PENENTUAN KUALITAS DAN KUANTITAS ASAM NUKLEAT MENGGUNAKAN SPEKTROFOTOMETER

Oleh : Nama NIM Kelompok Rombongan Asisten : : : : : Khasanah B1J011101 4 V Yona Vebrila

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS BIOLOGI PURWOKERTO 2013

I. PENDAHULUAN A. Latar Belakang Pembelajaran tentang genetika molekuler memegang peranan dalam mengidentifikasi faktor genetik yang mempengaruhi kerentanan penyakit manusia dan hasilnya. Kemajuan teknik dalam genotip dan analisis sekuen, bersamaan dengan ketersediaan sekuen dan informasi variasi sekuen yang terbatas telah meningkatkan substansial lingkup manusia terhadap penelitian genetik. Salah satu pengembangan teknologi yang penting untuk mendapatkan genotip dengan hasil yang baik adalah kuantifikasi DNA. Keakuratan dan kuantifikasi DNA yang tepat sangat diperlukan untuk mendapatkan hasil genotip yang efisien. Sampai saat ini, spektrofotometri telah menjadi metode tradisional untuk kuantifikasi DNA dalam biologi molekuler (Haque, 2003). Seiring makin bertambahnya pengetahuan kita tentang biologi molekuler, semakin menjadi jelas bahwa perkembangan dan pemanfaatan dalam bidang ini menimbulkan revolusi yang besar dalam diagnosis, pencegahan dan pengobatan penyakit. Pemeriksaan untuk variasi urutan DNA lebih sensitif dibandingkan dengan banyak teknik lain (seperti pemeriksaan enzim) dan memungkinkan kita mengenal penyakit lebih dini. Oleh karena itu, kemungkinan besar mengenal stadium yang lebih dapat diterapi. Pemeriksaan DNA juga dapat digunakan untuk mengidentifikasi pembawa penyakit yang diwariskan sehingga pembawa dapat menerima penyuluhan yang sesuai. Karena variasi genetik sedemikian khusus, sidik jari DNA (analisis perbedaan urutan DNA) dapat digunakan untuk menentukan hubungan keluarga atau untuk membantu mengidentifikasi pelaku kejahatan (Dawn, 2000). Perhitungan asam nukleat sangat penting sebagai prosedur dalam banyak penelitian biologi molekuler. Namun, penentuan konsentrasi DNA atau RNA yang akurat bisa menjadi sulit, terutama ketika kemurnian sampel tidak pasti. Di banyak kasus, pendekatan yang paling cepat dan akurat untuk menentukan konsentrasi asam nukleat yang relatif murni dan protein adalah dengan membaca absorbansi pada spektrofotometri. Jumlah cahaya yang diserap oleh sampel berbanding lurus dengan konsentrasi protein atau asam nukleat dalam sampel. Konversi absorbansi dalam pembacaan konsentrasi didasarkan pada hukum Lambert-Beer (Teare, 1997).

Menurut Day (2001), spektrofotometri adalah suatu metode analisis untuk mengukur konsentrasi senyawa berdasarkan kemampuan senyawa tersebut mengabsorbsi berkas sinar atau cahaya. Alat ini terdiri dari spektrofotometer dan fotometer. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu, sementara fotometer adalah pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi. Spektrofotometer dilengkapi sumber cahaya atau gelombang elektromagnetik, baik cahaya UV (ultra violet) maupun cahaya nampak (visible). Komponen utama dari alat ini adalah sumber cahaya, pengatur intensitas, monokromator, kuvet, detektor, penguat arus dan indikator atau layar (Riyadi, 2009).

B. Tujuan Tujuan dari praktikum penentuan kualitas dan kuantitas asam nukleat menggunakan spektrofotometer kali ini adalah untuk melakukan pengukuran kualitas dan kuantitas DNA hasil isolasi.

II. MATERI DAN METODE A. Materi Alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah spektrofotometer UVVIS, kuvet, mikropipet beserta tip dan tabung reaksi. Bahan-bahan yang digunakan adalah DNA bakteri E-coli dan DNA buah, akuades steril, larutan blanko, dan tissue.

B. Metode Metode yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah : 1. 2. Mesin spektrofotometer dinyalakan dan ditunggu 15 menit supaya stabil. Akuades dimasukkan ke dalam kuvet, kemudian diukur absorbansinya sebagai nilai absorbansi blanko. Pengukuran nilai absorbansi blanko ini dilakukan setiap sebelum pengukuran nilai absorbansi sampel, kecuali pada panjang gelombang 230 nm. 3. Sebanyak 3 L DNA hasil isolasi dilarutkan dalam akuades hingga 3000 L, kemudian diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 230 nm, 260 nm, 280 nm dan 320 nm. 4. Konsentrasi DNA dan kemurnian DNA dari protein atau RNA dan karbohidrat atau kemikalia dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut : Konsentrasi DNA = 260 x 50 x faktor pengenceran Kemurnian DNA : Protein atau RNA = 260 230 Karbohidrat atau kemikalia = 260 230 5. Hasil perhitungan dimasukkan ke dalam tabel.

III.

HASIL DAN PEMBAHASAN A. Hasil

Tabel 1. Perhitungan Konsentrasi DNA No 1 2 3 4 5 6. Sampel Mangga Pepaya Naga Strawberry Alpukat E.coli 230 A[S]-A[B] 0,009 0,031 0,020 0,339 0,147 -0,046 260 A[S]-A[B] 0,009 -0,002 0,001 0,008 0,112 -0,014 280 A[S]-A[B] 0,015 0,007 0,016 -0,005 -0,108 -0,006 320 A[S]-A[B] 0,009 -0,004 0,002 -0,008 0,083 -0,013

Keterangan: A[S] = Absorbansi sampel DNA A[B] = Absorbansi blanko Tabel 2. Perhitungan Konsentrasi DNA terhadap Konsentrasi Protein dan Karbohidrat/Kemikalia No 1 2 3 4 5 6 Interpretasi : 230 = 2-2,2 : DNA murni < 2 : kemikalia/karbohidrat >2,2 : blanko tidak sesuai 280 = 1,8 : DNA murni Panjang Gelombang () (nm) 260 nm 450 1550 1000 400 7350 -700 260/280 nm 0,6 -0,285 0,0625 -1,6 -1,037 2,33 260/230 nm 1 -0,064 0,05 0,023 0,761 0,3

< 1,8 : protein > 1,8 : RNA Perhitungan : 1. DNA hasil isolasi dari buah strawberry Konsentrasi DNA : DNA ng/ = A260 x 50 ng/ x F (faktor pengenceran)

= 0,008 x 50 x 1.000 = 400 ng/ Konsentrasi DNA terhadap kontaminasi protein atau RNA: 260/280 nm = 0,008 = -1,6 ng/ -0,005 Konsentrasi DNA terhadap kontaminasi karbohidrat atau kemikalia : 260/230 nm = 0,008 = 0,023 ng/ 0,339

2. DNA hasil isolasi dari bakteri E. coli Konsentrasi DNA : DNA ng/ = A260 x 50 ng/ x F (faktor pengenceran)

= -0,014 x 50 x 1.000 = -700 ng/ Konsentrasi DNA terhadap kontaminasi protein atau RNA: 260/280 nm = -0,014 = 2,33 ng/ -0,006 Konsentrasi DNA terhadap kontaminasi karbohidrat atau kemikalia : 260/230 nm = -0,014 = 0,3 ng/ -0,046

Keberadaan DNA dalam suatu organisme dapat diketahui dengan 2 cara, yaitu secara kualitatif dengan metode elektroforesis gel agarosa dan secara kuantitatif dengan metode spektrofotometri. Uji kuantitatif DNA adalah analisis untuk menentukan kandungan atau jumlah DNA yang terdapat dalam suatu zat atau komponen zat yang sebelumnya telah diketahui keberadaan DNA plasmidnya dalam larutan contoh dengan cara uji kualitatif (Larasati, 2011). Spektrofotometri merupakan suatu metode analisis untuk mengukur konsentrasi suatu senyawa berdasarkan kemampuan senyawa tersebut mengabsorbsi berkas sinar atau cahaya. Spektrofotometri terdiri dari spektrofotometer dan fotometer. Spektrofotometer yaitu suatu alat yang digunakan untuk menentukan suatu senyawa baik secara kuantitatif maupun kualitatif dengan mengukur transmitan ataupun absorban dari suatu cuplikan sebagai fungsi dari konsentrasi. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu. Suatu spektrofotometer terusun dari sumber spektrum tampak yang kontinyu, monokromator, sel pengabsorbsi untuk larutan sampel atau blanko dan sutu alat untuk mengukur perbedaan absorbsi antara sampel dan blanko ataupun pembanding. Fotometer yaitu alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi (Khopkar, 2003). Kekurangan dari spektrofotometri ini yaitu hanya terjadi bila terjadi perpindahan elektron dari tingkat energi yang rendah ke tingkat energi yang lebih tinggi. Perpindahan elektron ini tidak diikuti oleh perubahan arah spin, hal ini dikenal dengan sebutan tereksitasi singlet. Jika tidak terjadi perpindahan elektron, maka alat ini tidak akan berfungsi. Adakalanya beberapa zat harus diubah dulu menjadi senyawa berwarna sebelum dianalisa, kurang teliti dalam analisis kualitatif. Hal tersebut disebabkan karena pita-pita absorbsi yang diperoleh melebar, dengan demikian kurang khusus atau terbatas pemakaiannya. Kelebihan dari

spektrofotometri ini yaitu dapat digunakan secara luas untuk banyak zat organik dan anorganik, memiliki kepekaan yang tinggi, keselektifannya sangat baik pada pemilihan kondisi yang tepat dapat dicari panjang gelombang untuk zat yang dicari, memiliki tingkat ketelitian yang tinggi dengan kesalahan relatif sebesar 1 % - 3 %, tetapi kesalahan ini dapat diperkecil lagi dan dapat dilakukan dengan cepat dan tepat (Triyati, 1985).

Berdasarkan sumber cahaya dan panjang gelombangnya, spektrofotometri dibedakan menjadi 4 macam, yaitu : 1. Spektrofotometri Vis (Visible) Spektrofotometri visible menggunakan cahaya tampak (visible) sebagai sumber sinar atau energi. Sebagai sumber sinar dapat digunakan lampu tungsten halogen. Lampu tersebut terbuat dari tabung kuarsa yang berisi filamen tungsten dan sejumlah kecil iodin. Lampu ini mirip dengan lampu yang terdapat dalam perumahan dan perkantoran. Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia. Panjang gelombang sinar tampak adalah 380 nm sampai 780 nm. Sehingga semua sinar yang dapat dilihat oleh mata oleh mata baik itu putih, merah, biru, hijau, ataupun lainnya maka sinar tersebut termasuk ke dalam sinar tampak (visible). Syarat pengukuran dengan spektrofotometri visible yaitu sampel dalam larutan menyerap sinar tampak (380780 nm), larutan sampel harus bening dan berwarna, pelarut tidak menyerap sinar tampak (Riyadi dan Wahyu, 2009). 2. Spektrofotometri UV (Ultra Violet) Spektrofotometri UV menggunakan cahaya UV sebagai sumber sinar atau energi. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm. Sebagai sumber sinar dapat digunakan lampu deuterium. Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata kita, maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna, bening dan transparan. Oleh karena itu, sampel tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna dengan penambahan reagen tertentu. Bahkan sampel dapat langsung dianalisa meskipun tanpa preparasi. Namun perlu diingat, sampel keruh tetap harus dibuat jernih dengan filtrasi atau sentrifugasi (Riyadi dan Wahyu, 2009). 3. Spektrofotometri UV-Vis (Ultra Violet-Visible) Spektrofotometri UV-Vis menggunakan kombinasi antara cahaya UV dan cahaya tampak sebagai sumber sinar atau energi. Untuk sistem spektrofotometri, UV-Vis paling banyak tersedia dan paling populer digunakan. Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik untuk sampel berwarna juga untuk sampel tak berwarna (Riyadi dan Wahyu, 2009). DNA yang mengandung basa-basa purin

dan pirimidin dapat menyerap cahaya UV. Pita ganda DNA dapat menyerap cahaya UV pada 260 nm, sedang kontaminan protein atau phenol dapat menyerap cahaya pada 280 nm. Dengan adanya perbedaan penyerapan cahaya UV ini, kemurnian DNA dapat diukur dengan menghitung nilai absorbansi 260 nm dibagi dengan nilai absorbansi 280 (A260/A280) (Fatchiyah, 2011). Spektroskopi ultraviolet-tampak (UV-1601 pc shimadzu spektrofotometer) atau spektrofotometri Ultraviolet-Visible (UV-Vis) mengacu pada spektroskopi serapan di wilayah spektral UV-Visible. Spektrofotometri ini menggunakan cahaya dalam yang terlihat dan dengan rentang yang berdekatan (dekat-UV dan dekat inframerah atau NIR). Kisaran penyerapan dapat terlihat secara langsung dari warna yang ditimbulkan bahan kimia yang terlibat. Di daerah spektrum elektromagnetik ini molekul mengalami transisi elektronik (Saxena et al., 2010). 4. Spektrofotometri Infra Red Spektrofotometri Infra Red atau infra merah merupakan suatu metode yang mengamati interaksi molekul dengan radiasi elektromagnetik yang berada pada daerah panjang gelombang 0,75-1.000 m atau pada Bilangan Gelombang 13.000-10 cm-1. Radiasi infra merah dihasilkan dari pemanasan suatu sumber radiasi dengan listrik sampai suhu antara 1500 dan 2000 k. Sumber radiasi yang biasa digunakan berupa Nemst Glower, Globar, dan kawat nikhrom. Pengukuran energi terserap direkam sebagai transmitan sebagai fungsi panjang gelombang. Komponen spektrofotometer infra merah terdiri dari lima bagian pokok, yaitu sumber radiasi, wadah sampel, monokromator, detektor dan rekoder

(Sastrohamidjojo, 1992). Kualitas DNA hasil isolasi dapat dilihat dari tingkat kemurniannya. Jika DNA hasil isolasi memilki tingkat kemurnian yang tinggi, bebas dari segala bentuk kontaminan seperti protein, RNA, karbohidrat atau bahan kemikalia, menandakan bahwa DNA hasil isolasi tersebut memiliki kuailtas yang baik. Kuantitas DNA hasil isolasi dapat dilihat dari konsentrasinya. Jika DNA hasil isolasi memiliki konsentrasi yang tinggi, maka DNA hasil isolasi tersebut memilki kuantitas yang tinggi pula. Kualitas dan kuantitas DNA tersebut ditentukan oleh beberapa faktor, yaitu

kemurnian DNA, panjang DNA, kemampuan dipotong oleh sembarang enzim, tidak mengalami modifikasi selama proses isolasi berlangsung. Oleh sebab itu, terdapat sejumlah teknik isolasi DNA, yang disesuaikan untuk berbagai maksud penggunaan dan kualitas serta kuantitas minimum yang ingin dicapai (Ardiansyah, 2012).