PROJECT BIOTEKNOLOGI

Identifikasi Spesies Tanaman Lamtoro (Leucaena

leucocephala) Menggunakan Marker Sekuens ITS
Kelompok 9
1. Shergi Sahrum (2010212061)
2. Novri Hamdani (2010213031)
3. Erina Nurul Hasnah Lubis (2110211008)
4. Andika Ade Saputra (2110212016)
5. Farid Yundrizal (2110212041)

Dosen : Prof. Dr. Sc. Agr. Ir. Jamsari MP

 PENDAHULUAN
Latar
Belakang
Lamtoro merupakan tanaman legum pohon serbaguna berasal dari Amerika
tengah dan Meksiko sudah tidak asing lagi bagi masyarakat pelindung untuk
tanaman komersial sebagian masyarakat memanfaatkan buah dan daun
muda dan untuk sayur. daunnya dipergunakan sebagai pakan ternak dan
batangnya dimanfaatkan sebagai ramuan rumah dan kayu bakar lemper
mempunyai sistem perakaran yang dalam dan berujung panjang sehingga
sangat cocok digunakan (Dilaga et al., 2021).
 Kelebihan dan Kekurangan

• Lebih Akurat.
• Setiap organisme memiliki urutan sekuens yang
berbeda.
Marker Sekuens ITS
• Lebih cepat.
• Alat dan bahan yang dibutuhkan lebih mahal, dan
butuh keterampilan.

Latar Belakang
Perkembangan teknologi, pada Pengambilan Sampel
awalnya identifikasi suatu organisme Tahapan
dilakukan dengan morfologi. Namun, Isolasi DNA
berkembang ke arah penanda
molekuler menggunakan data DNA. Kontrol Kualitas dan Kuantitas DNA

PCR

Sekuensing DNA
 TUJUAN PRAKTIKUM
Untuk mengidentifikasi spesies tanaman Lamtoro
(Leucaena leucocephala) menggunakan Marker Sekuens
ITS.
 Isolasi DNA
Prinsip Isolasi DNA
merupakan proses yang dilakukan untuk
mengeluarkan DNA dari tempatnya berada
Lysis
untuk keperluan identifikasi suatu spesies
berdasarkan data sekuens DNA. Meniran
penting dilakukan isolasi DNA untuk melihat Deproteinase K
atau mengidentifikasi tanaman meniran
terutama manfaatnya melalui data sekuen Presipitasi DNA
meniran, dimana salah satu langkahnya adalah
isolasi DNA.
 ALAT DAN BAHAN
ALAT

8. Stander eppendorf tabung

1. Mortar dan pistil 9. Timbangan digital
2. Spatula 10. Vortex
3. Waterbath 11. Bak Elektrophoresis
4. Pipet 10-200 12. Power supply
5. Pipet 100-1000 13. Comp 8 Slot
6. Centrifuge maks 13.000rpm 14. Penghambat Gel
7. Chemical hood 15. Perangkat Dokumentasi
16. Pipet mikro 2-10
 ALAT DAN BAHAN
BAHAN

1. Digestion solution 7. Wash buffer II

2. Proteinase K solution 8. Elution buffer
3. RNAse A solution 9. Daun Lamtoro
4. Lysis solution 10. Ethidium bromida
5. Purification column 11. Ethanol 50%
6. Wash buffer I
PROSEDUR KERJA
 Isolasi Daun Tumbuhan

• Disiapkan jaringan segar sebanyak 1 gr

• Digerus menggunakan mortar hingga berbentuk bubuk

• Masukkan jaringan yang sudah digerus sebanyak 0,25 gr ke dalam

tabung eppendrof 2 ml
 Deproteinase Molekul DNA

• Ditambahkan Digestion Solution 180 µl dan

Proteinase K Solution 20 µl

• Divortex selama 10 s

• Diinkubasi selama 1 jam pada suhu 65 °C, setiap

10 menit divortex selama 10 s
 Deproteinase Molekul DNA

• Ditambahkan 20 µl RNAse A Solution

• Divortex selama 10 s dan diinkubasi di suhu ruang

selama 10 menit

• Ditambahkan 200 µl Lysis Solution, lalu divortex

selama 15 s supaya larutan menjadi homogen
 Pemanenan DNA

• Disentrifugasi selama 3 menit dengan kecepatan 8.000 rpm

• Transfer supernatan ke dalam tabung eppendorf 1,5 ml yang baru dan

steril, pastikan residu hasil gerusan tidak ikut terbawa

• Ditambahkan 400 µl Ethanol 50% dingin, kemudian larutan

dihomogenkan dengan inversi tabung bolak balik
 Pemanenan DNA

• Transfer larutan ke dalam Purification Column yang telah disisipkan

pada Collection Tube nya

• Dilakukan sentrifugsi selama 2 menit dengan kecepatan 8.000 rpm

• Larutan pada Collection Tube dibuang pada wadah penampung di

lemari asam
 Pemanenan DNA

• Ditambahkan Wash Buffer I 500 µl ke dalam Purification Column

• Disentrifugasi pada kecepatan 8.000 rpm selama 2 menit dan

larutan yang berada di bawah dibuang pada wadah di lemari asam

• Ditambahkan Wash Buffer II 500 µl ke dalam Purification Column

dan disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 3 menit.
 Pemanenan DNA

• Dilakukan sentrifugasi tambahan pada kecepatan 10.000 rpm selama

1 menit agar tidak ada residu alcohol yang tersisa pada filter

• Dipindahkan ke tabung Eppendorf 1,5 ml yang baru dan steril

• Ditambahkan 50 µl Elution Buffer tepat di tengah Purification Column dan

diinkubasi pada suhu ruang selama 2 menit
 Pemanenan DNA

• Disentrifugasi lagi pada kecepatan 10.000 rpm selama

1 menit dan didapatkan DNAnya
KONTROL KUALITAS DAN KUANTITAS DNA

a. Elektrophoresis (kualitas DNA)

Teknik elektroporesis adalah salah satu teknik pemisahan

molekul dengan menggunakan arus listrik berdasarkan
perbedaan berat/besar molekul. Prinsip dasar pemisahan
molekul diamati dari derjat perpindahan/migrasi yang
disebabkan oleh adanya perbedaan berat molekulnya.
PROSEDUR KERJA
 Pembuatan Gel Agarose

• Ditimbang 0,75 gr agarose dan 100ml 0,5 TBE kemudian masak dengan
microwave selama 2 menit dengan botol dalam keadaan longgar

• Dipasang tray gel casting, comb dan penghambat gel agak tidak keluar.

• Setelah itu agar yang telah larut dimasukkan 5 µl EB (Ethidium Bromide) dan
aduk sampai merata
• Larutan dituang ke dalam gel tray dan ditekan-tekan untuk
menghilangkan gelembung dan tunggu hingga agarose
menjadi padat selama 15 - 20 menit
 Elektrophoresis

• Disiapkan DNA sampel dalam volume 10 µl yang terdiri dari campuran 2 µl

DNA, 1 µl 10x BPB dan 7 µl 1xTE dan lakukan juga untuk standar lamda DNA

• Loading sampel DNA dan standard lambda DNA pada well paling kiri
menggunakan pipet

• Setting power supply menggunakan tegangan 100 volt selama 30 menit

• Setelah selesai, ambil gel kemudian letakkan di atas UV Transiluminator

• Dilakukan setting posisi gel agar seluruh sampel bisa terlihat semua.

• Hidupkan UV-Transiluminator dan lakukan pengambilan foto dengan

kamera sistem yang sudah terinstal. Simpan data dalam bentuk digital

• Lakukan analisis kualitatif dan kuantitatif dengan membandingkannya

dengan kontrol lambda DNA yang digunakan.
KONTROL KUALITAS DAN KUANTITAS DNA

b. Biodrop (kuantitas DNA)

Kuantifikasi DNA genom dilakukan melalui pengukuran

dengan Biodrop UV-Vis Spectrophotometer. Konsentrasi
DNA diukur dalam satuan ng/µl. Sementara tingkat
kemurnian DNA diukur pada rasio absorbansi terhadap
panjang gelombang 260/280 nm dan 260/230 nm.
• Mesin Biodrop UV-Vis Spectrophotometer dinyalan dan di setting detector 0,5
mm µlite dan pilih satuan konsentrasi ng/µl

• Diatur kode sampel dan aktifkan fungsi penyimpanan internal. Detector

dibersihkan dengan tissue kimwipes lalu lakukan blanking

• Dipipet 1 µl sampel DNA yang mau diketahui konsentrasinya dan letakkan ujung
tip putih tepat diantara kawat detector pada biodrop.

• Didapatkan angka pengukuran DNA.

HASIL
Hasil dari Isolasi DNA
Isolasi DNA menggunakan Kit GeneJet
Genomic DNA Purification dengan 2 ulangan

Pita DNA tidak

didapatkan

Keterangan :
M = Lamda DNA
ITS 1 = sampel 1
ITS 2 = sampel 2
 Hasil dari Biodrop

ITS 1 ITS 2
 Kesimpulan
Dari praktikum yang telah dilaksanakan didapatkan
hasil bahwa pita DNA tidak terlihat. Hal ini bisa terjadi
karena ada kesalahan pada saat melakukan praktikum.
Misal, .....
THANK YOU