Analisis Kuantitas dan Kualitas DNA

Pengukuran DNA dapat dilakukan dengan 2 alat yakni

spektrofotometer dan elektroforesis. Spektrofotometer merupakan alat yang
digunakan untuk mengukur enerji secara relatif, jika enerji tersebut
ditransimisikan, direfleksikan dan diemisikan sebagai fungsi dari panjang
gelombang (Khopkar, 1990). Alat spektrofotometer yang digunakan ketika
analisis kuantitas DNA adalah spektronano. Spektrofotometer ini sudah
dirancang khusus untuk melihat kuantitas DNA (ng/μl) dan kemurnian DNA
tanpa harus melalui proses pengenceran. Prinsip spektrofotometer nano
adalah pita ganda DNA murni akan menyerap cahaya UV pada panjang
gelombang 260 nm, sedangkan kontaminan berupa protein dan fenol akan
menyerap cahaya pada panjang gelombang 280 nm (Nugroho dan Rahayu,
2016).
Kemurnian DNA dapat diukur dari rasio absorbansi pada panjang
gelombang 260 nm dan 280 nm, kemurnian DNA yang baik adalah 1,8-2,0.
Kemurnian DNA dibawah 1,8 menunjukkan bahwa DNA yang diisolasi
terdapat kontaminan berupa protein atau fenol dalam hasil isolasi DNA.
Kemurnian DNA di atas 2,0 menunjukkan bahwa DNA yang diisolasi
terdapat kontaminan RNA pada hasil isolasi DNA (Khosravinia dkk., 2007).
Kuantitas DNA dapat juga dikatakan sebagai konsentrasi total DNA
yang terkandung dalam sampel yang sudah diisolasi (Khosravinia dkk.,
2007). Semakin besar hasil pengukuran kuantitas, maka semakin banyak
DNA yang diperoleh dari hasil ekstraksi sampel. Pengukuran kuantitas DNA
dengan spektrofotometer nanodrop berdasarkan absorbansi pada panjang
gelombang 260 nm (Nugroho dan Rahayu, 2016). Menurut Sutrisno dkk.
(2013), pengukuran kuantitas DNA dapat dilakukan dengan spektrofotometer
UV-Vis menggunakan perhitungan dengan RNA/DNA calculator, dengan
rumus sebagai berikut:
[DNA] = Å260 × 50 × Faktor pengenceran
Keterangan :
Å260 : absorbansi sampel DNA pada panjang gelombang 260 nm.
50 : larutan dengan nilai absorbansi 1.0 sebanding dengan 50 ug
untai ganda DNA per ml (dsDNA)
Elektroforesis adalah suatu teknik yang mengukur laju perpindahan
atau pergerakan partikel-partikel bermuatan dalam suatu medan listrik.
Prinsip dasar elektroforesis adalah bahwa tiap molekul biologis memiliki
muatan listrik, yang besarnya bervariasi tergantung pada jenis/macam
molekul, pH dan komposisi medium. Molekul yang bermuatan listrik
tersebut, jika ditempatkan pada suatu medan listrik, akan bergerak kearah
muatan yang berbeda (Klug dan Cummings, 1994).
Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat makromolekul yang
bermuatan listrik ditempatkan pada medium berisi tenaga listrik. Molekulmolekul
tersebut akan bermigrasi menuju kutub positif atau kutub negatif
berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya. Molekul-molekul yang
bermuatan negatif (anion) akan bergerak menuju kutub positif (anoda),
sedangkan molekul-molekul yang bermuatan positif (kation) akan bergerak
menuju kutub negatif (katoda) (Klug dan Cummings, 1994).
Elektroforesis dibedakan menjadi 2 tipe yakni elektroforesis vertikal
dan horizontal. Elektroforesis vertikal digunakan untuk analisis pita DNA
dan protein. Elektroforesis horizontal digunakan untuk analisis pita DNA
dan RNA (Westermeier, 2005). Elektroforesis vertikal umumnya dilakukan
menggunakan gel akrilamida, sedangkan elektroforesis vertikal dilakukan
menggunakan gel agarose (Maftuchah dkk., 2014). Ada tiga jenis gel yang
dapat digunakan dalam elektroforesis dna yaitu gel poliakrilamida denaturasi,
gel alkalin agarosa dan gel agarose formaldehid (Davis dkk., 1994).
Gel agarose adalah suatu bahan semi padat berupa polisakarida yang
diekstraksi dari rumput laut. Penggunaan gel agarose dilakukan dengan
melarutkannya menggunakan buffer, yang dibantu melalui pemanasan
(Yuwono, 2008). Karakteristik gel agarose yang umumnya digunakan adalah
ukuran pori 150 nm dengan konsentrasi 1% (Westemeier, 2005). Laju
migrasi DNA dapat dipengaruhi oleh 2 faktor yakni ukuran molekul DNA
dan konsentrasi agarose (Ardhana, 2011).
Tris-Acetate-EDTA (TAE) buffer merupakan larutan buffer sebagai
pelarut gel agorose dalam proses elektroforesis. TAE buffer berfungsi
sebagai penghantar listrik sehingga fragmen DNA dapat bermigrasi di dalam
gel agarose. Penyimpanan optimum TAE buffer ini pada suhu 4-25oC
(Ardhana, 2011). Red safe DNA gel stain merupakan alternatif pewarna gel
agarose pengganti penggunaan pewarna ethidium bromide yang dapat
digunakan untuk DNA atau RNA. dengan penyimpanan suhu ruang. Pewarna
red safe memiliki tingkat sensitivitas yang tinggi seperti ethidium bromide,
namun pewarna ini tidak bersifat karsinogenik (Intron Biotechnology, 2017).
Molekul DNA yang berukuran kecil akan lebih mudah melalui matriks
dibandingkan dengan molekul DNA yang berukuran besar, sehingga molekul
DNA yang berukuran kecil memiliki laju migrasi yang lebih cepat.
Konsentrasi agarose digunakan untuk menentukan besarnya matriks yang
dapat memisahkan fragmen DNA. Semakin rendah konsentrasi agarose yang
digunakan, maka akan semakin rendah matriks gel agarose, dan fragmen
DNA akan terpisah semakin jauh. Penggunaan konsentrasi agarose dalam
menentukan ukuran molekul DNA yang akan dipisahkan, dapat dilihat pada
Tabel 2 (Ardhana, 2011).
Tabel 2. Konsentrasi Agarose
Tabel 2. Konsentrasi Agarose dan Ukuran Molekul DNA (Ardhana, 2011).
No.
Konsentrasi Gel Agarose
(%)
Efisiensi range pemisahan pada DNA
liner (kb)
1. 0,3 60 – 5
2. 0,6 20 – 1
3. 0,7 10 – 0,8
4. 0,9 7 – 0,5
5. 1,2 6 – 0,4
6. 1,5 4 – 0,2
7. 2,0 3 – 0,1
Visualisasi DNA bertujuan untuk menganalisis kualitas dan kuantitas
DNA sampel (Amersham, 1999). Gel Doc (Gel documentation) merupakan
alat visualisasi digunakan untuk mendeteksi pita-pita DNA hasil running
elektroforesis menggunakan UV transiluminator. Prinsip kerja dari Gel Doc
adalah sinar UV yang dipancarkan akan memendarkan pewarna gel agarose
yang menempel pada DNA, sehingga visualisasi pita-pita DNA dapat terlihat.

Larutan DNA dapat digunakan sebagai sampel cetakan PCR apabila DNA memiliki nilai kemurnian.
Nilai kemurnian DNA dapat ditentukan menggunakan perbandingan Optical Density (OD) larutan
pada berbagai macam gelombang dengan menggunakan spektofotometer. Tingkat kemurnian DNA
dikatakan baik jika nilai rasio Optical Density (OD) 260/280 nm yang diperoleh antara 1.8-2.0
(Sambrook et al., 1989). Nicholl (1996) menyatakan rasio OD 260/280 nm 1.8 mengindikasikan DNA
murni, sedangkan rasio OD 260/280 nm kurang dari 1.8 kemungkinan DNA terkontaminasi protein.
Menurut Fatchiyah et al (2009) tingkat kemurnian d iatas 2,0 menunjukkan bahwa DNA tidak murni
disebabkan juga oleh adanya sisa-sisa etanol pada saat pengeringan yang tidak sempurna, faktor
lain yang menyebabkan DNA tidak murni adalah adanya sisa kandungan metabolit sekunder pada
organ tanaman yang diekstrak

Kemurnian DNA diperoleh dari perbandingan absorban A260/280 pada sampel DNA. Nilai 260 nm
merupakan nilai maksimal DNA dapat menyerap cahaya, nilai tersebut dapat digunakan untuk
memperkirakan konsentrasi DNA, sedangkan nilai 280 merupakan nilai maksimal residu protein
dapat menyerap cahaya.

nilai kemurnian DNA berkisar antara 1.8-2.0 (Sambrook et al., 1989). Nilai kemurnian DNA yang
tinggi diduga karena adanya sisa-sisa etanol pada saat pengeringan yang tidak sempurna dan
adanya sisa kandungan metabolit sekunder pada organ tanaman yang diekstrak. Meskipun nilai
kemurnian DNA diatas 2,0, PCR tetap dilanjutkan selama memiliki kurva kemurnian yang baik.

Ekstraksi dan pemurnian DNA pada

dasarnya merupakan serangkaian proses
pemisahan DNA dari komponen-komponen
sel lainnya. Ekstraksi untuk memperoleh DNA
yang berkualitas tinggi merupakan kaidah
dasar yang harus dipenuhi dalam analisis
molekuler dan merupakan salah satu faktor
keberhasilan dalam amplifikasi DNA yang
akan digunakan dalam analisis karakter
genetika.5-7
Ekstraksi yang baik didukung oleh hasil
kuantitas DNA ekstrak yang diperoleh.
Pengukuran kuantitas DNA dilakukan dengan
metode spektrofotometri menggunakan
spektrofotometer pada panjang gelombang
(λ) 260 dan 280 nm.8 Kemurnian DNA
ditentukan dengan menghitung rasio
absorbansi pada A260 dengan A280 (Ratio
A260:A280). Molekul DNA dikatakan murni
jika rasio absorbansinya berkisar antara 1,8 –
9 2,0.

Informasi mengenai konsentrasi dan

kemurnian DNA sangat diperlukan untuk
mengetahui derajat kontaminasi suatu
sampel dan apakah sampel tersebut baik
untuk digunakan pada tahap selanjutnya. Oleh
karena itu, dilakukan pengukuran terhadap
kuantitas baik konsentrasi maupun
kemurnian DNA genom.

eknik Asam nukleat adalah pelajaran favorit saya waktu saya kuliah. Namun ada hal yang
membuat saya tidak nyaman dalam mengukur konsentrasi DNA. Dalam metode lama, kita
harus mengencerkan DNA telah diperoleh dari ekstraksi ke dalam volume yang lebih besar.
Alasan kita harus melakukannya adalah volume DNA kita dapatkan dari ekstraksi sangat kurang
dari volume yang diperlukan untuk kuvet dalam spektrofotometer UV konvensional.

Biasanya kita mengencerkan DNA menjadi 40-50 kali lipat lebih encer. Setelah itu kita
mengukur absorbansi DNA yang sudah diencerkan dalam beberapa panjang gelombang UV
seperti 230, 260 dan 280 nm. Kita juga mengukur absorbansi blangko untuk koreksi /
normalisasi. Dengan koefisien khusus untuk untai ganda asam nukleat (DNA) 50 ug/ml,
berkorelasi dengan 1 absorbansi, kita siap untuk menghitung konsentrasi DNA.

Berdasarkan Hukum Lambert-Beer, A = ε. d. c, di mana “A” adalah absorbansi, koefisien zat “ε”,
dan “d” adalah panjang jalan tempuh sinar dalam kuvet di spektrofotometer dan “c” adalah
konsentrasi. Semua data yang diperoleh dikurangi oleh absorbansi blangko, maka absorbansi
bersih dari pengukuran di panjang gelombang 260 nm dikalikan terhadap 50 ug/ml.

Kita belum tahu konsentrasi DNA belum sebelum menempatkan faktor pengenceran ke dalam
perhitungan. Setelah faktor pengenceran dihitung, akhirnya kita mendapatkan konsentrasi
DNA. Tahapan pengukuran konsentrasi DNA menggunakan metode lama ini dari mengurangi
volume sampel kita, kita juga tidak diperbolehkan untuk melupakan label apa kuvet berisi
sampel apa.

Catatan faktor pengenceran harus tetap aman karena sangat penting untuk hasil akhir. Cara ini
berarti banyak pipetting, memakai habis tips mikropipet, juga membutuhkan banyak tabung
microvolume. Satu hal yang penting juga dikonsumsi adalah waktu dan tenaga.

Setelah konsentrasi DNA yang diperoleh, kita perlu menghitung beberapa parameter
kemurnian, pertama 260/230 nm sebagai kemurnian DNA/Asam nukleat terhadap Phenol dan
260/280 nm sebagai kemurnian DNA/Asam nukleat terhadap Protein. Kualitas DNA yang baik
memiliki nilai 260/230 pada 1,8 dan 260/280 nm pada 2,0. Itu adalah kondisi ideal.

Mengenai jumlah pengukuran DNA atau kuantifikasi atas, dapat Anda lihat itu membawa kita
terlalu banyak sumber daya dan energi, dapat Anda bayangkan jika sampel Anda cukup
banyak, katakanlah 50 sampel/hari, mengukur konsentrasi DNA dengan cara lama dapat
mengambil setengah hari Anda. Protokol yang sama juga dapat diterapkan untuk RNA.

Untunglah ada orang-orang kreatif di dunia ini menangkap rasa sakit yang diderita oleh peneliti
dalam mengukur DNA/asam nukleat

Sebenarnya bukan “baru” karena metode ini ditemukan pada tahun 2000. Setidaknya
berdirinya metode ini menetapkan era baru kuantifikasi asam nukleat. Jika saya diringkas dari
masalah yang disebabkan oleh cara lama asam nukleat kuantifikasi, ada dua masalah besar,
pertama perlu volume yang relatif besar sampel agar sesuai volume kuvet, sementara sampel
bisa sangat langka untuk didapatkan. Masalah kedua adalah pengenceran. Pengenceran itu
melelahkan. Ketiga adalah membersihkan cuvette adalah memakan waktu. Keempat adalah
perhitungan dapat menjadi rumit dan rawan kesalahan.
Dalam mikro spektrofotometri Volume UV, yang harus kita lakukan adalah meletakkan sampel
volume mikro (1-2 mikroliter) ke tempat yang disebut “pedestal”. Karena alas ini terbuat dari
stainless steel hidrofobik, cairan akan membentuk bulat “bola”. Langkah selanjutnya adalah
menarik ke bawah disebut “lengan”. Lengan akan terhubung dengan alas melalui cairan Volume
mikro membentuk kolom. Cahaya akan disinarkan dari atas lengan melalui kolom cairan ini.
Jarak maksimum adalah 1 milimeter.

Absorbansi dapat dihitung dari cahaya yang ditransmisikan dan cahaya yang terdeteksi dalam
beberapa detik. Semua parameter standar (konsentrasi nukleat, rasio kemurnian) secara
otomatis dihitung menggunakan software juga dalam beberapa detik. Perangkat lunak ini juga
menunjukkan grafik pengukuran berbagai absorbansi dari panjang gelombang 190-340 nm.
Dengan metode ini, semua masalah dalam metode lama diselesaikan, dan bahkan lebih,
karakteristik asam nukleat dimurnikan baik dapat diketahui dari grafik.

Perpindahan dari satu sampel ke yang lain, yang harus kita lakukan hanyalah menghapus alas
menggunakan kertas tisu laboratorium yang sesuai. Hal ini sangat sederhana dan tidak
memakan waktu. Jika Anda peduli dengan kontaminasi sampel, itu terjadi namunsecara
statistik tidak signifikan. Hanya memberikan ddH2O tambahan antara pengukuran sampel
untuk membuat Anda merasa nyaman, bahkan tidak wajib dan hanya akan memperlambat
kerja Anda.

Semuanya itu dilakukan hanya 3-5 detik! Hanya dengan menempatkan sampel Anda dalam
volume yang sangat rendah (1-2 mikroliter) ke alas, tarik ke bawah lengan alas dan satu kali klik
pada tombol ukuran memberikan semua data yang Anda butuhkan dalam kuantifikasi dalam
waktu 5 detik.

Melakukan pengukuran untuk blangko adalah wajib karena ini adalah tetap spektrofotometri
yang sama. Sebelum kita memberikan blangko, tombol perintah ukur tidak akan muncul.
Blangko adalah zat yang sama kecuali tidak mengandung zat dari sampel. Artinya blangko
adalah pelarut asam nukleat. Berikan buffer yang relevan akan ok.

Mikro Volume UV spektrofotometri sangat berguna karena kondisi yang sangat menuntut
situasi penelitian saat ini seperti jumlah sampel yang banyak di mana metode lama akan
menyiksa peneliti. Tentu saja beberapa harga harus dibebankan untuk teknologi tersebut;
harga instrumen dapat dua atau ketiga kalinya spektrofotometer biasa. Namun, saya yakin itu
akan sepadan karena tidak perlu mengeluarkan biaya apapun (misalnya bahan habis pakai)
ketika menjalankan instrumen.

Saya memiliki pengalaman. Pada saat itu, tampaknya ekstraksi asam nukleat telah gagal tanpa
kabut putih sama sekali terlihat pada tabung akhir. Untungnya saya membawa instrumen ini,
dan kemudian saya mengambil sedikit sampel untuk mencari tahu. Hasilnya diketahui bahwa
ada 5 nanogram DNA yang sebenarnya masih mungkin untuk melakukan Polymerase Chain
Reaction (PCR), jadi, ekstraksi asam nukleat tidak gagal.
Saya juga tahu bahwa salah satu lembaga nasional di Indonesia menggunakan real time PCR
untuk mengukur asam nukleat. Itu menggunakan volume mikro yang sama sampel tetapi tidak
menghitung waktu dan biaya reagen. Dapatkah Anda bayangkan berapa lama waktu yang
dibutuhkan untuk teknik PCR ini real time? Ini akan memakan waktu sekitar 1,5 jam proses. Hal
ini menjadi 5400 detik proses terhadap proses 5 detik. Belum lagi biaya reagen yang
dibutuhkan yang akan biaya sekitar USD 40 per sampel sementara volume yang mikro UV
spektrofotometri tidak dikenakan biaya sama sekali.

Mikro Volume UV spektrofotometri digunakan dalam biologi molekuler baru-baru ini teknik
seperti microarray dan DNA sequencing. Konsentrasi dan kemurnian asam nukleat sebagai
masukan dalam teknik tertentu menjadi penting untuk mendapatkan hasil yang dapat
diandalkan