Analisis Kuantitatif DNA Spektrofotometri UV-Vis

Pengertian Spektrofotometri UV-Vis

Spektrofotometer Uv-Vis merupakan spektrofotometer yang digunakan untuk

pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak. Semua metode
spektrofotometri berdasarkan pada serapan sinar oleh senyawa yang ditentukan,
sinar yang digunakan adalah sinar yang semonokromatis mungkin.
Spektrofotometer UV-Vis (Ultra Violet-Visible) adalah salah satu dari sekian
banyak instrumen yang biasa digunakan dalam menganalisa suatu senyawa kimia.
Spektrofotometer umum digunakan karena kemampuannya dalam menganalisa
begitu banyak senyawa kimia serta kepraktisannya dalam hal preparasi sampel
apabila dibandingkan dengan beberapa metode analisa. Spektrofotometri UV/Vis
melibatkan energi elektronik yang cukup besar saat analisis, sehingga
spetrofotometer UV/Vis lebih banyak dipakai untuk analisis kuantitatif dibanding
kualitatif.

Spektrofotometri merupakan suatu metode analisis untuk mengukur konsentrasi

suatu senyawa berdasarkan kemampuan senyawa tersebut mengabsorbsi berkas
sinar atau cahaya dengan panjang gelombang tertentu (Riyadi 2009).
Spektrofotometri yang digunakan pada uji kuantitatif DNA penelitian ini adalah
spektrofotometri UV-Vis (Ultraviolet Visible). DNA yang mengandung basa-basa
purin dan pirimidin dapat menyerap cahaya UV.

Uji Kuantitatif Spektrofotometri UV-Vis

Uji kuantitatif DNA dengan spektrofotometri UV-Vis, DNA murni dapat

menyerap cahaya ultraviolet karena keberadaan basa-basa purin dan pirimidin.
Pita ganda DNA dapat menyerap cahaya UV pada λ 260 nm, sedang kontaminan
protein atau phenol akan menyerap cahaya pada λ 280 nm. Sehingga kemurnian
DNA dapat dukur dengan menghitung nilai absorbansi λ260 nm dibagi dengan
nilai absorbansi λ 280 (Å260/Å280), dan nilai kemurnian DNA berkisar antara
1.8-2.0.
Kemurnian dari DNA yang diisolasi, diuji menggunakan spektrofotometer UV-
Vis. Sebelumnya, dilakukan pengenceran sampel sebanyak 100 kali. Selanjutnya
diuji menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang λ 260 dan λ 280,
dan dibaca absorbansinya. Lebih lanjut dilakukan perhitungan kemurnian DNA
dengan menggunakan rumus :

DNA yang berhasil diisolasi, diamplifikasi menggunakan Polymerase Chain

Reaction (PCR) dan dianalisis jenis virus dengan menggunakan Next Generation
Sequencing (NGS).

Hasil Uji DNA Dengan Spektrofotometer UV-Vis

Uji ini dilakukan menggunakan spektrofotometer, untuk melihat kemurnian DNA

hasil isolasi. Berdasarkan hasil perhitungan kemurnian DNA diperoleh nilai
kemurnian DNA 1,05. Sambrook (1989) menyatakan bahwa Pita ganda DNA
dapat menyerap cahaya UV pada λ 260 nm, sedang kontaminan protein atau
phenol dapat menyerap cahaya pada λ 280 nm. Nilai kemurnian DNA berkisar
antara 1,8 - 2,0 (Fatchiyah et al. 2011). Menurut Sambrook (1989), DNA dengan
rasio pada kisaran angka tersebut telah memenuhi persyaratan kemurnian yang
dibutuhkan dalam analisis molekuler.

Hasil pengecekan kualitas dan kuantitas dengan spektrofotometer menunjukkan

bahwa DNA memiliki kualitas dan kuantitas DNA yang baik dengan konsentrasi
DNA yang diperoleh mempunyai kisaran antara 668,80 - 5.031,39 ng/ul. Jumlah
DNA ini relatif cukup banyak dan dapat digunakan untuk analisis molekuler lebih
lanjut. Sementara itu, rasio kemurnian DNA yang diperoleh juga berada pada
kisaran angka dimana DNA dikatakan murni yaitu antara 1,8 - 1,9. Seperti
dijelaskan dalam Sambrook et al. (1989) bahwa DNA dikatakan murni apabila
mempunyai angka A260/A280 dalam kisaran 1,8 - 2,0.
 Tabel Hasil Uji Kemurnian DNA

Berdasarkan data (Tabel 4) menunjukkan hasil pengukuran kualitas DNA secara

kuantitatif yang meliputi konsentrasi dan kemurnian DNA. Dari seluruh sampel
yang dihitung konsentrasi dan kemurniannya, secara umum konsentrasi DNA
hasil isolasi memiliki konsentrasi yang relatif besar dan tidak seragam.
Konsentrasi terendah DNA terjadi pada aksesi Bolivar yaitu sebesar 453,8 ng/µl
sedangkan konsentrasi tertinggi DNA terjadi pada aksesi D76-8070 sebesar
2524,3 ng/µl.

Pengukuran kuantitas DNA dengan menggunakan menggunakan alat

spektofotometer (Gambar 4). Kemurnian DNA diperoleh dari perbandingan
absorban A260/280 pada sampel DNA. Nilai 260 nm merupakan nilai maksimal
DNA dapat menyerap cahaya, nilai tersebut dapat digunakan untuk
memperkirakan konsentrasi DNA, sedangkan nilai 280 merupakan nilai maksimal
residu protein dapat menyerap cahaya.
Berdasarkan hasil kemurnian DNA (Tabel 4) menunjukkan keseluruhan sampel
yang diuji memiliki nilai rasio 2,1. Sementara nilai kemurnian DNA berkisar
antara 1.8-2.0 (Sambrook et al., 1989). Nilai kemurnian DNA yang tinggi diduga
karena adanya sisa-sisa etanol pada saat pengeringan yang tidak sempurna dan
adanya sisa kandungan metabolit sekunder pada organ tanaman yang diekstrak.
Meskipun nilai kemurnian DNA diatas 2,0, PCR tetap dilanjutkan selama
memiliki kurva kemurnian yang baik.

Banyak sedikitnya DNA yang dihasilkan dipengaruhi oleh beberapa faktor pada
saat ekstraksi DNA dan kondisi sampel. Menurut Komalasari (2009) menyatakan
bahwa konsentrasi hasil ekstraksi pada waktu ekstraksi dan komposisi
penambahan lisis buffer. Faktor kecepatan ekstraksi merupakan faktor paling
berpengaruh karena pada tahap lisis sel dan presipitasi pengambilan supernatant
harus dilakukan persampel, sehingga beberapa sampel terjadi pengendapan DNA.

Hal-Hal Yang Harus Diperhatikan

a) Larutan yang dianalisis merupakan larutan berwarna

Apabila larutan yang akan dianalisis merupakan larutan yang tidak
berwarna, maka larutan tersebut harus diubah terlebih dahulu menjadi
larutan yang berwarna. Kecuali apabila diukur dengan menggunakan
lampu UV.
b) Panjang gelombang maksimum
Panjang gelombang yang digunakan adalah panjang gelombang yang
mempunyai absorbansi maksimal.
c) Kalibrasi panjang gelombang dan absorban
Spektrofotometer digunakan untuk mengukur intensitas cahaya yang
dipancarkan dan cahaya yang diabsorbsi. Hal ini bergantung pada
spektrum elektromagnetik yang diabsorb oleh benda. Tiap media akan
menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu tergantung pada
senyawa yang terbentuk.
 Kelebihan dan Kekurangan Spektrofotometer UV-VIS

a) Kelebihan Spektrofotometri UV-Vis

 Panjang gelombang dari sinar putih dapat lebih terseleksi
 Caranya sederhana
 Dapat menganalisa larutan dengan konsentrasi yang sangat kecil
b) Kekurangan Spektrofotometri UV-Vis
 Absorbsi dipengaruhi oleh pH larutan, suhu dan adanya zat
pengganggu dan kebersihan dari kuvet
 Hanya dapat dipakai pada daerah ultra violet yang panjang gelombang
>185 nm
 Pemakaian hanya pada gugus fungsional yang mengandung elektron
valensi dengan energy eksitasi rendah
 Sinar yang dipakai harus monokromatis