Deteksi Yersinia ruckeri dengan Metode

Polymerase Chain Reaction (PCR)

SNI 8845-1:2019

Balai Uji Standar Karantina Ikan, Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan
(BUSKIPM)
 Pendahuluan

 Standar ini dimaksudkan untuk mencegah penyebaran hama dan penyakit ikan
dengan cara mendeteksi bakteri patogen pada ikan dengan cepat, tepat dan akurat

 Standar ini digunakan untuk mendeteksi Yersinia ruckeri secara kualitatif dengan
cepat dan akurat

 PCR merupakan metode yang memiliki sensitivitas yang lebih tinggi dibandingkan
dengan metode konvensional biokimia
Prinsip

Prinsip dari metode ini adalah mendeteksi Yersinia ruckeri baik dari organ target
langsung maupun isolat bakteri hasil pengayaan diawali dengan ekstraksi DNA,
kemudian diperbanyak secara enzimatik berdasarkan perubahan suhu
(amplifikasi) menggunakan thermal cycler. Setelah amplifikasi, produk PCR
dipisahkan dengan elektroforesis dan divisualisasikan.
 Yersinia ruckeri
 Bakteri gram negatif, batang, motil, fakultatif anaerob
 Bakteri patogen pada ikan salmonid dan non salmonid
 Penyebab penyakit Enteric Red Mouth (ERM)/Yersiniosis
 Kepmen No.17 Tahun 2021, Penyakit ikan karantina golongan II
 Y. ruckeri meiliki kisaran inang yang luas
 Yersinia ruckeri
 Tahun 1958, Yersinia ruckeri pertama kali dilaporkan menginfeksi ikan rainbow trout
(Onchorhynchus mykiss) di Idaho, AS dan menjadi endemic di Amerika utara
 Tahun 1981, ditemukan di Eropa ( Perancis, German dan Inggris)
 Patogen diisolasi dari beberapa ikan lain di Kanada, Eropa, Amerika Selatan, Timur Tengah, Cina,
India dan Australia
 Y. ruckeri diisolasi dari hewan selain ikan antara lain muskrat (Ondatra zibethicus), alap alap (Falco
spp), Camar (Laridae), Penyu (Cheloniidae) dan manusia
 Cabi (2020),Y. ruckeri sudah menyebar di benua Afika (Afrika utara), benua Asia ( Iran, Turki),
Benua Eropa (Krasia, Cekosslovakia, Yugoslavia, Denmark, Finlandia, Perancis, German, Hungaria,
Italia, Norwegia, Polandia, Portugis, Spanyol, Inggris), Amerika utara (Canada, Alaska, Arkansas,
Colorado, Idaho, Montana), Australia dan Amerika Selatan (Chile, Peru)
 Media Pembawa
Kepmen No.17 Tahun 2021

• Atlantic salmon (Salmo solar)

• Perch (Perca fluviatilis)
• Brook trout (Salvelinus fontinalis)
• Rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)
• Chanel catfish (Ictalurus punctatus)
• Salmon (Salmonidae)
• Chinook salmon (Oncorhynchus • Sea bass (Lates calcarifer)
tshawytscha)
• Common carp (Cyprinus carpio)
• Sole (Solea solea)
• Sturgeon (Acipenser baeri)
• Eel (Anguilla Anguilla)
• Tilapias (Oreochromis niloticus)
• Gold fish (Carassius auratus)
• Turbot (Scopthalmus maximus)
• Jelawat (Leptobarbus hoevenii)
• Walking catfish (Clarias batracus)
Gejala Klinis

• Exopthalmia
• Penggelapan kulit (A)
• Ascites (A)
• Hemoragic di rongga mulut, operculum, rahang (B)
• Necrosis pada hati, ginjal dan limpa
• Pembengkakan pada ginjal dan limpa (C)
Pengujian Yersinia ruckeri
Biokimia

Loop Mediated isothermal amplification (LAMP)

Histopatologi

Real time PCR

PCR konvensional
PCR (Polymerase Chain Reaction)
 Tehnik mengamplifikasi sekuen DNA spesifik menjadi jutaan kopi sekuen DNA
 Prinsip kerja :
Denaturasi, tahapan pertama dengan pemanasan sampai suhu 94–96°C.
Panas mempengaruhi DNA akan terpisah menjadi untai tunggal DNA
Annealing, untuk primer menempel pada templat untai tunggal DNA dan berikatan
pada daerah komplementer pada sekuen single-stranded DNA.
Extensi, tergantung dengan enzim polimerase DNA yang digunakan. Taq polimerase
memiliki suhu aktivitas optimum pada 75-80°C dan umumnya suhu 72°C.
Pada tahapan ini, enzim polimerase atau Taq polimerase melakukan
pemanjangan membentuk sekuen DNA baru.
 Visualisasi dengan elektroforesis
 Bahan
• Agarose
• Akuades steril
• Bufer tris acetic EDTA (TAE) 1x
• Etanol absolut
• Kit komersial ekstraksi DNA
• Kit komersial PCR
• Kontrol positif Yersinia ruckeri
• Larutan pembersih RNase
• Tabung mikro ukuran 0,2 mL, 1,5 mL, 2 mL
• Marker 100 bp
• Mikrotip ukuran 10µL – 1.000 µL
• Nuclease free water (NFW)
• Penggerus jaringan (pellet pastle)
• Pewarna gel
• Pipet mikroberbagai ukuran
• Sarung tangan
• Tryptic soy broth (TSB)
• Primer spesifik

YER 8 5’- GCGAGGAGGAAGGGTTAAGTG-3 575 bp Gibelo A.,et al (1999)

YER 10 5’-GAAGGCAAGGCATCTCTG-3
Prosedur
Timbang 25 mg dan potong Lakukan homogenisasi (organ + PBS 1
menggunakan gunting : 9) dan ambil 1 ml di media TSB

Inkubasi suhu 28 °C selama 16-18

Ekstraksi DNA sesuai protokol kit jam
ekstraksi DNA

Ekstraksi DNA

Amplifikasi contoh uji DNA, kontrol

negatif, dan kontrol positif Yersinia Elektroforesis dan visualisasi
ruckeri dalam mesin PCR (Agarose 1,5-2% dan TAE buffer 1x)
Jenis, Jumlah dan Perlakuan contoh uji

Contoh uji Organ target Jumlah/ Perlakuan Perlakuan

Volume Ekstraksi pengayaan
Larva Seluruh tubuh 50-100 mg 25 mg 1 : 9 (w/v) dalam
PBS
Ikan berukuran 2-5 cm Organ Internal 50-100 mg 25 mg 1 : 9 (w/v) dalam
PBS
Ikan berukuran >5 cm Ginjal, Hati, 50-100 mg 25 mg 1 : 9 (w/v) dalam
Mulut PBS
Persiapan contoh uji dan Pengayaan bakteri

1. Ambil contoh uji

2. Lakukan homogenisasi sesuai contoh uji
3. Ambil 1 mL hasil homogenisasi dan masukkan ke media TSB 5 mL
4. Inkubasi pada suhu 28˚C selama 16-18 Jam
5. Ambil 1 mL suspensi bakteri untuk diektraksi
6. Untuk organ target/jaringan bisa langsung dilakukan ekstraksi
Catatan : Organ/jaringan jika tidak segera diekstraksi harus difiksasi dengan
alkohol 70%
Ekstraksi DNA dari jaringan dengan metode spin column

1. Timbang jaringan sebanyak 25 gr

2. Tambahkan 180 µL buffer ATL dan homogenkan dengan pastle
3. Tambahkan 20 µL proteinase K, vortex
4. Inkubasi pada suhu 56˚C sampai jaringan lisis dan homogenkan suspensi
selama proses inkubasi
5. Homogenkan suspensi selama 15 detik, Tambahkan 200 µL buffer AL,
homogenkan menggunakan minimixer/vortex. Inkubasi pada 56˚C selama 10
menit
6. Tambahkan 200 µL etanol absolut, homogenkan
 Lanjutan…..
7. Pipet campuran ke dalam tabung mini spin column 2 mL, sentrifugasi pada 6.000 x g selama
1 menit. Buang tabung koleksi yang berisi cairan
8. Tempatkan spin column pada tabung koleksi, tambahkan 500 mL buffer AW1. sentrifugasi
selama 1 menit pada 6000 x g, buang tabung koleksi
9. Tempatkan spin column pada tabung koleksi, tambahkan 500 mL buffer AW2. sentrifugasi
selama 3 menit pada 20.000 x g, buang tabung koleksi
10. Pindahkan spin column ke tabung mikrosentrifuse ukuran 1,5 mL atau 2 mL
11. Elusi DNA dengan menambahkan 100 µL buffer AE, inkubasi selama 1 menit pada suhu 15-
25ºC. Sentrifugasi pada 6000 x g selama 1 menit
12. Ulangi langkah 11, DNA dapat dilanjutkan proses amplifikasi atau disimpan pada suhu -20ºC
Ekstraksi DNA bakteri dengan pemanasan

1. Masukkan 1 mL kultur bakteri ke dalam tabung mikro 2 mL, sentifugasi pada 13.000 x g selama 5
menit
2. Buang supernatant, tambahkan 200 µL NFW atau lisis buffer dan homogenkan
3. Letakkan tabung mikro dalam heating block dan panaskan contoh uji pada suhu 100 ºC selama
10 menit
4. Pindahkan contoh uji dan dinginkan di suhu ruang (25ºC) selama 2 menit
5. Sentrifugasi suspense dengan kecepatan 10.000 x g selama 5 menit
6. Ambil supernatan sebanyak 100 µL dan simpan pada suhu -20ºC sampai digunakan
Catatan : Prosedur ekstraksi DNA disesuaikan dengan kit komersial yang digunakan
Komposisi bahan koktail amplifikasi

Komposisi Volume (µL) Konsentrasi Akhir

Master mix 2x 12,5 1x
Primer YER 8 (10 µM) 1 200 nM
Primer YER 10 (10 µM) 1 200 nM
NFW 6,5
Template (DNA, control 4 20 ng-100 ng
positif, control negative)
Total 25
 Amplifikasi

1. Selalu gunakan kontrol positif maupun kontrol negatif

2. Siapkan reaksi amplikasi
3. Campur semua bahan kecuali template lalu bagikan ke dalam tabung mikro 0,2 mL
dengan volume masing masing 21 µL
4. Tambahkan template atau contoh uji DNA termasuk kontrol positif dan kontrol negative
pada masing masing tabung mikro sebanyak 4 µL
5.Homogenkan dan spin down kemudian masukkan ke mesin PCR
Catatan :
Proses penambahan master mix harus dalam kondisi dingin dan bebas dari kontaminan
Pengaturan suhu, waktu dan siklus amplifikasi

Proses Suhu (ºC) Waktu Siklus

Denaturasi 94 30 detik
Annealing 60 30 detik 25
Ekstensi 72 60 detik
Ekstensi akhir 72 2 menit 1
Hold 4 ∞
 Elektroforesis

1. Letakkan gel yang sudah dicetak diatas chamber elektroforesis

2. Isi chamber dengan larutan TAE 1X sebanyak 500 mL (sampel gel terendam)
3. Tambahkan 2 µL loading dye 6x ke dalam 10 µL produk PCR, campur dengan baik
Catatan : untuk kit komersial master mix yang telah mengandung loading dye, maka
langkah no.3 tidak perlu dilakukan
4. Masukkan 5 µL marker atau penanda DNA, masukkan produk PCR yang sudah tercampur
dengan loading dye dengan mikropipet ke dalam sumur (well) gel sebanyak 8 µL-10 µL
5. Pasang tutup elektroforesis dan alirkan listrik dengan voltase 100-150 V selama 30 menit
atau setelah pewarna bromphenol blue mencapai 2/3 bagian panjang gel agarose
6. Amati gel menggunakan UV transilluminator (gel doc) dan dokumentasikan
 Interpretasi Hasil

Kode Ukuran Pita Interpretasi

Contoh uji positif 575 bp Reaksi berjalan baik
Contoh uji negatif Tidak ada pita Tidak terdeteksi Y.
ruckeri
Kontrol negatif (NFW) Tidak ada pita 575 bp Tidak ada kontaminasi

Kontrol positif (DNA Yersinia 575 bp Terdeteksi Y. ruckeri

ruckeri)
Jaminan mutu

 Hasil ekstraksi DNA mempunyai rasio A260/A280 berkisar 1,8-2,0

 Proses amplifikasi dijamin kualitasnya dengan menyertakan kontrol positif

dan kontrol negatif menunjukkan hasil yang konsisten
Hasil elektroforesis contoh uji

Keterangan gambar :
Baris 1 : contoh uji positif Yersinia ruckeri
Baris 2 : contoh uji negatif Yersinia ruckeri
Baris 3 : kontrol negatif Yersinia ruckeri
Baris 4 : kontrol positif Yersinia ruckeri
Baris M : marker 100 bp
Trouble shooting
No Masalah Penyebab Solusi
1 Tidak ada pita Mesin PCR tidak Lakukan pengujian ulang dengan reagen, primer dan
DNA di gel berfungsi dengan baik control positif yang terbukti bekerja dengan baik
agarose
Konsentrasi DNA Ukur konsentrasi DNA (rekomendasi 10-100 ng/µL
terlalu rendah/tinggi
Kualitas DNA tidak baik Lakukan purifikasi DNA atau ekstrasi ulang dengan kit
atau mengandung yang berbeda
inhibitor
Konsentrasi primer Pastikan konsentrasi primer di kisaran yang
terlalu rendah direkomendasikan dan konsentrasi kedua primer PCR
sama
Suhu anneling terlalu Lakukan gradien suhu anneling
tinggi
No Masalah Penyebab Solusi
Suhu denaturasi Naikkan suhu denaturasi atau durasi denaturasi awal
kurang optimal
Waktu ekstensi terlalu Durasi ekstensi ditambah karena sangat penting
pendek untuk PCR dengan pasang basa panjang
Reagen tidak Encerkan dan campur semua reagen sampai
diencerkan dengan homogen sebelum menyiapkan mix PCR
benar
Suhu mesin PCR tidak Lakukan perbaikan/ kalibrasi atau gunakan mesin
tepat PCR yang lain
2. Smear pada pita Template DNA terlalu Rekomendasi (10-100 ng/µL)
DNA banyak
Siklus amplifikasi Lakukan pengurangan siklus amplifikasi dibawah 35
terlalu panjang
No Masalah Penyebab Solusi
Konsentrasi primer Rekomendasi 0,2-0,4 mM/25µL master mix
terlalu tinggi
Suhu anneling terlalu Naikkan suhu /lakukan gradien suhu amplifikasi
rendah
Waktu ekstensi terlalu Lakukan pengurangan waktu ekstensi
panjang
Kualitas DNA tidak baik Lakukan purifikasi DNA atau ekstrasi ulang dengan kit
atau mengandung yang berbeda
inhibitor
Terlalu banyak Lakukan elektroforesis ulang dengan mengurangi
memasukkan DNA ke volume DNA yang dimasukkan
sumur gel agarosa
Master mix sensitive Larutkan template DNA dengan NFW atau elution
terhadap EDTA buffer
No Masalah Penyebab Solusi
3. Terbentuk non Templat DNA yang Optimasi volume (rekomendasi 10-100 ng/µL
spesifik DNA dimasukkan terlalu
banyak
Konsentrasi primer Rekomendasi 0,2-0,4 mM/25µL master mix
terlalu tinggi
Suhu mesin PCR tidak Lakukan perbaikan/ kalibrasi atau gunakan mesin
tepat PCR yang lain
4. Primer dimers Konsentrasi primer Rekomendasi 0,2-0,4 mM/25µL master mix
terlalu tinggi
5. Terbentuk pita DNA Kontaminasi Lakukan pengulangan pengujian, dekontaminasi
positif pada blanko mikropipet dan ruangan
contoh uji atau
kontrol negatif