protein (Tamam, 2012)
Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat makromolekul yang
bermuatan listrik ditempatkan pada medium berisi tenaga listrik. Molekul-
molekul tersebut akan bermigrasi menuju kutub positif atau kutub negatif
berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya. Molekul-molekul yang
bermuatan negatif (anion) akan bergerak menuju kutub positif (anoda),
sedangkan molekul-molekul yang bermuatan positif (kation) akan bergerak
menuju kutub negatif (katoda) (Tamam, 2012).
Elektroforesis digunakan untuk menyediakan informasi mengenai
ukuran, konfirmasi dan muatan dari protein dan asam nukleat. Elektroforesis
dalam skala besar memungkinkan untuk digunakan sebagai metode
pemisahan yang dapat digunakan untuk menentukan komponen dari protein
atau asam nukleat setiap individu (Tamam, 2012).
Elektroforesis gel memisahkan makromolekul berdasaran laju
perpindahannya melewati suatu gel di bawah pengaruh medan listrik.
Elektroforesis gel memisahkan suatu campuran molekul DNA menjadi pita-
pita yang masing-masing terdiri atas molekul DNA dengan panjang yang
sama (Campbell, 2002).
Ada tiga jenis gel yang dapat digunakan dalam elektroforesis DNA,
yaitu:
1. Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi untuk memurnikan penanda
oligonukleotida dan menganalisis hasil ekstensi primer.
2. Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang
berukuran besar.
3. Gel agarose formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem
elektroforesis yang digunakan untuk fraksi RNA pada ukuran standar
(Tamam, 2012).
Biasanya gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang
lebih besar (lebih dari 200 bp) dan gel poliakrilamida digunakan untuk
fragmen kecil (kurang dari 200 bp). Jarak antara dua fragmen DNA yang
berbeda ukuran dapat ditentukan berdasarkan konsentrasi matriks agarose.
Mobilitas/pergerakan DNA relatif tergantung pada faktor-faktor tertentu,
terutama pada konsentrasi agarosa dalam gel, kekuatan arus yang digunakan,
kekuatan ionik dari larutan buffer, dan konformasi fragmen DNA itu sendiri.
Molekul DNA bermigrasi melalui pori-pori kecil yang terbentuk dalam
padatan gel agarosa. Secara umum, molekul yang lebih kecil bergerak lebih
cepat dan bermigrasi lebih jauh dari molekul kecil karena memiliki gesekan
yang lebih rendah saat bergerak menuju elektroda positif. Konsentrasi yang
rendah pada gel agarosa memberikan resolusi yang lebih baik untuk fragmen
besar, dengan memberikan pemisahan yang lebih besar antara band yang
secara ukuran tidak terlalu jauh berbeda. Konsentrasi gel yang lebih tinggi, di
sisi lain, dapat mengurangi kecepatan migrasi fragmen panjang yang
sementara itu dapat memfasilitasi pemisahan yang lebih baik pada fragmen
DNA kecil (Tamam, 2012).
Namun, fragmen yang lebih besar dapat bermigrasi secara lebih cepat
daripada fragmen yang lebih kecil, karena tegangan pada gel yang
ditingkatkan. Selain itu, DNA memiliki muatan yang konsisten untuk rasio
massa, sehingga ukuran molekul DNA merupakan faktor utama yang
mempengaruhi migrasi melalui matriks gel. Terlepas dari kenyataan bahwa
penerapan tegangan tinggi dapat meningkatkan kecepatan migrasi fragmen
DNA, tetapi juga dapat menurunkan resolusi pemisahan (di atas sekitar 5
sampai 8 V/cm). Untuk alasan itu, resolusi terbaik dari fragmen yang lebih
besar dari 2 kb dicapai dengan menerapkan tidak lebih dari 5 V/cm pada gel
(Tamam, 2012).
Elektroforesis gel memiliki beberapa komponen yang terdiri dari:
1. Comb: digunakan untuk membentuk well pada gel agarose.
2. Tray: digunakan untuk sebagai cetakan gel agarose.
3. Chamber: digunakan sebagai wadah gel agarose.
4. Sumber listrik: digunakan untuk memberi arus saat proses elektroforesis
Dalam elektroforesis juga digunakan bahan-bahan sepert Etidium
Bromida yang bersifat karsinogenik dan Brom Fenol Blue. Hal tersebut
karena Etidium Bromida dapat meningkatkan daya fluoresensi dari DNA
sehingga dapat terlihat jelas, sedangkan Brom Fenol Blue berfungsi sebagai
pewarna untuk memantau kecepatan molekul DNA pada gel (Tamam, 2012).
Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran
fragmen DNA dari produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti
yang berbeda ukuran, lalu dapat disequencing, dan juga untuk pemurnian atau
purifikasi DNA. Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai macam
kegiatan, antara lain membandingkan gen homolog dari spesies yang berbeda,
mengetahui susunan sekuens berbagai genom, DNA finger printing,
 mengetahui ada atau tidaknya gen-gen penyebab kelainan genetik atau
penyakit tertentu, mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau
jaringan tertentu, mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai
tipe sel organisme atau aktivitas gen sebelum dan sesudah diberi perlakuan
tertentu, mempelajari evolusi di tingkat molekular, mengetahui variasi
genetik dalam populasi natural di alam, menentukan atau mengidentifikasi
berat molekul fragmen DNA, RNA, protein dan aktivitas enzimatik,
menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi melalui PCR,
mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu, dan
menentukan jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan plasmid
DNA (Tamam, 2012).
Namun disamping itu, elektroforesis gel juga memiliki kekurangan
yaitu pada deteksi atau identifikasi amplikon. Penggunaan elektroforesis gel
ini dirasakan kurang efisien karena lama pengerjaannya dan terbatasnya
jumlah sampel yang dapat diperiksa. Disamping itu, kadang kadang hasil
PCR dalam gel muncul pita yang tidak berbentuk (ghost atau smeary bands)
atau pita yang terlampau banyak sehingga hasilnya sulit diinterpretasikan
(Tamam, 2012).

D. Reaksi Berantai Polimerase PCR

Reaksi berantai polimerase (PCR) adalah teknik in vitro yang dapat
mengamplifikasi bagian DNA spesifik yang terletak di antara dua bagian DNA
yang telah diketahui. PCR merupakan teknik biokimia dan biologi molekuler
untuk isolasi dan amplifikasi secara eksponensial fragmen atau urutan sasaran
DNA melalui replikasi enzimatik, atau tanpa menggunakan mahluk hidup
(seperti E.coliatauragi). Karena PCR merupakan teknik in vitro, teknik ini
dapat digunakan tanpa memotong DNA dan dapat dimodifikasi secara
ekstensif untuk mengikuti aturan luas manipulasi genetik.
PCR ditemukan oleh Kary Muilis tahun 1983. PCR menjadi teknik
umum yang digunakan dalam laboratorium penelitian medis dan biologi untuk
berbagai keperluan, seperti pengurutan gen-gen dan diagnosis penyakit
turunan, identifikasi sidik jari genetik (digunakan dalam pengujian forensic dan
paternitas), deteksi dan diagnosis penyakit infeksi dan pembentukan organism
transgenik. PCR juga digunakan dalam biosistematika, biologi populasi,
biologi konservasi, ekologi, biologi perkembangan, dan genetika.
Keuntungan menggunakan PCR adalah
1. Deteksi dan identifikasi mikroorganisme secara cepat pada frekuensi
yang sangat rendah, mikroorganisme simbiotik, dan individu ikan dan
larva avertebrata;
2. Analisis cepat genom individu untuk mempelajari populasi;
3. Deteksi dan analisis "kejadian langka" yang terjadi pada fraksi sel kecil
dalam sampel jaringan atau koleksi lapangan; dan
4. Menduga kualitas air melalui deteksi virus, bakteri, dan/atau parasit
pathogen. Keuntungan lain PCR adalah mengurangi keperluan kultur
yang sering ditemukan untuk spesies atau jenis mikroba yang tidak
dapat dikultur untuk kepentingan ekologi atau biogeokimia
PCR digunakan untuk mengamplifikasi gen tunggal, bagian gen,
atau urutan non-kode DNA. PCR akan membuat sekitar 40 milyar salinan
dan DNA cetakan. Kebanyakan metode PCR dapat mengamplifikasi
fragmen DNA sampai 10 kilo pasang basa (kb), meskipun beberapa teknik
dapat mengamplifikasi fragmen berukuran sampai 40 kb. PCR biasanya
terdiri atas 20 sampai 35 siklus. Kebanyakan PCR dilakukan dalam tiga
tahap, yang didahului satu suhu tetap untuk awal dan diikuti satu suhu lagi
untuk akhir. Tahap-tahap tersebut yaitu:
1. Tahap Inisiasi. Sebelum tahap inisiasi reaksi PCR sering dipanaskan
pada suhu 94-96°C (atau 98°C jika menggunakan polimerase
termostabil), selama 1-9 menit. Ini berguna untuk menjamin banyak
cetakan DNA dan primer terdenaturasi yaitu putusnya ikatan
hidrogen basa-basa komplemen rantai DNA untuk menghasilkan
rantai tunggal DNA. Beberapa polimerase PCR juga membutukan
kondisi tahap ini untuk aktivasi (PCR awal-panas). Setelah itu, mulai
siklus dengan tahap satu pada 94-98°C selama 20-30 detik (tahap
denaturasi).
2. Tahap annealing. Dalam tahap ini suhu diturunkan sehingga primer
dapat menempel pada cetakan DNA rantai tunggal. Gerakan Brownian
menyebabkan primer bergerak di ikatan hidrogen DNA - DNA yang
secara konstan dibentuk dan diputuskan antara dan cetakan. Ikatan
stabil hanya terbentuk bila urutan primer sangat dengan urutan
cetakan. Bagian pendek rantai ganda ini dikatalisis oleh polimerase
untuk memulai sintesis DNA. pada tahap ini bergantung pada suhu
primer dan biasanya antara 50-64 °C selama 20-40 detik.
3. Tahap ekstensi atau pemanjangan yaitu polymerase memperpanjang
rantai DNA yang komplemen dengan rantai cetakan. Suhu pada tahap
ini bergantung pada DNA polimerase yang digunakan. Polimerase
Taq mempunyai suhu optimum 70-74°C. Umumnya reaksi ini
menggunakan suhu 72°C. DNA polimerase melakukan kondensasi 5'-
fosfat dNTP dengan gugus 5'- hidroksil ujung awal rantai DNA yang
komplemen dengan cetakan dalam arah 5' ke 3'. Pemanjangan
bergantung pada DNA polimerase dan panjang bagian DNA akan
diamplifikasi. Tahap elongasi akhir selama 5-15 menit (tergantung
panjang cetakan DNA) setelah siklus terakhir digunakan untuk
menjamin DNA rantai tunggal sisa diperpanjang seluruhnya. Akhimya
jaga suhu 4-15°C selama waktu terbatas untuk penyimpanan singkat
seiama reaksi misalnya jika reaksi dikerjakan semalam.
 BAB III
METODOLOGI PRAKTIKUM

A. Waktu dan Tempat

Praktikum tentang Isolasi DNA Tumbuhan dilaksanakan pada hari Selasa
tanggal 07 Januari 2020, pukul12:30–14:30 WIB di Laboratorium Riset
Fakultas MIPA Universitas Negeri Yogyakarta (UNY).

B. Alat dan Bahan

1. Alat
a. Mortal dan alu
b. Mikropipet digital
c. Sarung tangan
d. Pipet tetes
e. Elektroforesis unit
f. Tabung effendrof 0,5 ml,
g. Waterbat
h. Autoclap
i. Penangas air
j. Power supply
k. Microwave
2. Bahan
a. Daun anggrek
b. Air buffer kastilo
c. PVP
d. larutan chloroform sebanyak 12 ml
e. larutan isopropanol
f. Tris-base 27 gram
g. Boric Acid 13,75 gram
h. EDTA 0,5 M pH 8.0 sebanyak 10 ml
i. buffer TBE 5X (500 ml)
j. Akuades.
C. Cara Kerja
1. Isolasi DNA Tumbuhan
Adapun cara pembuatan larutan pereaksi yaitu:
a. Larutan CTAB 10%
Cara pembuatan: 10 gram CTAB + 4,1 gram NaCl dilarutkan dengan
akuades hingga 100 ml.
b. Buffer Tris-HCl 1 M pH 8.0 (MR: 121, 14)
Cara pembuatan: Tris-base 12,11 gram + HCl p.a 4,2 ml+ akuades 80
ml, atur pH larutan hingga 8.0, tepatkan volume hingga 100 ml.
c. Larutan EDTA 0,5 M pH 8.0 (MR: 372,24)
Cara pembuatan: 18,61 gram EDTA dilarutkan dalam 80 ml akuades.
Kocok perlahan di atas magnetik stirer. Atur pH hingga mencapai 8.0
dengan NaOH (2 gran NaOH), tepatkan volume dengan akuades hingga
100 ml.
d. NaCl 5 M (MR: 58,5)
Cara pembuatan: 29,22 gram NaCl dengan akuades hingga 100 ml.
e. Ethanol 70%
f. Isopropanol
g. Chloroform: Isoamilalkohol (24:1)
pH larutan hingga 5.2, tepatkan volume dengan akuades hingga 100 ml.
Adapun cara kerja isolasi DNA tumbuhan yaitu:
a. Daun (sampel) sebanyak 0,2 gram yang sudah dicuci bersih
dimasukkan kedalam mortar.
b. Tambahkan kurang lebih 0,05 gram PVP dan 3 ml (sedikit demi sedikit)
buffer ekstraksi (CTAB) gerus hingga halus.
c. Masukkan 750 µL ke dalam tabung 1,5 ml.
d. Campuran tersebut dikocok bolak-balik, lalu dipanaskan selama 30
menit pada suhu 65oC.
e. Larutan ekstrak buffer dibiarkan dingin pada suhu kamar. Kemudian
tambahkan 750 µL larutan chloroform: Isamilalkohol (Cl), lalu dikocok
bolak-balik.
f. Larutan disentrifus selama 15 menit dengan kecepatan 10.000 rpm.
 g. 600 µL cairan fase atas dipipet ke dalam tabug baru dan diekstrak
kembali dengan 600 µL larutan Cl, selanjutnya disentrifus selama 15
menit dengan kecepatan 10.000 rpm.
h. 500 µL cairan fase atas dipipet ke dalam tabung baru dan ditambahkan
isopropanol dingin sebanyak 1 x volume (500 µL).
i. Kocok perlahan hingga homogen kemudian simpan dalam kulkas (4oC)
30 menit, lalu disentrifus 15 menit 12.000 rpm.
j. Cairan dibuang dan pellet DNA dibilas dengan alkohol 70 %, kemudian
disentrifugasi 2 menit dengan kecepatan 12.000 rpm.
k. Cairan/supernatan dibuang dan DNA dikeringanginkan dengan cara
membalikkan tabung.
l. Pellet DNA dilarutkan dalam 500 µL aquades.
m. Kualitas DNA diuji dengan elektroforesis gel agarosa 1,5 %.
2. Kuantisasi DNA dengan Elektroforesis
Adapun cara pembuatan Gel Agarose 1,2 % yaitu:
a. Timbamg agarose 0,3 gram, masukkan dalam erlenmeyer 100 ml.
b. Tambahkan 25 ml TBE 0,5X, panaskan dalam microwave.
c. Angkat dan biarkan sampai suhu ± 70oC. Siapkan cetakan gel
elektroforesis
d. Tambahkan 5 µl fluorosafe dan dihomogenkan
e. Tuang larutan agarose ke dalam cetakan, tunggu sampai padat ± 30
menit.
Adapun cara Running Gel Elektoforesis yaitu:
a. Siapkan tray/ bak elektroforesis, isi dengan buffer buffer TBE 0,5X 300
ml.
b. Maasukkan cetakan gel yang sudah kering ke dalam tray, pastikan
terendam dalam buffer.
c. Siapkan loading buffer dalam parafilm dan campurkan dalam sampel.
d. Masukkan sampel ke dalam sumur-sumur elektroforesis.
e. Jalankan alat elektroforesis dengan menghubungkannya dengan power
supply.
 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil
1. Isolasi DNA Tumbuhan
Tabel 1.1 HasilIsolasi DNA Daun Jambu Mente (Anacardium
occidentale)
No Gambar Keterangan
1. Ekstrak daun hasil penumbukan yang
ditambahkan buffer ekstraksi dan
divortex.
A Daun + buffer ekstraksi

(Dok. Pribadi, 2020)

2. Terbentuk 2 fase setelah penambahan
kloroform dan isoamil alkohol (24:1) 1x
volum sampel dan disentrifugasi.
a. Fase aqueous (supernatan yang
mengandung DNA)
a. Faseorganik (debris dan protein yang
terdenaturasi)

(Dok. Pribadi, 2020)

3. Supernatan yang telah dipindahkan ke

tabung mikro baru

(Dok. Pribadi, 2020)

 4. Supernatan yang telah ditambahkan
isopropanol dingin 1 x volum sampel
Terlihat benang-benang tipis DNA

(Dok. Pribadi, 2020)

Tabel 1.2 HasilIsolasi DNA Daun Manggis (Garcinia mangostana)

No Gambar Keterangan
1. Ekstrak daun hasil penumbukan yang
ditambahkan buffer ekstraksi dan divortex
a. Daun + buffer ekstraksi

(Dok. Pribadi, 2020)

2. Terbentuk 2 fase setelah penambahan
kloroform dan isoamil alkohol (24:1) 1x
volum sampel dan disentrifugasi.
a. Fase aqueous (supernatan yang
mengandung DNA)
a. Faseorganik (debris dan protein yang
terdenaturasi)
(Dok. Pribadi, 2020)
 3 Supernatan yang telah dipindahkan ke
tabung mikro baru.
a.

(Dok. Pribadi, 2020)

2. Elektroforesis DNA
Tabel 2.1. Hasil dari langkah kegiatan elektroforesis
No Gambar Keterangan
1. Gambar aliran DNA yang tampak setelah
dilakukan elektroforesis.

(Dok. Pribadi, 2020)

B. Pembahasan
Berdasarkan hasil praktikum isolasi DNA tanaman Jambu Mente
(Anacardium occidentale), dan Manggis (Garcinia mangostana) langkah
pertama yang dilakukan adalah penghancuran membran dan dinding sel pada
daun muda yang digunakan. Isolasi DNA tanaman ini digunakan daun yang
masih muda hal ini dikarenakan dipucuk daun dapat menekan senyawa
polifenol dan polisakarida sehingga dapat memperbesar kemungkinan
keberhasilan untuk melakukan isolasi DNA yang kita inginkan.
Hal ini diperkuat dengan pernyataan Tamam (2012), pada bagian tanaman
banyak memiliki senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi
yang dapat menghambat pemurnian DNA, senyawa polifenol dan polisakarida
juga dapat mempengaruhi enzim-enzim seperti polimerase, ligase,
endonuklease restriksi, atau enzim yang mengakibatkan DNA tidak digunakan
dalam praktikum Biologi Molekuler.
Penghancuran bertujuan untuk merusak jaringan yang ada pada sel
sehingga mempermudah bahan-bahan kimia lain yang akan digunakan untuk
masuk ke dalam organel-organel sel, dalam hal untuk mengambil DNA. DNA
yang diisolasi dari tanaman seringkali terkontaminasi oleh polisakarida dan
metabolit sekunder seperti tanin, pigmen, alkaloid dan flavonoid. Sedangkan
DNA dari hewan lebih banyak mengandung protein.
Menurut Donata (2007), salah satu kesulitan isolasi DNA dari tanaman
tinggi adalah proses destruksi dinding sel untuk melepaskan isi sel. Hal ini
disebabkan karena tanaman memiliki dinding sel yang kuat dan seringkali pada
beberapa jenis tanaman, kontaminasi tersebut sulit dipisahkan dari ekstrak
asam nukleat. Pembukaan sel untuk mengeluarkan asam nukleatnya pada
praktikum ini dengan cara mekanik yaitu digerus dengan tip steril pada tabung
mikro atau dapat juga menggunakan bahan kimia yaitu nitrogen cair untuk
mendegradasi dan melarutkan komponen dinding sel.
Sampel disentrifugasi dengan kecepatan yang tinggi sehingga komponen
yang berukuran lebih besar atau lebih berat akan mengendap membentuk
sedimen pada bagian bawah tabung. SDS berfungsi untuk melisis dinding sel
tumbuhan yang terdapat dalam larutan sampel. Ini disebabkan karena sifat dari
SDS sama dengan sifat dinding sel yang hidrofobik, sehingga terjadi ikatan
diantara keduanya dan menyebabkan dinding sel rusak.
Setelah ditunggu beberapa menit, sampel selanjutnya diinkubasi. Menurut
Muladno (2002), buffer lisis mengandung EDTA yang berfungsi merusak
dinding sel secara kimiawi dengan cara mengikat ion magnesium berfungsi
mempertahankan integritas sel maupun aktifitas enzim nuclease yang merusak
asam nukleat. Kotoran (debris) yang dihasilkan dari aktivitas lisis ini
dibersihkan dengan cara sentrifugasi agar kotoran mengumpul didasar tabung
mikro.
Untuk membersihkan protein dan polisakarida dari larutan digunakan
kloroform sedangkan kondisi yang lebih ekstrem, dapat digunakan proteinase.
DNA yang telah diekstraksi dari dalam sel selanjutnya perlu dipisahkan dari
kontaminan komponen penyusun sel lainnya seperti polisakarida dan protein
agar DNA yang didapatkan memiliki kemurnian yang tinggi.
Menurut Ningrum (2008), asam nukleat adalah molekul hidrofilik dan
bersifat larut dalam air. Disamping itu, protein juga mengandung residu
hidrofobik yang mengakibatkan protein larut dalam pelarut organik.
Berdasarkan sifat ini, terdapat beberapa metode deproteinisasi berdasarkan
pemilihan pelarut organik. Biasanya pelarut organik yang digunakan adalah
fenol atau kloroform yang mengandung 4% isoamil alkohol. Penggunaan
kloroform isoamil alkohol (CIA) berdasarkan perbedaan sifat pelarut organik.
Kloroform tidak dapat bercampur dengan air dan kemampuannya untuk
mendeproteinisasi berdasarkan kemampuan rantai polipeptida yang
terdenaturasi untuk masuk atau termobilisasi ke dalam fase antara kloroform –
air. Konsentrasi protein yang tinggi pada fase antara tersebut dapat
menyebabkan protein mengalami presipitasi. Sedangkan lipid dan senyawa
organik lain akan terpisah pada lapisan.
Menurut Sudarsono (1996), proses deproteinisasi yang efektif bergantung
pada besarnya fase antara kloroform-air. Proses ini dapat dilakukan dengan
membentuk emulsi dari air dan kloroform. Hal ini hanya dapat dilakukan
dengan penggojogan atau sentrifugasi yang kuat karena kloroform tidak dapat
bercampur dengan air. Isoamil alkohol berfungsi sebagai emulsifier dapat
ditambahkan ke kloroform untuk membantu pembentukan emulsi dan
meningkatkan luas permukaan kloroform-air yang mana protein akan
mengalami presipitasi.
Penggunaan kloroform isoamil alkohol ini memungkinkan untuk
didapatkan DNA yang sangat murni, namun dengan ukuran yang terbatas
(20.000–50.000 bp). DNA kemudian diikat dari fase aquoeus dengan
presipitasi isopropanol (Muladno, 2002). Setelah proses ekstraksi, DNA yang
didapat dapat dipekatkan melalui presipitasi. Pada umumnya digunakan
isopropanol dingin untuk mengendapkan, melekatkan dan memisahkan DNA
dari larutan.
Pada saat penambahan isopropanol dingin terlihat benang-benang tipis
DNA tanaman berwarna putih yang melayang di larutan tersebut. Kedua
senyawa tersebut akan mempresipitasi DNA pada fase aquoeus sehingga DNA
menggumpal membentuk struktur fiber dan terbentuk pellet setelah dilakukan
sentrifugasi. Menurut Muladno (2002) bahwa presipitasi berfungsi untuk
menghilangkan residu-residu kloroform yang berasal dari tahapan ekstraksi.
Menurut Yuwono (2008), prinsip-prinsip presipitasi antara lain pertama,
menurunkan kelarutan asam nukleat dalam air. Hal ini dikarenakan molekul air
yang polar mengelilingi molekul DNA di larutan aquoeus. Muatan dipole
positif dari air berinteraksi dengan muatan negatif pada gugus fosfodiester
DNA. Interaksi ini meningkatkan kelarutan DNA dalam air. Isopropanol dapat
bercampur dengan air, namun kurang polar dibandingkan air.
Molekul isopropanol tidak dapat berinteraksi dengan gugus polar dari
asam nukleat sehingga isopropanol adalah pelarut yang lemah bagi asam
nukleat; kedua, penambahan isopropanol akan menghilangkan molekul air
dalam larutan DNA sehingga DNA akan terpresipitasi; ketiga, penggunaan
isopropanol dingin akan menurunkan aktivitas molekul air sehingga
memudahkan presipitasi DNA. Pada tahapan presipitasi ini, DNA yang
terpresipitasi akan terpisah dari residu-residu RNA dan protein yang masih
tersisa.
Residu tersebut juga mengalami koagulasinamun tidak membentuk
struktur fiber dan berada dalam bentuk presipitat granular.Pada saat etanol atau
isopropanol dibuang dan pellet dikeringanginkan dalam tabung, maka pellet
yang tersisa dalam tabung adalah DNA pekat. Proses presipitasi kembali
dengan isopropanol sebelum pellet dikeringanginkan dapat meningkatkan
derajat kemurnian DNA yang diisolasi.
Tahap selanjutnya yaitu tabung dikocok dan diinkubasi pada suhu -200C
selama 15 menit. Hal ini dilakukan untuk optimalisasi kerja isopropanol.
Kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 6.000 rpm x g selama 15 menit.
Proses sentrifugasi ulangan dilakukan untuk mendapatkan pellet DNA. Tahap
selanjutnya yaitu tabung di sentrifugasi kembali pada kecepatan 6.000 rpm
selama 15 menit. Hasil yang didapat yaitu berupa supernatan yang bening dan
pelet (endapan DNA murni) yang berwarna putih terdapat pada dasar tabung.
 Kemudian supernatan tersebut dibuang karena DNA berada pada bagian
natan. Menurut Donata (2007) DNA murni yang dihasilkan adalah DNA yang
terbebas dari campuran material dan komponen intraceluler yang mengandung
larutan kompleks berupa RNA, protein, lemak dan karbohidrat. Setelah
ituditambahkan 100 μL buffer TE ke dalam tabung yang berisi pelet dan
kemudian disimpan di dalam freezer dengan suhu sekitar -20ºC.
Menutrut Farrel (2004), menyatakan bahwa buffer TE dan penyimpanan
suhu pada -20ºC bertujuan agar sampel DNA yang telah diekstraksi dapat
disimpan hingga waktu berminggu-minggu. Pharmawati (2009), juga
menjelaskan bahwa pelarutan kembali dengan buffer TE juga dapat
memisahkan antara RNA yang mempunyai berat molekul lebih rendah
dibandingkan DNA sehingga DNA yang didapatkan tidak terkontaminasi oleh
RNA dan DNA sangat stabil ketika disimpan dalam keadaan terpresipitasi pada
suhu -20ºC.
Menurut Koesmadji (2017), molekul DNA dalam bentuk linier ataupun
duplekakan bermigrasi sepanjang gel matriks yang proposional dengan log dari
berat molekul. Dengan demikian penggunaan molekul standar dari DNA (yang
sudah diketahui ukurannya) dapat sebagai pembanding dari DNA dalam
penentuan besar molekul.
Menurut Yuwono (2008), pemilihan suhu pada proses PCR sangat
penting karena suhu merupakan salah satu faktor yang menentukan
keberhasilan praktikum PCR. Suhu berkaitan dengan proses denaturasi
DNA templat, annealing, dan ekstensi primer. Suhu denaturasi DNA
templat berkisar antara 93–95 0C, tergantung pada panjang DNA
template yang digunakan dan juga pada panjang fragmen DNA target. Suhu
denaturasi yang terlalu tinggi akan menurunkan aktivitas DNA polimerase
dan merusak DNA template sehingga berdampak pada efisiensi PCR. Suhu
yang terlalu rendah dapat menyebabkan proses denaturasi DNA templat
tidak sempurna. Suhu denaturasi yang digunakan dalam praktikum PCR
yaitu 95 0C.
Pemilihan suhu annealing berkaitan dengan Tm primer yang
digunakan untuk proses PCR. Suhu annealing yang digunakan dapat
dihitung berdasarkan (Tm –5) 0C sampai dengan (Tm +5)0C.
Suhu annealing yang digunakan perlu diperhatikan karena suhu annealing
berkaitan dengan adanya mispriming pada daerah target dan nontarget,
serta keberhasilan praktikum PCR. Proses ekstensi primer praktikum PCR
dilakukan pada suhu 72 0C karena suhu tersebut merupakan suhu optimum
polimerase DNA untuk proses PCR.
Pemilihan waktu yang digunakan berkaitan dengan proses
denaturasi DNA templat,annealing dan ekstensi primer. Untuk denaturasi
DNA template umumnya dilakukan selama 30–90 detik, tergantung pada
DNA template yang digunakan. Waktu denaturasi yang terlalu lama akan
merusak templat DNA dan dapat menurunkan aktivitas polimerase DNA.
Waktu denaturasi yang terlalu pendek akan menyebabkan proses denaturasi
tidak sempurna. Penentuan waktu untuk proses annealing berkaitan dengan
panjang primer. Untuk panjang primer 18–22 basa cukup dengan 30 detik,
sedangkan untuk panjang primer lebih besar dari 22 basa diperlukan waktu
annealing 60 detik. Selain suhu dan waktu, optimasi PCR juga memerlukan
DNA polimerase yang tepat. Enzim DNA polymerase diperlukan untuk
menghubungkan dNTP-dNTP yang terbentuk pada untai DNA
komplementer.
Bahan baku praktikum PCR yaitu reaction mixture. Reaction
mixture dibuat dari campuran destilated water 14,5 μl. PCR Ready mix 21
μl , LCO 1490 1,25 μl, HCO 2198 1,25 μl, dan DNA template 8 μl. Total
volume reaction mixture adalah 50 μl. Kesalahan pada banyaknya suatu
komponen dapat menyebabkan reaksi amplifikasi tidak selesai atau tidak
dapat berlangsung. Jika volume DNA template akan diperbanyak, maka
volume reaction mixture dapat dikurangi sedikit dengan perbandingan
komposisi yang seimbang antar komponen penyusunnya.
Praktikum PCR menggunakan alat yang
bernama Thermal Cycler Perkin Elmer 9600. Alat tersebut akan
mengamplifikasi DNA sesuai dengan program yang dibuat. sebanyak 5
siklus yang dilakukan, diperoleh hasil akhir berupa 32 buah DNA atau 64
untai tunggal DNA. Untai DNA yang semula hanya berjumlah sepasang
kemudian diperbanyak dan terus bertambah dengan kelipatan 2 n setiap
siklusnya, dengan n merupakan nomer siklus (Stansfield 2002: 367). Siklus
pertama menghasilkan 2 untai tunggal DNA baru (2 1), siklus kedua
menghasilkan 4 untai tunggal DNA baru (2 2), siklus ketiga menghasilkan 8
untai tunggal DNA baru (2 3), siklus keempat menghasilkan 16 untai
tunggal DNA baru (2 4), dan siklus kelima menghasilkan 32 untai tunggal
DNA baru (2 5). Jumlah untai tunggal DNA awal (template) dengan hasil
perbanyakan DNA dari tiap siklus adalah sebanyak 64 untai DNA tunggal.
Berdasarkan hasil elektroforesis yang dilakukan dengan bantuan sinar UV
yang dilakukan diruang gelap DNA hasil isolasi dapat terlihat dan dapat
ditemukan. Elektroforesis dengan agarose merupakan metode standar untuk
memisahkan, mengidentifikasi, mengkarakterisasi dan purifikasi dari molekul
DNA/RNA. Cara pemisahan dengan elektroforesis ini merupakan alat
pendukung yang sangat cocok dalam teknologi DNA rekombinan, dengan
aplikasi yang begitu luas baik untuk pemisahan untai tunggal atau untai ganda
molekul DNA. Pada PH mendekatinetral, DNA bermuatan negatif akan
bermigrasi dari Katode ke Anoda, dengan mobilitas yang terutama ditentukan
oleh ukuran serta konformasi potongan atau fragmen DNA/RNA, electron
buffer dan gradien voltage yang diberikan. Gel agarosa mempunyai
kemampuan pemisahan dengan range yang cukupluas yaitu mulai dari 70pb
(pasangan basa) sampai 800.000pb.
Menurut Koesmadji (2017), molekul DNA dalam bentuk linier atau pun
duplekakan bermigrasi sepanjang gel matriks yang proposional dengan log dari
berat molekul. Dengan demikian penggunaan molekul standar dari DNA (yang
sudah diketahui ukurannya) dapat sebagai pembanding dari DNA dalam
penentuan besar molekul. Sebagai DNA standar biasanya digunakan fragmen
hasil pemotongan dari DNA bakteriofag lambda dengan enzim Hindll dan
EcoRV atau pun fragmen-fragmen DNA yang sudah diketahui ukurannya.
Berdasarkan hasil elektroforesis yang dilakukan dengan bantuan sinar
UV yang dilakukan diruang gelap DNA hasil isolasi dapat terlihat dan dapat
ditemukan. Teknik pemisahan senyawa dengan elektroforesis gel agarose
termasuk dalam jenis elektroforesis zona dengan menggunakan teknik
elektroforesis horizontal. Elektroforesis memiliki prinsip kerja bahwa suatu
molekul (DNA) yang bermuatan negatif jika dialiri listrik akan bergerak
menuju kutub positif milik elektroforesis melalui matriks membran gel
agarose. Panjang fragmen DNA dapat terlihat dengan menggunakan gel yang
pada saat didalamnya disinari dengan menggunakan sinar UV, setelah
sebelumnya dilakukan tahap elektroforesis. Setelah itu panjang fragmen DNA
dapat diukur menggunakan kurva regresi linier. Faktor yang mempengaruhi
laju migrasi dari fragmen DNA pada elektroforesis gel adalah ukuran molekul
DNA, konsentrasi, bentuk molekul, densitas muatan, pori-pori gel, voltase, dan
larutan buffer elektroforesis.
 BAB V
PENUTUP

A. Kesimpulan
Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan dapat diambil kesimpulan
bahwa,Bahan-bahan yang digunakan untuk isolasi DNA terdapat dalam buffer
isolasi yang dapat menjaga struktur DNA selama pemecahan sel dan
purifiikasi, memfasilitasi isolasi DNA sehingga mudah untuk menghilangkan
protein dan RNA, menghambat enzim mendegradasi DNA yang ada di dalam
sel dan menjaga perubahan kimiawi molekul DNA oleh komponen-komponen
cair dalam sel yang dilepaskan pada saat sel dipecah.Pada isolasi DNA ini
digunakan daun muda atau pucuk, hal ini dikarenakan dipucuk daun dapat
menekan senyawa polifenol dan polisakarida sehingga dapat memperbesar
kemungkinan keberhasilan untuk melakukan isolasi DNA yang diinginkan.
Elektroforesis memiliki prinsip kerja bahwa suatu molekul (DNA) yang
bermuatan negatif jika dialiri listrik akan bergerak menuju kutub positif milik
elektroforesis melalui matriks membran gel agarosa.

B. Saran
Pada saat melakukan praktikum sebaiknya praktikan lebih
memperhatikan dan mempelajari dengan serius penjelasan mengenai cara kerja
praktikum, agar praktikum berjalan dengan baik.
 DAFTAR PUSTAKA

Campbell, Neil A, J.B. Reece dan L.G. Mitchell. (2002). Biologi. Jakarta: Erlangga

Corkill, G., Rapley, R. 2008. The Manipulation of Nucleic Acids: Basic Tools and
Techniques. In: Molecular Biomethods Handbook Second Edition. Ed: Walker,
J.M., Rapley, R. Humana Press, NJ, USA.

Donata. (2007). Membuat Reagen Kimia. Jakarta: PT Bumi Aksara.

Farrel. (2004). Polymerase Chain Reaction: Cara Mudah Memperbanyak DNA.

Bogor: Warta Biotek.

Koesnadji, Wirjosoemarto. (2012). Genetika. Bandung: UPI.

Miligan, R. (1992). Gel electrophoresis: Nucleid acids. Oxford: Bros Scientific

Publishers Ltd.

Muladno. (2002). Kimia Analisis Kuantitatif. Yogyakarta: Graha Ilmu.

Murray and Thompson(1980). A rapid method of DNA isolation using laundry

Ningrum, Yuniar Mulyani, Agus Purwanto, dan isni murruhwati. (2008).

Perbandingan Beberapa metode isolasi DA untuk mendeteksi dini koi herpes
virus (KHV) pada ikan mas (Cyprinus carpio L.) Jurnal Bioteknologi. 15 (3): 14-
15.

Prasetyo, Ari Indriana Hapsari. (2008). Isolasi DNA tanaman bayam (Amaranthus
sp.) dan ikan lele (Claris sp.) sebagai kajian dalam biologi molekuler. Jurnal
Biomolekuler. 13 (2): 23.
Purwantara, Indah Fajarwati Langga, Muh Restu dan Tutik Kuswinanti. (2001).
Optimalisasi suhu dan lama ingkubasi dalam ekstraksi DNA tanaman binti (Vitex
cofassus) serta analisis keragaman genetik dengan teknik RAPD-PCR. Jurnal
Biologi Molekular. 12 (3):165-267.

Sudarsono dan Dwi Wahyuni Ardina. (1996). Teknik isolasi DNA genom tanaman
pepaya dan jeruk dengan menggunakan modifikasi buffer CTAB. Jakarta: Bumi
Aksara.

Susanto, Agus Hery. 2012. Bahan Ajar Biologi Molekuler Fakultas Biologi
Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto.

Tamam, Simson. (2012). Penggunaan Polymerase Chain Reaction Enzyme Linked

Oligonucelotide Sorbent Assay (PCR-ELOSA) untuk Deteksi Agen Penyakit. 21
(1): 20-21.

Yuwono, Marlin. (2008). Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta: UI-Press.

 LAMPIRAN

a. b.

c. d.

e. f.
Gambar 1. Alat yang digunakan pada pengamatan mengenai Isolasi DNA
Tumbuhan: (a) (b) Mikropipet (c) (d) Tanki Elektroforesis Mupid
(e) Tabung eppendorf berisi larutan sampel (f) Tabung eppendorf
berisi larutan sampel
g. h.

i. j.

k. l.
 m. n.

o.
Gambar 1. Alat dan bahan yang digunakan pada pengamatan mengenai
Isolasi DNA Tumbuhan: (g) Tabung eppendorf berisi larutan
sampel (h) Tabung eppendorf berisi larutan sampel (i) 5 macam
Tabung eppendorf berisi larutan sampel (j) Mesin PCR (k)
Pengamatan pada Agarose (l) Larutan isopropanol (m) Mortar (n)
Microwave (o) Tip berisi larutan sampel