DNA TUMBUHAN

Oleh :

Kelas D3
Kelompok 4

Aisyah Khairunnisa 081611433079

Rizki Wahyu Anggreini 081611433081
Tasya Rahmania L. 081611433086
Afifatur Rosidah 081611433087
Miftakhur Rosidah 081611433091
DNA TUMBUHAN

ISOLASI DNA

PCR DAN PENGUKURAN KADAR

ELEKTROFORESIS DNA
 GENETIKA MOLEKULER
ISOLASI DNA TUMBUHAN

ISOLASI DNA TUMBUHAN

Bagian 2
Tujuan :
Mengajarkan dan melatih mahasiswa untuk dapat
mengisolasi DNA Tumbuhan dengan menggunakan
modifikasi metode Porebski et al, 1997
 GENETIKA MOLEKULER
ISOLASI DNA TUMBUHAN

Bahan dan Alat

Bahan Alat
 Daun tumbuhan muda
 Mortar dan pestle (cawan dan
 Buffer ekstraksi terdiri atas (100 mM Tris;
1,4M NaCl; 20 mM EDTA; 2% CTAB; 0,3% β- penggerus) digunakan untuk
merkaptoethanol; pH 8) menghaluskan daun
 5M NaCl
 Mikropipet dan tip dengan berbagai
 Chloroform : Isoamil alcohol (CI) dengan
perbandingan volume 24 : 1 ukuran

 Buffer TE terdiri atas : 10mM Tris-HCl;  Tube ukuran 15 mL dan 1,5 mL

1mM EDTA; pH 8,4
 Buffer PCR terdiri atas : 100mM Tris HCl;  Sendok besi
100mM KCl; pH 8,3
 Sentrifuge

Catatan :  Vorteks

Larutan dibuat fresh ketika akan digunakan

 GENETIKA MOLEKULER
ISOLASI DNA TUMBUHAN

Cara Kerja
 Ekstraksi DNA
1. Menyediakan 0,25 gram daun tumbuhan yang masih muda
2. Membekukan daun yang akan digunakan untuk isolasi DNA, jika
menggunakan nitrogen cair daun segar dapat langsung
dibekukan dan jika menggunakan freezer makan daun harus
dibekukan selama semalam
3. Sampel daun yang telah dibekukan kemudian digerus hingga
halus dengan penambahan buffer ekstraksi
4. Sampel yang telah halus dimasukkan kedalam tube ukuran 15
mL yang berisi 2,5 mL buffer ekstraksi hangat (60°C)
5. Sampel kemudian diinkubasi pada suhu 60°C selama 60 menit
dengan sesekali dibolak balik
6. Setelah diinkubasi pada suhu 60°C kemudian sampel
didinginkan pada suhu ruang selama 5 sampai 10 menit
7. Selanjutnya sampel ditambahkan 3mL CI 24:1 dan dibolak balik
secara perlahan
 GENETIKA MOLEKULER
ISOLASI DNA TUMBUHAN

Cara Kerja
8. Sampel kemudian disentrifus dengan kecepatan 3000 RPM
selama 20 menit
9. Mengambil bagian atas sampel yang telah disentrifus dan
memindahkan pada tube berukuran 15 mL.

Perlakuan nomor 7-9 dapat diulang untuk memaksimalkan

jumlah DNA yang terkoleksi.

10. Manambahkan 0,5X volume 5M NaCl pada sampel yang berhasil

terekstraksi kemudian di vortex
11. Menambahkan 2X volume ethanol 95% dingin kemudian dibolak
balik secara perlahan. Amati terbentuknya benang putih DNA.
12. Menyimpan sampel dalam suhu -20°C selama 20 menit.
 GENETIKA MOLEKULER
ISOLASI DNA TUMBUHAN

Cara Kerja
 Presipitasi DNA
1. Sentrifus sampel selama 6 menit dengan kecepatan 3000 RPM
2. Membuang supernatant (larutan bagian atas) dengan hati-hati
sehingga endapan tidak ikut terbuang
3. Endapan dicuci dengan ethanol 70% dingin kemudian divorteks
4. Sentrifus sampel selama 2 menit dengan kecepatan 3000RPM
5. Membuang ethanol kemudian mongering anginkan sampel
6. Menambahkan sampel DNA dengan 300µL Buffer TE kemudian
sampel dapat dipindahkan ke dalam tube 1,5mL.
7. Sampel selanjutnya disimpan dalam freezer 4°C atau -20°C
untuk dilakukan proses selanjutnya.
 GENETIKA MOLEKULER
ISOLASI DNA TUMBUHAN

Hasil Isolasi DNA

Tumbuhan

Hasil yang didapatkan dalam

praktikum isolasi DNA tumbuhan
berupa benang putih DNA. Yang
kemudian akan disimpan dengan
menggunakan penambahan
Buffer TE dan disimpan pada
freezer hingga dilakukan proses
selanjutnya.
 GENETIKA MOLEKULER
ISOLASI DNA TUMBUHAN

KESIMPULAN
Isolasi DNA tumbuhan dengan metode modifikasi Porebski et
al, 1997 merupakan metode modifikasi CTAB. Modifikasi
ini memfokuskan penggunaan garam NaCl konsentrasi tinggi
sebesar 5M.
GENETIKA MOLEKULER
PENGUKURAN KADAR

Pengukuran Kadar DNA

Tujuan :
Mengajarkan dan melatih mahasiswa untuk dapat
melakukan pengukuran kadar DNA tumbuhan
 GENETIKA MOLEKULER
PENGUKURAN KADAR

Cara Kerja
Pengukuran kadar DNA
1. Melakukan setting pada program SkanIt yang terhubung
dengan Thermo Scientific Multiskan Go
2. Memasukkan 2µL sampel DNA dan buffer TE aquades
sebagai arutan blanko pada masing-masing well dalam
µDrop™ plate sesuai dengan program yang di setting
3. Menutup µDrop™ plate dengan penutupnya, lalu
dimasukkan dalam ke alat Thermo Scientific Multiskan
Go dan dibaca absorbansinya pada λ260 nm dan λ280nm
4. Konsentrasi DNA dihitung dengan rumus
(DNA) = A260 x 50 x 10/0,5
5. Kemurnian sampel DNA dilakukan dengan
membandingkan nilai absorbansi pada λ260/λ280
 GENETIKA MOLEKULER
PENGUKURAN KADAR

Sampel : Daun Ginseng

Nilai absorbansi
- DNA
Λ260nm = 0,443
Λ280nm = 0,224
- Blanko
Thermo Scientific Multiskan Go Λ260nm = 0,232
Λ280nm = 0,160

Perhitungan kadar DNA

(DNA) = A260 x 50 x 10/0,5
= (0,443-0,232) x 50 x 20
= 211

Perhitungan kemurnian DNA

Kemurnian = λ260/λ280
= (0,443-0,232)/(0,224-0,160)
= 3,296
 GENETIKA MOLEKULER
PENGUKURAN KADAR

KESIMPULAN
Penentuan kadar DNA digunakan untuk mengetahui kadar
dan kemurnian DNA hasil isolasi. Alat yang digunakan yaitu
Thermo Scientific Multiskan Go dengan panjang gelombang
λ260 nm dan λ280nm. Rasio kemurnian DNA yang baik
bernilai 1,8-2,0. Bila nilai ada di bawah atau di atas rasio
tersebut dapat dinyatakan DNA terkontaminasi. Hasil yang
didapat kelompok (D3-4) memiliki nilai 3,29 yang artinya
DNA isolasi sangat terkontaminasi. Hal ini dapat disebabkan
oleh banyak faktor, salah satunya kurang sterilnya alat dan
proses pengerjaan.
GENETIKA MOLEKULER
PCR

Polimerase Chain Reaction

(PCR)
Tujuan :
Mengajarkan dan melatih mahasiswa untuk dapat
melakukan amplifikasi DNA
 GENETIKA MOLEKULER
PCR

Cara Kerja
PCR
1. Sebelum preparasi PCR, terlebih dahulu dilakukan
setting program PCR. Program PCR yang digunakan
dalam suatu siklus adalah pre-denaturasi pada
suhu 92°C selama 2 menit, denaturasi pada suhu
92°C selama 30 detik, annealing pada suhu 55°C
selama 45 detik. Ekstension pada suhu 72°C
selama 1 menit, pada post ekstension pada suhu
72°C selama 7 menit. Siklus dilakukan sebanyak 35
kali.
2. Setelah program PCR selesai, PCR tube disiapkan
dan diberi label,
 GENETIKA MOLEKULER
PCR

Cara Kerja
PCR
3. Ditambahkan 12,5µL PCR mix, 1µL primer
forward/ COIe-F (10µL M), 1µL primer reverse/
CoIe-R (10µL M), 1 µL DNA template dengan
konsentrasi 1000µg/ml, dan 9,5µL free nuclease
water. PCR mix merupakan campuran PCR buffer,
dNTPs, MgCl2, dan taq polymerase. Campuran
bahan tersebut di mix gentle kemudian di
spindown dan dimasukkan ke dalam PCR
Thermocycler dan dimulai programnya.
4. Hasil PCR divisualisasi dengan elektroforesis gel
agarose.
 GENETIKA MOLEKULER
PCR

PCR Thermocycler

Hasil PCR yang akan

dilanjutkan proses
elektroforesis gel
agarose
GENETIKA MOLEKULER
PCR

KESIMPULAN
Amplifikasi DNA tumbuhan dapat menggunakan
metode polymerase chain reaction (PCR). Analisis PCR
berguna untuk memperbanyak jumlah sekuens DNA.
Komponen dalam PCR antara lain enzim Taq
polimerae, dNTPs, primer, buffer. Dalam metode ini
terdiri dari beberapa tahapan pre-denaturasi,
denaturasi, annealing, ekstension, dan post-
ekstension.
GENETIKA MOLEKULER
ELEKTROFORESIS DNA
GENETIKA MOLEKULER
ELEKTROFORESIS DNA
GENETIKA MOLEKULER
ELEKTROFORESIS DNA
GENETIKA MOLEKULER
ELEKTROFORESIS DNA
GENETIKA MOLEKULER
ELEKTROFORESIS DNA