LAPORAN PRAKTIKUM

BIOTEKNOLOGI TANAMAN
ISOLASI DNA DENGAM METODE CTAB
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Mata Kuliah Bioteknologi Tanaman

Disusun oleh:
Ivo Andryeni
NIM: 4442140560
Kelas : VI A
Kelompok: 5

JURUSAN AGROEKOTEKNOLOGI
FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS SULTAN AGENG TIRTAYASA
2017
 KATA PENGANTAR
Assalamualaikum warahmatullahi wabarakatu. Segala puji bagi Allah
SWT yang telah memberikan kemudahan sehingga dapat menyelesaikan laporan
ini. Shalawat dan salam semoga terlimpah curahkan kepada Nabi Muhammad
SAW.
Laporan ini disusun agar pembaca dapat mengetahui alat cara
melakukan isolasi DNA pada tanaman padi. Walaupun laporan ini
kurang sempurna dan memerlukan perbaikan tapi juga memiliki detail yang cukup
jelas bagi pembaca.
Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada dosen pengampuh mata
kuliah Bioteknologi Tanaman dan asisten laboratorium yang telah membimbing
penulis agar dapat mengerti tentang bagaimana cara menyusun karya tulis ilmiah
yang baik dan sesuai kaidah.
Semoga laporan ini dapat memberikan pengetahuan yang lebih luas
kepada pembaca. Walaupun laporan ini memiliki kelebihan dan kekurangan.
Penyusun membutuhkan kritik dan saran dari pembaca yang membangun. Terima
kasih.

Serang, April 2017

Penulis
 DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR
i
DAFTAR ISI
ii
BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang.
1
1.2 Tujuan..
2
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Isolasi DNA. 3
2.2 Preparasi (Penghancuran Ekstrak)... 6
2.3 Purifikasi(pemurnian DNA) 7
2.4 Presipitasi (pemekatan DNA).. 7
2.5 Klasifikasi dan Morfologi Tanaman Padi 7
BAB III METODOLOGI PRAKTIKUM
3.1 Waktu dan Tempat...
14
3.2 Alat dan Bahan.
14
3.3 Cara Kerja
14
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil.
16
4.2 Pembahasan..
16
BAB V PENUTUP
5.1 Simpulan..
19
5.2 Saran
19
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN
 BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Bioteknologi adalah cabang ilmu yang mempelajari pemanfaatan makhluk
hidup (bakteri, fungi, virus, dan lain-lain) maupun produk dari makhluk hidup
(enzim, alkohol) dalam proses produksi untuk menghasilkan barang dan jasa
dalam memenuhi kebutuhan hidup manusia. Bioteknologi digunakan dalam
kehidupan sehari-hari karena perkembangbiakannya relatif cepat, mudah
dimodifikasi, dan mampu memproses bahan baku lebih cepat untuk menghasilkan
produk baru.
Dewasa ini, perkembangan bioteknologi tidak hanya didasari pada biologi
semata, tetapi juga pada ilmu-ilmu terapan dan murni lainnya. Berdasarkan
pengertian bioteknologi tersebut, maka terdapat 4 prinsip dasar bioteknologi, yaitu
1) penggunaan agen biologi, 2) menggunakan metode tertentu, 3) dihasilkannya
suatu produk turunan, dan 4) melibatkan banyak disiplin ilmu. Bioteknologi
digunakan dalam berbagai bidang seperti bidang pengolahan makanan, bidang
kesehatan, bidang pertaniaan dan perkebunan, serta bidang lingkungan.
Dalam ilmu bioteknologi tanaman terdapat pula ilmu yang mempelajadi
tentang isolasi DNA. DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik
dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan
secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitikondria, dan kloroplas. Perbedaan
ketiganya adalah DNA nukleus berbentuk linier dan berasosiasi sangat erat
dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk
sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu DNA mitokondria
dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal
dari garis ibu. Sedangkan DNA nukleus memiliki pola pewarisan sifat dari kedua
orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot tidak memiliki
protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linier
dan memiliki protein histon (Kirsman, 2010).
Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu
prinsipisolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik
untukmemisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul
yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan
molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung . Hasil sentrifugasi akan
menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas
dan pelet pada bagian bawah (Rachmat, 2012). Banyak alat dan bahan yang
digunakan dalam isolasi DNA, alatnya yaitu hot plate, timbangan analitik, geldoc,
elektroforensis, sisir elektroforensis, bak elektroforensis, sentrifuge,
spektrofotometri, loadingday, primer, waterbath, oven, auto clave, dan PCR.
Bahannya yaitu CTBA, mercapto etanol, PVPP etanol, sedium asetat, alcohol
absolute, isopropanol, Na asetat, buffer TE, TAE, dan ETBR.

1.2 Tujuan
Untuk mengetahui cara melakukan isolasi DNA pada tanaman padi dengan
metode CTAB.
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Isolasi DNA

Isolasi DNA adalah proses pengeluaran DNA dari tempatnya berada

(ekstraksi atau lisis) biasanya dilakukan dengan homogenasi dan penambahan
buffer ekstraksi atau buffer lisis untuk mencegah DNA rusak (Yuwono, 2008).
Pada sel eukariotik termasuk tanaman dan hewan bagian terbesar dari DNA
berada pada nukleus yaitu organel yang dipisahkan dari sitoplasma dengan
membran. Nukleus terdiri dari 90 % keseluruhan DNA seluler. Sisa DNA adalah
organel lain seperti mitokondria dan kloroplas. Karena DNA terdapat pada
nukleus, maka perlu adanya metode pelisisan sel sampai pemanenan sel. Dimana
metode tersebut merupakan bagian dari metode isolasi DNA (Elrod, 2007).

Pemisahan DNA dari materi seluler lainnya merupakan hal yang signifikan
dan mengharuskan penyallinan DNA menjadi RNA dan translasi RNA menjadi
protein berlangsung dalam kompartemen( ruang ) yang berbeda yaitu secara
berturut-turut dalam nucleus dan sitoplasma ( Elrod, 2007 ). Terdapat organel-
organel bermembran ganda di dalam sitoplasma, termasuk mitokondria baik pada
tumbuhan maupun hewan. Oleh karena itu perlu dilakukan isolasi DNA pada
tanaman dan hewan untuk mengetahui dan mempelajari DNA dari tanaman dan
hewan tersebut. Sel eukariotik memiliki DNA lebih banyak, lengkap dengan
komponen-komponen lain. DNA tanaman dan hewan tersimpan dalam
nucleusyang terbungkus oleh membran. Isolasi DNA merupakan langkah yang
tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan
presipitasi.Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran
berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat
molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan
berada pada bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam
fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian
bawah. Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu
komponen dari campuran (Albert, 1994).
 DNA pada makhluk hidup dapat diisolasi secara sederhana. Pengisolasian
DNA secara sederhana dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel,
membran plasma dan membran inti baik secara mekanik maupun secara kimiawi.
Isolasi DNA merupakan suatu teknik yang digunakan untuk memperoleh DNA
murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan. Pemecahan
dinding sel secara mekanik dapat dilakukan dengan pemblenderan atau penggerus
menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan secara kimiawi dapat dilakukan
dengan pemberian detergen. Penambahan sabun cair dan garam dapur adalah
untuk melisiskan membran inti untuk mengeluarkan isi inti sel yang berisi DNA
(Rachmat, 2012).

Isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain:

preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrsk sel dan presipitasi DNA.
Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada
setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini
dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi
yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan
sample buah, maka kadar air pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi
hasil yang berbeda-beda pula. Semakin tinggi kadar air, maka sel yang terlarut di
dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan
sedikit (Kirsman, 2010).

Penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat menyebabkan rusaknya

membrane sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen
dengan protein dan lemak pada membrane membentuk senyawa lipid protein-
deterjen kompleks. Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid
memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga dengan deterjen,
sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia (Kirsman, 2010).

Prinsip prinsip dalam mengisolasi DNA (Tohib, 2012) :

a) melisis sel secara fisik, dengan cara penggerusan

b) pemecahan dinding sel

 c) pemecahan membran sel

d) pemisahan DNA dari bahan yang lain

Dalam isolasi DNA, bahan yang kita gunakan biasanya berupa jaringan
tumbuhan atau jaringan hewan, untuk itu langkah pertama yang harus kita lakukan
adalah memecahkan jaringan menjadi sel-sel yang mandiri. Proses dilakukan
secara mekanik atau fisik dengan menumbuk atau menggerus bahan yang akan
kita gunakan dengan mortar atau blender. Kedua adalah memecahkan dinding sel
dan membran sel lapisan pembungkus DNA. struktur utama pembentuk membran
dan dinding sel adalah lemak, untuk itu kita gunakan deterjen dan garam dapur.
Kedua bahan ini digunakan untuk melubangi dan merusak sel sehingga isi inti sel
(DNA) bisa keluar (Tohib, 2012).

Tahap selanjutnya adalah pemisahan DNA dari bahan yang lain.

Pemisahan dilakukan dengan menggunakan ethanol/alkohol dingin berkonsentrasi
90-95%. Ethanol/Alkohol tidak melarutkan DNA dan berat jenis alkohol yang
lebih ringan dari air membuat DNA naik dan melayang-layang di permukaan
(Tohib, 2012).

CTAB atau Cetyl trimethylammonium bromide merupakan sejenis deterjen

yang dapat mendegradasi dinding sel, denaturasi protein, memisahkan
karbohidrat, merusak membran sel dan melarutkan DNA. Apabila dinding sel
terdegradasi maka semua isi sel dapat keluar termasuk DNA dan dilepaskan ke
dalam buffer ekstraksi.Dalam proses isolasi DNA tanaman, penambahan senyawa
pereduksi seperti merchaptoetanol dapat mencegah proses oksidasi senyawa
fenolik sehingga menghambat aktivitas radikal bebas yang dihasilkan oleh
oksidasi fenol terhadap asam nukleat. Merchaptoetanol juga berfungsi untuk
melindungi RNA dari senyawa quinon, disulphide, peroksida, poliphenoksidase,
dan protein. Proses pemansan pertama bertujuan untuk melarutkan CTAB dan
mercaptoetanol. Sedangkan pemanasan yang kedua bertujuan untuk
memdegradasi protein dan dinding sel (Tohib, 2012).
 Klorofrom dan isoamilalkohol (CIAA) berfungsi untuk mengekstrak dan
dan mengendapkan komponen polisakarida di dalam buffer ektraksi yang
mengkontaminasi larutan DNA. Pemberian isopropanol dan etanol dilakukan agar
terjadi dehidrasi DNA sehingga terjadi presipitasi. Setelah pemberian etanol,
pellet yang dipeoleh dikeringanginkan. Hal ini bertujuan untuk mengeringkan
pellet dari sisa-sisa buffer maupun etanol.Tahapan terakhir dari ektraksi ini adalah
penambahan buffer TE. Buffer TE tris electrophoresisberfungsi untuk melarutkan
DNA yangdihasilkan dan menjagaDNA agar tidak mudah rusak. Dalam buffer TE
mengandung EDTA atau Ethylene Diamine Tetra Acid yang berfungsi sebagai
senyawa pengkelat yang mengikat ion Magnesium, yaitu kofaktor yang
diperlukan untuk altivtas berbagai enzim nuclease. Metode ekstraksi DNA dengan
CTAB akan menghasilkan pita DNA yang berukuran tebal dan dapat memisahkan
DNA dari polisakarida karena adanya perbedaan karakteristik kelarutan
(differensial of solubility). Disamping deperoleh fragmen DNA, dengan metode
CTAB juga akan diperoleh RNA dengan pita tipis yang terletak jauh berada di
bawah pita DNA. Keberadaan pita RNA tergantung bahan yang diekstraksi (Asris,
2010).

Metode ini tidak membutuhkan biaya yang lebih mahal dibandingkan

dengan menggunakan kit. Selain itu, kelebihan dari ektraksi ini adalah pita DNA
yang diproleh lebih tebal bila dibandinglan dengan ektraksi metode fenol dan
tanpa fenol. Akan tetapi, dari hasil dengan metode ini masih terdapat pita smear
dan DNA yang dihasilkan lebih sedikit daripada ektraksi dengan menggunakan
kit. Kendala yang umum terjadi dalam ekstraksi CTAB adalah adanya inhibitor
pada inang, rendahnya konsentrasi vius dan pengaruh cara maupun lama waktu
penyimpanan (Asris, 2010).

2.2 Preparasi (Penghancuran Ekstrak)

Teknik ini diawali dengan perusakan didnding sel (tumbuhan) dan lisis
membran sel yang merupakan upaya pemecahan sel,serta presipitasi DNA yang
akan dipisahkan (purifikasi DNA).Perusakan dinding sel ini biasanya
menggunakan nitrogen cair yang memiliki suhu -169 0C.Penggunaan nitrogen cair
ini dimaksudkan untuk membekukan sel,setelah sel dibekukan lalu sel dirusak
(digerus)sampai benar-benar halus dengan mortar agar dinding sel rusak.Lisis
membran sel yaitu proses untuk meluruhkan membran sel pada nukleus.Teknik ini
umumnya dilakukan menggunakan larutan detergen kationik yaitu CTAB. Hal ini
dikarenakan waktu isolasi yang relatif cepat serta tahapan metode yang relatif
lebih mudah. Buffer CTAB merupakan detergen kationik yang dapat melisis
membran sel dan mampu mengendapkan polisakarida serta senyawa-senyawa
fenolik.Penggunaan CTAB berfungsi untuk mengurangi kontaminan,mengurangi
browning dan untuk menjaga DNA agar tidak rusak.Komponen-komponen yang
terkandung dalam buffer CTAB adalah Tris-cl berfungsi untuk mendanaturasi
protein.Nacl berfungsi sebagai behan penetral gula fosfat DNA.EDTA berfungsi
sebagai penghancur sel dengan cara mengikat ion megnesium yang diperlukan
oleh sel untuk menjaga keutuhan selubung sel secara keseluruhan.Larutan
CTAB,PVP,dan makromolekul berfungsi untuk mendegradasi senyawa-senyawa
metabolit sekunder sekaligus mengurangi browning akibat oksidasi.

2.3 Purifikasi(pemurnian DNA)

Pemurnian (purifikasi) DNA bertujuan untuk menghilangkan beberapa
kontaminan seperti senyawa sekunder (fenol),polisakarida,RNA dan juga
protein.Pemurnian dari kontaminan protein dan RNA dilakukan menggunakan
senyawa kloroform isoamilalkohol,asam asetat,dan enzim RNAse.Senyawa
kloroform isoamilalkohol dan asam asetat berfungsi mendanaturasi protein
sedangkan enzim RNAse berfungsi melisiskan RNA dari ekstrak DNA tersebut.

2.4 Presipitasi (pemekatan DNA)

Dilakukan menggunakan isopropanol dingin yang bertujuan agar DNA
tersebut mengendap atau mengumpul sekaligus memisahkannya dari garam-
garam mineral sisa CTAB. Pelet hasil presipitasi oleh isopropanol ini dibersihkan
menggunakan alkohol 70%. Pemurnian ini merupakan tahapan paling penting
dalam isolasi DNA.Karena bila ada kontaminan selain DNA maka hasil isolasi
DNA yang dilakukan dianggap gagal. Kontaminasi ini dapat menurunkan kualitas
DNA hasil isolasi dan mengakibatkan data yang didapat tidak valid.
2.5 Klasifikasi dan Morfologi Tanaman Padi
Padi Adalah tanaman yang paling penting di negeri kita Indonesia ini.
Betapa tidak karena makanan pokok di Indonesia adalah nasi dari beras yang
tentunya dihasilkan oleh tanaman padi. Selain di Indonesia padi juga menjadi
makanan pokok negara-negara di benua Asia lainnya seperti China, India,
Thailand, Vietnam dan lain-lain. Padi merupakan tanaman berupa rumput
berumpun. Tanaman pertanian ini berasal dari dua benua yaitu Asia dan Afrika
Barat tropis dan subtropis. Bukti sejarah memperlihatkan bahwa penanaman padi
di Zhejiang (Cina) sudah dimulai pada 3.000 tahun SM. Fosil butir padi dan gabah
ditemukan di Hastinapur Uttar Pradesh India sekitar 100-800 SM. Selain Cina dan
India, beberapa wilayah asal padi adalah Bangladesh Utara, Burma, Thailand,
Laos, Vietnam. Hama yang banyak menyerang tanaman ini adalah tikus, orong-
orong, kepinding tanah (lembing batu), walang sangit dan wereng coklat. Hama-
hama itulah yang sering menyebabkan padi gagal panen dan tentunya membuat
petani merugi.
Negara produsen padi terkemuka adalah Republik Rakyat Cina (31% dari
total produksi dunia), India (20%), dan Indonesia (9%). Namun hanya sebagian
kecil produksi padi dunia yang diperdagangkan antar negara (hanya 5%-6% dari
total produksi dunia). Thailand merupakan pengekspor padi utama (26% dari total
padi yang diperdagangkan di dunia) diikuti Vietnam (15%) dan Amerika Serikat
(11%). Indonesia merupakan pengimpor padi terbesar dunia (14% dari padi yang
diperdagangkan di dunia) diikuti Bangladesh (4%), dan Brazil (3%).
Klasifikasi Tanaman Padi
Dalam sistematika tumbuhan diklasifikasikan kedalam:
Divisio : Spermatophyta
Sub division : Angiospermae
Kelas :Monocotyledoneae
Ordo :Poales
Famili :Graminae
Genus :Oryza Linn
Species :Oryza sativa L.
Morfologi Tanaman Padi
Akar
Akar adalah bagian tanaman yang berfungsi menyerap air dan zat
makanan dari dalam tanah, kemudian diangkut ke bagian atas tanaman. Akar
tanaman padi dapat dibedakan atas :
Radikula: akar yang tumbuh pada saat benih berkecambah. Pada benih
yang sedang berkecambah timbul calon akar dan batang. Calon akar
mengalami pertumbuhan ke arah bawah sehingga terbentuk akar tunggang,
sedangkan calon batang akan tumbuh ke atas sehingga terbentuk batang
dan daun.
Akar serabut (akaradventif): setelah 5-6 hari terbentuk akar tunggang, akar
serabut akan tumbuh.
Akar rambut: merupakan bagian akar yang keluar dari akar tunggang dan
akar serabut. Akar ini merupakan saluran pada kulit akar yang berada
diluar, dan ini penting dalam pengisapan air maupun zat-zat makanan.
Akar rambut biasanya berumur pendek sedangkan bentuk dan panjangnya
sama dengan akar serabut.
Akar tajuk (crown roots): adalah akar yang tumbuh dari ruas batang
terendah. Akar tajuk ini dibedakan lagi berdasarkan letak kedalaman akar
di tanah yaitu akar yang dangkal dan akar yang dalam. Apabila kandungan
udara di dalam tanah rendah,maka akar-akar dangkal mudah berkembang.
Bagian akar yang telah dewasa (lebih tua) dan telah mengalami
perkembangan akan berwarna coklat, sedangkan akar yangbaru atau bagian akar
yangmasih muda berwarna putih.
Batang
Padi termasuk golongan tumbuhan Graminae dengan batang yang tersusun
dari beberapa ruas. Ruas-ruas itu merupakan bubung kosong. Pada kedua ujung
bubung kosong itu bubungnya ditutup oleh buku. Panjangnya ruas tidak sama.
Ruas yang terpendek terdapat pada pangkal batang. Ruas yang kedua, ruas yang
ketiga, dan seterusnya adalah lebih panjang daripada ruas yang didahuluinya.
Pada buku bagian bawah dari ruas tumbuh daun pelepah yangmembalut ruas
sampai buku bagian atas.Tepat pada buku bagian atas ujumg dari daun pelepah
memperlihatkan percabangan dimana cabang yang terpendek menjadi ligula
(lidah) daun, dan bagian yamg terpanjang dan terbesar menjadi daun kelopak yang
memiliki bagian auricle pada sebelah kiri dan kanan. Daun kelopak yang
terpanjang dan membalut ruas yang paling atas dari batang disebut daunbendera.
Tepat dimana daun pelepah teratas menjadi ligula dan daun bendera, di situlah
timbul ruas yang menjadi bulir padi.
Pertumbuhan batang tanaman padi adalah merumpun, dimana terdapat
satu batang tunggal/batang utama yang mempunyai 6 mata atau sukma, yaitu
sukma 1, 3, 5 sebelah kanan dan sukma 2, 4, 6 sebelah kiri. Dari tiap-tiap sukma
ini timbul tunas yang disebut tunasorde pertama.

Tunas orde pertama tumbuhnya didahului oleh tunas yang tumbuh dari
sukma pertama, kemudian diikuti oleh sukma kedua, disusul oleh tunas yang
timbul dari sukma ketiga dan seterusnya sampai kepad apembentukan tunas
terakhir yang keenam pada batang tunggal.Tunas-tunas yang timbul dari tunas
orde pertama disebu ttunas orde kedua. Biasanya dari tunas-tunas orde pertama ini
yang menghasilkan tunas-tunas orde kedua ialah tunas orde pertama yang
terbawah sekali pada batang tunggal/ utama. Pembentukan tunas dari orde ketiga
pada umunya tidak terjadi,oleh karena tunas-tunas dari orde ketiga tidak
mempunyai ruang hidup dalam kesesakan dengan tunas-tunas dari orde pertama
dan kedua.
Daun
Padi termasuk tanaman jenis rumput-rumputan mempunyai daun yang
berbeda-beda, baik bentuk, susunan, atau bagian bagiannya. Ciri khas daun padi
adalah adanya sisik dan telinga daun. Hal inilah yang menyebabkan daun padi
dapat dibedakan dari jenis rumput yang lain. Adapun bagian-bagian daun padi
adalah :
Helaian daun: terletak pada batang padi dan selalu ada. Bentuknya
memanjang seperti pita. Panjang dan lebar helaian daun tergantung
varietas padi yang bersangkutan.
 Pelepah daun (upih): merupakan bagian daun yang menyelubungi batang,
pelepah daun ini berfungsi memberi dukungan pada bagian ruas yang
jaringannya lunak, dan hal ini selalu terjadi.
Lidah daun: lidah daun terletak pada perbatasan antara helai daun dan
upih. Panjang lidah daun berbeda-beda, tergantung pada varietas padi.
Lidah daun duduknya melekat pada batang. Fungsi lidah daun adalah
mencegah masuknya air hujan diantara batang dan pelepah daun (upih).
Disamping itu lidah daun juga mencegah infeksi penyakit, sebab media air
memudahkan penyebaran penyakit.
Daun yang muncul pada saat terjadi perkecambahan dinamakan coleoptile.
Koleopti lkeluar dari benih yang disebar dan akan memanjang terus sampai
permukaan air. koleoptil baru membuka, kemudian diikuti keluarnya daun
pertama, daun kedua dan seterusnya hingga mencapai puncak yang disebut daun
bendera, sedangkan daun terpanjang biasanya pada daun ketiga. Daun bendera
merupakan daun yang lebih pendek daripada daun-daun di bawahnya, namun
lebih lebar dari pada daun sebelumnya. Daun bendera ini terletak di bawah malai
padi. Daun padi mula-mula berupa tunas yang kemudian berkembang menjadi
daun. Daun pertama pada batang keluar bersamaan dengan timbulnya tunas (calon
daun) berikutnya. Pertumbuhan daun yang satu dengan daun berikutnya (daun
baru) mempunyai selang waktu 7 hari,dan 7 hari berikutnya akan muncul daun
baru lainnya.
Bunga
Sekumpulan bunga padi (spikelet) yang keluar dari buku paling atas
dinamakan malai. Bulir-bulir padi terletak pada cabang pertama dan cabang
kedua, sedangkan sumbu utama malai adalah ruas buku yang terakhir pada batang.
Panjang malai tergantung pada varietas padi yang ditanam dancara bercocok
tanam. Dari sumbu utama pada ruas buku148yang terakhir inilah biasanya
panjang malai (rangkaian bunga) diukur. Panjang malai dapat dibedakan menjadi
3 ukuran yaitu malai pendek (kurang dari 20 cm), malai sedang (antara 20-30 cm),
dan malai panjang (lebih dari 30cm). Jumlah cabang pada setiap malai berkisar
antara 15-20 buah, yang paling rendah 7 buah cabang, dan yang terbanyak dapat
mencapai 30 buah cabang. Jumlah cabang ini akan mempengaruhi besarnya
rendemen tanaman padi varietas baru, setiap malai bisa mencapai100-120 bunga.
Bunga padi adalah bunga telanjang artinya mempunyai perhiasan bunga.
Berkelamin dua jenis dengan bakal buah yang diatas. Jumlah benang sari ada 6
buah, tangkai sarinya pendek dan tipis, kepala sari besar serta mempunyai dua
kandung serbuk. Putik mempunyai dua tangkai putik, dengan dua buah kepala
putik yang berbentuk malai dengan warna pada umumnya putih atau ungu.
Komponen-komponen (bagian) bunga padi adalah:
kepala sari
tangkai sari
palea (belahan yang besar)
lemma (belahan yang kecil)
kepala putik
tangkai bunga
Buah
Buah padi yang sehari-hari kita sebut biji padi atau butir/gabah,sebenarnya
bukan biji melainkan buah padi yang tertutup oleh lemma dan palea. Buah ini
terjadi setelah selesai penyerbukkan dan pembuahan. Lemma dan palea serta
bagian lain yang membentuk sekam atau kulit gabah.
Jika bunga padi telah dewasa, kedua belahan kembang mahkota (palea dan
lemmanya) yang semula bersatu akan membuka dengan sendirinya sedemikian
rupa sehingga antara lemma dan palea terjadi siku/sudut sebesar 30-600.
Membukanya kedua belahan kembang mahkota itu terjadi pada umumnya pada
hari-hari cerah antara jam 10-12, dimana suhu kira-kira 30-320C. Di dalam dua
daun mahkota palea dan lemma itu terdapat bagian dalam dari bunga padi yang
terdiri dari bakal buah (biasa disebut karyiopsis).
Jika buah padi telah masak, kedua belahan daun mahkota bunga itulah
yang menjadi pembungkus berasnya (sekam). Diatas karyiopsis terdapat dua
kepala putik yang dipikul oleh masing-masing tangkainya. Lodicula yang
berjumlah dua buah, sebenarnya merupakan daun mahkota yang telah berubah
bentuk. Pada waktu padi hendak berbunga, lodicula menjad imengembang karena
menghisap cairan dari bakal buah. Pengembangan ini mendorong lemma dan
palea terpisah dan terbuka.
Hal ini memungkinkan benang sari yang memanjang keluar dari bagian
atas atau dari samping bunga yang terbuka tadi. Terbukanya bunga diikuti dengan
pecahnya kandung serbuk, yang kemudian menumpahkan tepung sarinya.
Sesudah tepung sarinya ditumpahkan dari kandung serbuk maka lemma dan palea
menutup kembali. Dengan berpindahnya tepung sari dari kepala putik maka
selesailah sudah proses penyerbukkan. Kemudian terjadilah pembulaian yang
menghasilkan lembaga dan endosperm. Endosperm adalahpenting sebagai
sumbercadangan makanan bagitanaman yang baru tumbuh
 BAB III
METODOLOGI PRAKTIKUM

3.1 Waktu dan Tempat

Praktikum Bioteknologi Tanaman yang berjudul Isolasi DNA Dengan
Metode CTAB dilaksanakan pada hari Selasa, tanggal 21 Maret 2017, pukul
08.00 - 10.00 WIB. Bertempat di Laboratorium Bioteknologi. Fakultas Pertanian.
Universitas Sultan Ageng Tirtayasa.

3.2 Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada praktikum ini adalah mortar, tube, mikropipet,
gelas jam, tips, vortex, label, dan centrifuge. Bahan yang digunakan pada
praktikum ini adalah bibit padi popot, chloroform, mercaptoetanil, PVPP, dan
CTAB.

3.3 Cara Kerja

1) Sebanyak 0,25 0,5 gram sampel daun digerus dalam lummpang poselin
dengan bantuan nitrogen cair untuk menghindarkan oksigen pada proses
penggerusan ditambahkan kurang lebih 0,02 gram PVPP (catat mortar atau
lumpang dan alu atau pestel setelah didinginkan terlebih dahulu dalam
freezer).
2) Serbuk sampel dimasukan kedalam mikrotube 2 ml yang telah diisi 1 ml
buffer ekstrak CTAB dan 10 mikro liter mercapto etanol 1 %.
3) Campuran di vortex kurang lebih 2 menit kemudian diinkubasi 65 o C
selama 30 menit (setiap 10 menit campuran dihomogenkan dengan
membolak balik tabung).
4) Larutan ekstak DNA dipurifikasi dengan penambahan 750 mikro liter
chlorofoam : isoamil alcohol (24 : 1), campuran divortex dan
dicentrifugasi pada 100 rpm selama 10 menit.
5) Supernatant dipipet kedalam mikrotube 2 ml yang baru, proses purifikasi
diulang 1 kali lagi.
6) DNA diendapkan dengan penambahan 1 ml isopropanol dingin kemudian
dihomogenkan perlahan sampai terbentuk benang benang putih.
Campuran diinkubasi pada 20o C selama minimal 30 menit. Kemudian
pellet DNA disentrifugasi 1100 rpm selama 10 menit.
 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil
Hasil Uji Isolasi DNA Menggunakan Metode CTAB Pada Tanaman Padi
Varietas Popot.

4.2 Pembahasan
Isolasi DNA adalah proses pengeluaran DNA dari tempatnya berada
(ekstraksi atau lisis) biasanya dilakukan dengan homogenasi dan penambahan
buffer ekstraksi atau buffer lisis untuk mencegah DNA rusak. Pada sel eukariotik
termasuk tanaman dan hewan bagian terbesar dari DNA berada pada nukleus yaitu
organel yang dipisahkan dari sitoplasma dengan membran.
Pengisolasian DNA secara sederhana dapat dilakukan dengan
memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti baik secara mekanik
maupun secara kimiawi. Isolasi DNA merupakan suatu teknik yang digunakan
untuk memperoleh DNA murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam
jaringan. Pemecahan dinding sel secara mekanik dapat dilakukan dengan
pemblenderan atau penggerus menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan secara
kimiawi dapat dilakukan dengan pemberian detergen. Penambahan sabun cair dan
garam dapur adalah untuk melisiskan membran inti untuk mengeluarkan isi inti
sel yang berisi DNA.
Isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain:
preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrsk sel dan presipitasi DNA.
Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada
setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini
dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi
yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan
sample buah, maka kadar air pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi
hasil yang berbeda-beda pula. Semakin tinggi kadar air, maka sel yang terlarut di
dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan
sedikit.
Prinsip prinsip dalam mengisolasi DNA yaitu, melisis sel secara fisik,
dengan cara penggerusan, pemecahan dinding sel, pemecahan membran sel,
pemisahan DNA dari bahan yang lain. Dalam isolasi DNA, bahan yang kita
gunakan biasanya berupa jaringan tumbuhan atau jaringan hewan, untuk itu
langkah pertama yang harus kita lakukan adalah memecahkan jaringan menjadi
sel-sel yang mandiri. Proses dilakukan secara mekanik atau fisik dengan
menumbuk atau menggerus bahan yang akan kita gunakan dengan mortar atau
blender. Kedua adalah memecahkan dinding sel dan membran sel lapisan
pembungkus DNA. struktur utama pembentuk membran dan dinding sel adalah
lemak, untuk itu kita gunakan deterjen dan garam dapur. Kedua bahan ini
digunakan untuk melubangi dan merusak sel sehingga isi inti sel (DNA).
Tahap selanjutnya adalah pemisahan DNA dari bahan yang lain.
Pemisahan dilakukan dengan menggunakan ethanol/alkohol dingin berkonsentrasi
90-95%. Ethanol/Alkohol tidak melarutkan DNA dan berat jenis alkohol yang
lebih ringan dari air membuat DNA naik dan melayang-layang di permukaan.
CTAB atau Cetyl trimethylammonium bromide merupakan sejenis deterjen
yang dapat mendegradasi dinding sel, denaturasi protein, memisahkan
karbohidrat, merusak membran sel dan melarutkan DNA. Apabila dinding sel
terdegradasi maka semua isi sel dapat keluar termasuk DNA dan dilepaskan ke
dalam buffer ekstraksi.Dalam proses isolasi DNA tanaman, penambahan senyawa
pereduksi seperti merchaptoetanol dapat mencegah proses oksidasi senyawa
fenolik sehingga menghambat aktivitas radikal bebas yang dihasilkan oleh
oksidasi fenol terhadap asam nukleat. Merchaptoetanol juga berfungsi untuk
melindungi RNA dari senyawa quinon, disulphide, peroksida, poliphenoksidase,
dan protein. Proses pemansan pertama bertujuan untuk melarutkan CTAB dan
mercaptoetanol. Sedangkan pemanasan yang kedua bertujuan untuk
memdegradasi protein dan dinding sel.
Klorofrom dan isoamilalkohol (CIAA) berfungsi untuk mengekstrak dan
dan mengendapkan komponen polisakarida di dalam buffer ektraksi yang
mengkontaminasi larutan DNA. Pemberian isopropanol dan etanol dilakukan agar
terjadi dehidrasi DNA sehingga terjadi presipitasi. Setelah pemberian etanol,
pellet yang dipeoleh dikeringanginkan. Hal ini bertujuan untuk mengeringkan
pellet dari sisa-sisa buffer maupun etanol.Tahapan terakhir dari ektraksi ini adalah
penambahan buffer TE. Buffer TE tris electrophoresisberfungsi untuk melarutkan
DNA yangdihasilkan dan menjagaDNA agar tidak mudah rusak. Dalam buffer TE
mengandung EDTA atau Ethylene Diamine Tetra Acid yang berfungsi sebagai
senyawa pengkelat yang mengikat ion Magnesium, yaitu kofaktor yang
diperlukan untuk altivtas berbagai enzim nuclease. Metode ekstraksi DNA dengan
CTAB akan menghasilkan pita DNA yang berukuran tebal dan dapat memisahkan
DNA dari polisakarida karena adanya perbedaan karakteristik kelarutan
(differensial of solubility). Disamping deperoleh fragmen DNA, dengan metode
CTAB juga akan diperoleh RNA dengan pita tipis yang terletak jauh berada di
bawah pita DNA. Keberadaan pita RNA tergantung bahan yang diekstraksi.
Kelebihan dari ektraksi ini adalah pita DNA yang diproleh lebih tebal bila
dibandinglan dengan ektraksi metode fenol dan tanpa fenol. Akan tetapi, dari hasil
dengan metode ini masih terdapat pita smear dan DNA yang dihasilkan lebih
sedikit daripada ektraksi dengan menggunakan kit. Kendala yang umum terjadi
dalam ekstraksi CTAB adalah adanya inhibitor pada inang, rendahnya konsentrasi
vius dan pengaruh cara maupun lama waktu penyimpanan.
 BAB V
PENUTUP

5.1 Simpulan
Pengisolasian DNA secara sederhana dapat dilakukan dengan
memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti baik secara mekanik
maupun secara kimiawi. Isolasi DNA merupakan suatu teknik yang digunakan
untuk memperoleh DNA murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam
jaringan. Pemecahan dinding sel secara mekanik dapat dilakukan dengan
pemblenderan atau penggerus menggunakan mortar dan pistil.
Kelebihan dari ektraksi ini adalah pita DNA yang diproleh lebih tebal bila
dibandinglan dengan ektraksi metode fenol dan tanpa fenol. Akan tetapi, dari hasil
dengan metode ini masih terdapat pita smear dan DNA yang dihasilkan lebih
sedikit daripada ektraksi dengan menggunakan kit. Kendala yang umum terjadi
dalam ekstraksi CTAB adalah adanya inhibitor pada inang, rendahnya konsentrasi
vius dan pengaruh cara maupun lama waktu penyimpanan.

5.2 Saran
Saat sedang praktikum sebaiknya menggunakan pakaian yang lengkap
seperti masker, jas lab, dan sarung tangan agar lebih aman. Dan pada saat
menggunakan alat atau bahan yang berbahaya harus hati hati dan harus sesua
dengan prosedur kerja yang sudah di tetapkan.
DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 2013. Klasifikasi dan Morfologi Tanaman Padi.

http://www.petanihebat.com/2013/09/klasifikasi-dan-morfologi-tanaman-
padi.html. Diakses pada tanggal 17 April 2017, pada pukul 23.00 WIB.

Albert, B., 1994. Biologi Molekuler Sel Edisi Kedua. PT. Gramedia Pustaka
Utama: Jakarta.
Asris., 2010. Definisi Isolasi DNA dan Manfaat Isolasi DNA.http://asris07.
Student.ipb.ac.id. Diakses pada tanggal 17 April 2017, pada pukul 23.00
WIB.

Elrod, S., 2007. Genetika Edisi Keempat. Erlangga. Jakarta.

Kirsman, 2010.Isolasi DNA Buah. http://kirsman83.weebl..com. Diakses pada

tanggal 17 April 2017, pada pukul 23.00 WIB.

Rachmat, 2012. Isolasi DNA. http://rachmatyusuf.blogspot.com. Diakses pada

tanggal 17 April 2017, pada pukul 23.00 WIB.

Suryo, 2004. Genetika Strata 1. Universitas Gadjah Mada: Yogyakarta.

Tohib, 2012. Macam Metode Isolasi DNA. http://www.tohib.web.id. Diakses pada

tangga17 Aprilt 2017, pada pukul 23.00 WIB.

Yuwono, T., 2008. Biologi Molekuler. Erlangga: Jakarta.

LAMPIRAN

Pengeringan sampel
dengan blower.
Pellet DNA tanamn
Menghomogenkan
padi.
ekstrak tanaman padi.
Tube. Tip
s. DNA tanaman padi
yang sudah di isolasi.

Menumbuk tanaman
Mencetrifuge pellet.
padi.