LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI

Mata Kuliah :G E N E T I KA

JUDUL PRAKTIKUM
UJI KUANTITATIF DNA DENGAN SPEKTROFOTOMETER

OLEH:

NAMA : WISUDA PRAMARTA LUBIS

NIM : 0704181039

Jurusan / Prodi : BIOLOGI

Kelas / Semester : BIOLOGI-4 / V (LIMA)

Kelompok :

Tgl. Pelaksanaan :

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI

UIN SUIMATERA UTARA

1
I. JUDUL PRAKTIKUM : UJI KUANTITATIF DNA DENGAN

SPEKTROFOTOMETER

II. TUJUAN PRAKTIKUM : Untuk mengetahui kuantitas DNA dengan

menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 dan 280nm

III. TINJAUAN TEORITIS :

Isolasi DNA merupakan teknik dasar dari bioteknologi dan biomolekular yang harus
dikuasai di laboratorium. Isolasi DNA bertujuan untuk memisahkan DNA dari partikel-
partikel lainnya seperti lipid, protein, polisakarida, dan zat lainnya. Isolasi DNA berguna
untuk beberapa analisis molekuler dan rekayasa genetika seperti genom editing, transformasi
dan PCR. Banyak sekali metode isolasi DNA yang bisa digunakan, akan tetapi pada dasarnya
tahapan dari isolasi DNA pada semua bahan dan semua metode adalah sama, yakni lisis sel
atau jaringan yang efektif, denaturasi kompleks nukleoprotein, dan inaktivasi nuklease
(Hariyadi, 2018)

Isolasi DNA merupakan tahap pertama dari berbagai teknologi analisis DNA. DNA
dapat ditemukan baik pada kromosom inti maupun organel, yaitu mitokondria dan kloroplas.
Isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain, yaitu preparasi ekstrak sel,
pemurnian DNA dari ekstraksi sel dan presipitasi DNA. Tahapan untuk mengekstrak DNA,
diperlukan langkah-langkah laboratorium untuk memecahkan dinding sel dan membran inti,
yang dilanjutkan dengan pemisahan DNA dari berbagai komponen sel lain. Pada saat
melakukannya, DNA harus dijaga agar tidak rusak dan didapatkan DNA dalam bentuk rantai
yang panjang (Fatchiyah, 2012).

DNA yang mengandung basa-basa purin dan pirimidin dapat menyerap cahaya UV.
Pita ganda DNA dapat menyerap cahaya UV pada 260 nm, sedangkan kontaminan protein
atau fenol dapat menyerap cahaya pada 280 nm. Dengan adanya perbedaan penyerapan
cahaya UV ini maka kemurnian DNA dapat diukur dengan menghitung nilai absorbansi 260
nm dibagi dengan nilai absorbansi 280, dan nilai kemurnian DNA berkisar antara 1.8-2.0
(Fatchiyah, 2011).

Pada umumnya, teknik isolasi DNA pada tanaman tahunan memerlukan berbagai
modifikasi dari teknik standar umumnya, seperti penambahan antioksidan
polivinilpolipirolidon (PVPP) dan mercaptoethanol, ataupun penggunaan nitrogen cair untuk
membantu menghancurkan jaringan serta penyimpanan lebih lama (over night) dari ekstrak
daun yang telah digerus sebelum dilakukan purifikasi.

2
 DNA berkualitas tinggi yang akan didapat dalam suatu ekstraksi merupakan satu
kaidah dasar yang harus dipenuhi dalam studi molekuler, terutama dalam penandaan sidik jari
DNA. Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB) merupakan metode yang umum
digunakan dalam ekstraksi DNA tanaman yang banyak mengandung polisakarida dan
senyawa polifenol.

Penggunaan bufer CTAB sebagai pengganti nitrogen cair untuk mengisolasi DNA
pada tanaman jeruk dan pepaya dapat menghasilkan produk DNA yang berkualitas yang
ditunjukkan oleh pita DNA genom.

Uji kuantitatif DNA adalah analisis untuk menentukan kandungan/jumlah DNA yang
terdapat dalam suatu zat atau komponen zat yang sebelumnya telah diketahui keberadaan
DNA plasmidnya dalam larutan contoh dengan cara uji kualitatif.

Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan Visible.

Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm karena sinar UV tidak dapat dideteksi
oleh mata, maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang
tidak memiliki warna bening dan transparan. Alat ini menggunakan dua buah sumber cahaya
berbeda, sumber cahaya UV dan sumber cahaya visible. Meskipun untuk alat yang lebih
canggih sudah menggunakan hanya satu sumber sinar sebagai sumber UV dan Vis, yaitu
photodiode yang dilengkapi dengan monokromator (Hapsari, 2012)

Uji kualitas DNA menggunakan spektrofotometri adalah dengan mengukur DNA

murni hasil isolasi pada panjang gelombang 260 nm, dimana DNA menyerap cahaya paling
kuat. Perhitungan kemurnian yang paling umum adalah dengan menentukan rasio absorbansi
dari panjang gelombang 260 nm dibagi dengan absorbansi dari panjang 280 nm. Kualitas
DNA juga dapat dilihat dari hasil elektroforesis gel agarosa 1%. (Wasdili, 2018)

Uji keberhasilan DNA yang kedua ialah uji kuantitatif dengan menggunakan nano
drop spektrofotometri. Prinsip kerja nano drop spektrofotometri ialah DNA murni mampu
menyerap cahaya ultraviolet karena adanya basa purin dan pirimidin. Hasil uji nano drop
ialah berupa nilai kemurnian DNA pada Å260/Å280 dan nilai konsentrasi DNA. DNA
berkualitas baik berdasarkan uji nano drop memiliki kemurnian 1,8-2,0 (Hikmatyar, 2015)

Keanekaragaman genetik dapat terjadi karena adanya perubahan nukleotida penyusun

DNA. Perubahan ini mungkin dapat mempengaruhi fenotipe suatu organisme yang dapat
dilihat secara langsung atau mempengaruhi reaksi individu terhadap lingkungan tertentu.
Secara umum keanekaragaman genetik dari suatu populasi dapat terjadi karena adanya
mutasi, rekombinasi, atau migrasi gen dari satu tempat ke tempat lain.

3
 Molekul DNA dalam suatu sel dapat diekstraksi atau diisolasi untuk berbagai macam
keperluan seperti amplifikasi dan analisis DNA melalui elektroforesis. Isolasi DNA dilakukan
dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan
karbohidrat. Prisnsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi
atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA.
DNA hasil isolasi selanjutnya dilakukan cek kuantitas dan kualitas untuk melihat konsentrasi
dan kemurniannya dengan menggunakan spektrofotometer dan nano drop. (Harahap, 2017)

4
IV. ALAT DAN BAHAN :

Alat

Nama Alat Jumlah

Spektrofotometer UV-Vis 1 buah
Pipet mikroliter 2 buah
Kimwipes 1 buah
Kuvet dan lid 3 buah
Gelas kimia 1 buah

Bahan
Nama Bahan Jumlah
DNA hasil isolasi 4 mikroliter
Aquades steril 996 mikroliter

V. PROSEDUR KERJA :

No Prosedur Kerja
1 Disiapkan alat uji kuantitatif
2 Dibersihkan kuvet dan lit menggunakan kimwipes sampai bersih pada bagian dalam
dan luarnya
3 Diencerkan DNA hasil isolasi sebanyak 250 kali factor pengenceran
4 Diambil aquades steril sebanyak 996 mikroliter menggunakan pipet mikro lalu
dimasukkan kedalam kuvet
5 Ditambahkan DNA hasil isolasi sebanyak 4 mikroliter menggunakan pipet mikro
lalu dimasukkan kedalam kuvet
6 Dihomogenkan keduanya hingga tercampur rata lalu didiamkan beberapa saat
sambil menunggu langkah selanjutnya
7 Dioperasionalkan spektrofotometer untuk melihat spectrum pada panjang
gelombang 260 dan 280 nanometer
8 Diisi aquades steril kedalam 2 buah kuvet, lalu dimasukkan kedalam
spektrofotometer setelah itu lihat bacaan “Auto zero” pada monitor
9 Dimasukkan sampel yang telah dihomogenkan kedalam spektrofotometer
10 Dilihat pada monitor, nilai berapa yang muncul pada panjang gelombang 260 dan
280, lalu dicatat untuk dihitung hasilnya.

5
VI. HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN :

Hasil yang didapat dari penelitian yaitu :

No Panjang Gelombang Nilai Absorbansi

1 260 0,017
2 280 0,013

Pembahasan : praktikum genetika kali ini melakukan kegiatan uji kuantitas DNA. Uji
kuantitas DNA dilakukan menggunakan hasil isolasi DNA tanaman padi. Isolasi DNA
tersebut diuji konsentrasi dan kemurniannya menggunakan nanophotometer, nanophotometer
merupakan alat yang digunakan untuk mencari tahu suatu konsentrasi dan kemurnian DNA
dengan menggunakan metode alnalisis spektrofotometri.

sesuai dengan rumus konsentrasi DNA yaitu

[DNA] = Panjang Gelombang x 50 x Faktor Pengenceran
= 0,017 x 50 x 250
= 212,5 mikrogram/milliliter

NB : 50 Merupakan nilai ketentuan larutan dengan nilai absorbansi 1.0 sebanding dengan
50 ug untai ganda DNA per mL

Kemurnian DNA = Panjang Gelombang 260 : Panjang Gelombang 280

= 0,017 : 0,013
= 1,3  Kurang Murni

Berdasarkan hasil penelitian, rasio 1,3 dikatakan kurang murni karena rasio
kemurnian yang digunakan yaitu bernilai 1,9 – 2 . untuk lebih meyakinkan apakah hasil
penelitian ini sesuai atau tidak kemurnian bisa menggunakan elektroforesis.

6
VII. KESIMPULAN

Berdasarkan hasil praktikum, dapat disimpulkan bahwa perbedaan massa dan sampel
mempengaruhi kuantitas dan total DNA dari sampel tersebut. Selain itu hasil sampel yang
didapat menunjukkan kemurnian yang kurang baik dikarenakan tingkat kemurniannya kurang
dari 1,9. Menurut Albert (1994), tingkat kemurnian DNA berkorelasi dengan kualitasnya.
DNA dikatakan berkualitas jika memiliki tingkat kemurnian yang tinggi, karena telah
termurnikan dari kontaminan seperti RNA, protein dan lipid. Tingkat kemurnian DNA diukur
dengan membandingkan absorbansi asam nukleat pada panjang gelombang A260 nm dan
protein pada A280 nm. Kontaminasi DNA dapat dilihat dengan semakin meningkatnya nilai
absorbansi protein. Isolasi DNA merupakan tahap awal untuk mempelajari DNA, selanjutnya
dapat dilakukan uji kualitas dan kuantitas DNA guna mengetahui isolasi DNA tersebut murni
atau kontam.

VIII. DAFTAR PUSTAKA :

Fatchiyah, 2011. Pelatihan Analisis Fingerprinting DNA Tanaman Dengan Metode RAPD.
Malang: Modul Laboratorium Sentral Ilmu Hayati Universitas Brawijaya.

Fatchiyah, dkk. 2012. Buku Praktikum Teknik Analisa Biologi Molekuler. Malang:
Laboratorium Biologi Molekuler dan Seluler Jurusan Biologi Fakultas MIPA
Universitas Brawijaya.

Hariyadi, Slamet. 2018. Perbandingan Metode Lisis Jaringan Hewan dalam Proses Isolasi
DNA Genom pada Organ Liver Tikus Putih (Rattus norvegicus). Proceeding Biology
Education Conference. Volume 15, Nomor 1

Hikmatyar, Mohamad Fazri., dkk. 2015. Isolasi Dan Amplifikasi Dna Keladi Tikus
(Thyponium flagelliform) Untuk Identifikasi Keragaman Genetik. Jurnal Bioteknologi
dan Biosains Indonesia. Vol.2 No.2

Hapsari, Rizqi. 2012. Uji Kuantitatif Dan Kualitatif DNA Pule Pandak. Program Studi
Agroteknologi. Universitas Sebelas Maret.

Harahap, Ariani Syahfitri. 2017. Uji Kualitas Dan Kuantitas DNA Beberapa Populasi Pohon
Kapur Sumatera. Journal of Animal Science and Agronomy Panca Budi. Vol 2 No 2

Wasdili, Fini Ainun Qolbi dan Tintin Gartinah. 2018. Penentuan Kualitas Isolasi DNA
Salmonella Typhimurium Dengan Metode Spektrofotometri Dan Elektroforesis.
Prosiding Pertemuan Ilmiah Nasional Penelitian & Pengabdian Masyarakat
(PINLITAMAS). Vol. 1 No.1

7
 Medan,

PRAKTIKAN

( )

NIM :