UJI KUANTITATIF DNA

Rr. Bhintarti Suryohastari , Maulana Malik Assayyidin dan Puri Nur2), Aditya Rizky
1)

Maulana, Alfathan Luthfi, Eka Novia Mahesti, Marita Yuni Fitriadi, Rahma Qurrotu
A’yun3),

1) Dosen Pengampu Praktikum Biologi Molekular

2) Asisten Dosen Praktikum Biologi Molekular Program Studi Biologi
3) Mahasiswa Program Studi Biologi
Fakultas Sains dan Teknologi, UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Jl. Ir. Juanda No. 95 Ciputat 15412

Abstrak
Keberadaan DNA dalam suatu organisme dapat diketahui dengan 2 cara yaitu secara kualitatif dengan metode
Elektroforesis Gel Agarose dan secara kuantitatif dengan metode  spektrofotometri. Uji kuantitatif DNA adalah
analisis untuk menentukan kandungan/jumlah DNA yang terdapat dalam suatu zat atau komponen zat. Uji
kuantitatif DNA diawali dengan isolasi DNA. Hal ini bertujuan untuk mengeluarkan DNA yang berada dalam inti
sel dari organisme. Tujuan dilakukannya praktikum untuk dapat melakukan uji kuantitatif terhadap DNA dan
melakukan perhitungan konsentrasi DNA. Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah voteks, sentrifuge,
mikrotube, mikropipet, kuvet dan spektrofotometer UV-Vis. Sedangkan bahan yang digunakan adalah sampel hasil
ekstraksi, akuabides dan akuades. Uji kuantitatif DNA diawali dengan hasil ekstraksi di thawing kemudian di
vortex. Selanjutnya di sentrifugasi kemudian dilihat absorbansinya pada spektrofotometer dengan panjang
gelombang 260 nm dan 280 nm. Berdasarkan data yang ada didapatkan kontaminasi pada sampel karena
menujunjukkan nilai dibawah 1,8 (tidak murni DNA). Selanjutnya pada pengukuran nilai konsentrasi sebanding
dengan nilai absorbansi panjang gelombang 260, menandakan jumlah DNA yang terkandung dan konsentrasinya.
Dapat disimpulkan bahwa nilai rasio yang rendah dari nilai 1,8 menunjukkan adanya protein atau kontaminan
lainnya dan jika nilai konsentrasinya tinggi maka nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 juga tinggi.

Kata Kunci: DNA, Uji Kuantitatif, kemurniaan, konsentrasi.

Pendahuluan
Asam deoksiribonukleat atau lebih
dikenal dengan DNA
(deoxyribonucleid acid) adalah sejenis asam
nukleat yang tergolong biomolekul utama
penyusun berat kering setiap organisme. Di
dalam sel, DNA umumnya terletak di dalam
inti sel. Tetapi ada pula DNA yang terdapat
di mitokondria, oleh karena itu disebut DNA
mitokondria. Secara garis besar, peran DNA
di dalam sebuah sel adalah sebagai materi
genetik. Artinya, DNA menyimpan cetak
biru bagi segala aktifitas sel. Dan ini berlaku
umum bagi setiap organisme (Zubaidah,
2004).
1
Keberadaan DNA dalam suatu
organisme dapat diketahui dengan 2 cara
yaitu secara kualitatif dengan metode
Elektroforesis Gel Agarose dan secara
kuantitatif dengan metode  spektrofotometri.
Uji kuantitatif DNA adalah analisis untuk
menentukan kandungan/jumlah DNA yang
terdapat dalam suatu zat atau komponen zat
yang sebelumnya telah diketahui keberadaan
DNA plasmidnya dalam larutan contoh
dengan cara uji kualitatif (Fathicyyah,
2011).
 Uji kuantitatif DNA diawali dengan
isolasi DNA. Hal ini bertujuan untuk
mengeluarkan DNA yang berada dalam inti
sel dari organisme. Kemudian dilakukan
dengan uji kualitatif DNA dengan metode
elektroforesis gel agarosa. Uji ini bertujuan
untuk mengetahui keberadaan DNA dalam
larutan contoh. Setelah itu dilanjutkan
dengan uji kuantitatif DNA dengan metode
spekrofotometri. Spektrofotometri
merupakan suatu metode analisis untuk
mengukur konsentrasi suatu senyawa
berdasarkan kemampuan senyawa tersebut
mengabsorbsi berkas sinar atau cahaya. Alat
ini terdiri dari spektrofotometer dan
fotometer. Spektrofotometer menghasilkan
sinar dari spektrum dengan panjang
gelombang tertentu, sementara fotometer
adalah pengukur intensitas cahaya yang
ditransmisikan atau diabsorbsi. Terdapat
beberapa cara yaitu spektrofotometri Vis
(visible), spektrofotometri UV (ultra violet),
Spektrofotometri UV-Vis (ultra violet –
visible) dan Spektrofotometri Infra Red
(Riyadi, 2009 dalam Fatimah, 2013).
Spektrofotometer yang digunakan
dalam praktikum uji kuantitatif DNA adalah
Spektrofotometer UV-Vis. Spektrofotometri
ini merupakan gabungan antara
spektrofotometri UV dan Visible. Sinar UV
memiliki panjang gelombang 190-380 nm.
Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh
mata kita, maka senyawa yang dapat
menyerap sinar ini terkadang merupakan
senyawa yang tidak memiliki warna. Bening
dan transparan. Oleh karena itu, sampel
tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna
dengan penambahan reagent tertentu.
Bahkan sampel dapat langsung dianalisa
meskipun tanpa preparasi. Namun perlu
diingat, sampel keruh tetap harus dibuat
jernih dengan filtrasi atau centrifugasi.
Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah
sampel harus jernih dan larut sempurna.
Tidak ada partikel koloid apalagi suspensi.
Alat ini menggunakan dua buah sumber
2
cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan
sumber cahaya visible. Meskipun untuk alat
yang lebih canggih sudah menggunakan
hanya satu sumber sinar sebagai sumber UV
dan Vis, yaitu photodiode yang dilengkapi
dengan monokromator. Untuk sistem
spektrofotometri, UV-Vis paling banyak
tersedia dan paling populer digunakan.
Kemudahan metode ini adalah dapat
digunakan baik untuk sample berwarna juga
untuk sample tak berwarna (Riyadi, 2009
dalam Fatimah, 2013).
DNA yang mengandung basa-basa
purin dan pirimidin dapat menyerap cahaya
UV. Pita ganda DNA dapat menyerap
cahaya UV pada 260 nm, sedang
kontaminan protein atau phenol dapat
menyerap cahaya pada 280 nm. Dengan
adanya perbedaan penyerapan cahaya UV
ini, sehingga kemurnian DNA dapat diukur
dengan menghitung nilai absorbansi 260 nm
dibagi dengan nilai absorbansi 280
(Å260/Å280), dan nilai kemurnian DNA
berkisar antara 1.8-2.0 (Fatchiyah, 2011).
Jika nilai melebihi 2,0 maka larutan yang
diuji masih mengandung kontaminan dari
protein membran / senyawa lainnya
sehingga kadar DNA plasmid yang didapat
belum murni. Jika kurang dari 1,8 maka
ddH2O yang diambil terlalu banyak
sedangkan DNA yang diambil terlalu sedikit
(Fatimah, 2013).
Adapun tujuan dilakukannya
praktikum ini adalah untuk dapat melakukan
uji kuantitatif terhadap DNA dan melakukan
perhitungan konsentrasi DNA.
Metode
Alat dan bahan
Alat yang digunakan dalam
praktikum ini adalah voteks, sentrifuge,
mikrotube, mikropipet, kuvet dan
spektrofotometer UV-Vis. Sedangkan bahan
yang digunakan adalah sampel hasil
ekstraksi, akuabides dan akuades.
Cara kerja
Uji kuantitatif DNA diawali dengan
hasil ekstraksi di thawing kemudian di
vorteks selama 10 detik. Selanjutnya di
sentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm
selama 2 menit. Sampel yang telah
disentrifugasi, diambil 10 mikroliter dan
ditambahkan dengan 990 mikroliter
akuabides. Hasil ekstraksi di encerkan 100
kali pada tube baru, lalu di vorteks selama
10 detik dan disentrifugasi dengan
kecepatan 12.000 rpm selama 3 menit.
Sampel dipindahkan kedalam kuvet
kemudian dilihat absorbansinya pada
spektrofotometer dengan panjang
gelombang 260 nm dan 280 nm.
Hasil dan Pembahasan
Praktikum ini bertujuan untuk
melakukan analisis kuantitatif atau kualitatif
DNA bakteri Bacillus cereus dan
Acetobacter xylinum dari hasil isolasi
dengan pemurnian DNA. Hasil isolasi yang
telah didapatkan dianalisis dengan
menggunakan spektrofotometer UV. DNA
mampu dilakukan analisis spektrofotometri
UV karena memiliki ikatan rangkap
terkonjugasi. Spektrofotometri sinar UV
digunakan untuk mengukur tingkat
kemurnian DNA hasil isolasi. Blanko atau
larutan contoh dimanfaatkan untuk
menstabilkan absorban akibat perubahan
voltase atau intensitas cahaya dari sumber
(Hayani & Fatimah 2002). Kode BC
digunakan untuk isolasi bakteri Bacillus
cereus, dan kode AX Acetobacter xylinum.
Metode pemurnian sampel (DNA) secara
kimiawi yaitu dengan cara merusak sel
kemudian diberi buffer lisis yang berisi
senyawa kimia yang dapat merusak
integritas barrier dinding sel, senyawa kimia
yang dipakai diantaranya lisosom, EDTA
(etilen diamin, tetra asetat), Tris-CL atau
deterjen, SDS (sodium dosecycle sulphate)
(Day, 2001).
Absorbansi spektrofotometri adalah
teknik yang cepat dan akurat untuk
menentukan konsentrasi sampel DNA
murni. Hal ini menjadi kurang akurat ketika
sampel DNA mengandung protein, RNA,
oligonukleotida primer atau nukleotida.
RNA, primer dan nukleotida menyerap kuat
pada 260 nm dan tidak bias dibedakan dari
DNA. Kontaminan seperti protein dapat
menyebabkan kelebihan isi DNA dalam
sampel campuran. Masalah ini dapat diatasi
dengan menggunakan metode alternatif
untuk mengukur DNA saja dalam sampel.
Dalam jurnal yang ditemukan, masalah
tersebut dapat diatasi dengan menambahkan
suatu senyawa berfluoresensi, yaitu DNA
quant 200 (Teare, 2009).

Tabel 1. Nilai Absorbansi Minimum dan Maksimum DNA

Nilai Absorbansi Kemurnian
Kelompok Sampel
λ 260 λ 280 DNA
1 1 BC 0.017 0.029 0.586
2 2 BC 0.005 0.012 0.417
3 3 BC 0.022 0.038 0.579
4 4 AX 0.007 0.023 0.304
5 5 AX 0.027 0.085 0.771
6 6 AX 0.019 0.027 0.704

3
 Penentuan panjang gelombang panjang gelombang 260 nm (Fatimah,
maksimum perlu dilakukan untuk 2013).
mengetahui dimana terjadi absorpsi
maksimum dan untuk meningkatkan proses Praktikum ini menggunakan panjang
absorpsi larutan terhadap sinar (Teare, gelombang yang sama dengan yang
2009). Panjang gelombang yang digunakan dijelaskan di atas, karena untuk mengetahui
untuk mengetahui kandungan DNA/RNA kemurnian DNA plasmid yang diisolasi dan
menggunakan spektrofotometri UV adalah memastikan tidak ada kontaminan protein
260 nm, sedangkan untuk mengetahui dalam larutan. Mengukur absorbansi pada
kandungan protein menggunakan 260 nm dan pada 280 nm dapat memberikan
spektrofotometri UV dengan panjang validasi kemurnian sampel asam nukleat
gelombang 280 nm. Tetapi ada beberapa pada rasio A260 / A280 di atas 1,8 untuk
asam nukleat yang dapat menyerap secara DNA atau 2,0 untuk RNA mengindikasikan
signifikan pada panjang gelombang 280 nm, sampel yang murni, nilai rasio yang rendah
dan beberapa protein dapat menyerap pada dari nilai 1,8 menunjukkan adanya protein
atau kontaminan lainnya (Teare, 2009).

Tabel 2. Hasil Pengukuran Konsentrasi DNA

Konsentrasi DNA (µg/ml)

0.017 x 50 x 100 = 85
0.005 x 50 x 100 = 25
0.022 x 50 x 100 = 10
0.007 x 50 x 100 = 35
0.027 x 50 x 100 = 35
0.019 x 50 x 100 = 95

Praktikum yang kami lakukan rasio
yang didapat adalah 0.586, 0.417, 0.579,
0.304, 0.771, 0.704 rasio ini kurang dari 1,8
yang berarti bahwa masih banyak terdapat
pengotor fenol dan protein. DNA yang
murni memiliki rasio 1,8, apabila rasio
kurang dari 1,8 menunjukan adanya
pengotor protein atau fenol, sedangkan
apabila rasionya lebih dari 1,8 menunjukan
adanya RNA, hal ini karena RNA juga
diserap pada panjang gelombang yang sama
yaitu λ 260 – λ 280 nm.
Nilai nisbah rasio hasil pemurnian
DNA yang dihasilkan pada praktikum ini
untuk setiap kelompok yang ditunjukan pada
Tabel. 1 kurang dari nilai 1.8. tidak ada satu
4
kelompok yang mendekati nilai dari
1.8Artinya DNA plasmid yang berhasil
diisolasi belum benar-benar murni, masih
adanya kandungan zat selain DNA,
contohnya seperti protein. Nilai absorbansi
akan berbanding lurus dengan konsentrasi,
artinya konsentrasi semakin tinggi maka
absorbansi yang dihasilkan semakin tinggi.
Terlihat pada tabel. 1, nilai konsentrasi
sebanding dengan nilai absorbansi panjang
gelombang 260, menandakan jumlah DNA
yang terkandung dan konsentrasinya. Jika
nilai konsentrasinya tinggi maka nilai
absorbansi pada panjang gelombang 260
juga tinggi misalnya pada kelompok 5 yang
plasmidnya memiliki nilai absorbansi 0.027
dan konsentasinya adalah 35 µg/µl.
Pemurnian DNA dilakukan dengan
melakukan penambahan fenol dan kloroform
yang berfungsi untuk mengendapkan protein
dengan cara melakukan sentrifugasi dan
ezimatisasi dengan enzim protease. DNA
yang dibersihkan menggunakan fenol masih
dapat bercampur dengan RNA sehingga
harus diberikan tambahan RNAse agar DNA
bersih dari RNA (Day, 2001).
Kesimpulan
Nilai rasio yang rendah dari nilai 1,8
menunjukkan adanya protein atau
kontaminan lainnya dan jika nilai
konsentrasinya tinggi maka nilai absorbansi
pada panjang gelombang 260 juga tinggi.
Daftar pustaka
Day, R.A. Underwood, A.L., 2001, Analisis
Kimia Kuantitatif, Edisi 6, Penerbit
Erlangga. Jakarta, 391.
Fatimah Nur. 2013. Uji Kuantitatif DNA.
Ditjenbun Pertanian. Bogor
Fatchiyah, 2011. Modul Pelatihan Analisis
Fingerprinting DNA Tanaman Dengan
Metode RAPD. Laboratorium Sentral Ilmu
Hayati Universitas Brawijaya, Malang.
Fatchiyah, E.L Arumingtyas., Sri Widyarti
dan Sri Rahayu., 2011. Biologi Molekular
Prinsip Dasar Analisis. PT Erlangga.
Jakarta
Teare, J.M. et al. Measurement of Nucleic
Acid Concentration Using the DyNa
QuantTM and the GenequantTM.
BioTechniques. 1997;22(6):1170-
1171.
Zubaidah, 2004. Isolasi dan karakterisasi
Gen Perbaikan DNA Baru pada
Bakteri Radioresisten
Deinococcus radiodurans.
Prosiding Seminar Nasional Sains
dan Teknik Nuklir, Bandung.